BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


ĐẶNG THỊ HIỀN
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME PROTEASE
TRONG QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN-
CHITOSAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

CHUYÊN NGÀNH:
CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
MÃ SỐ: 60.54.10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRANG SĨ TRUNG

NHA TRANG - 2008
LỜI CẢM ƠN

i
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TÔM VÀ CÁC HƯỚNG TẬN DỤNG 3
1.1.1. Phế liệu tôm 3
1.1.2. Thành phần hóa học của phế liệu tôm 4
1.1.3. Các hướng tận dụng phế liệu tôm 5
1.2. CÁC SẢN PHẨM CÓ GIÁ TRỊ TỪ PHẾ LIỆU TÔM 6
1.2.1. CHITIN, CHITOSAN 6
1.2.1.1. Giới thiệu chung về chitin, chitosan 6
1.2.1.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và

3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp để chiết astaxanthin 66
3.3.3. Xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp để chiết astaxanthin 67
3.3.4. Tối ưu hóa quá trình chiết astaxanthin 68
3.4. Đề xuất qui trình ứng dụng enzyme protease trong công nghệ sản xuất
chitin 73
3.5. Đánh giá sơ bộ hiệu quả quy trình sử dụng enzyme so với phương pháp
hóa học 76
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 80
TÀI LIỆU THAM KHẢO
iii
DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu
viết tắt
Diễn giải
AU Đơn vị hoạt độ enzyme thủy phân protein
DH Độ thủy phân
DA Độ deacetyl hóa
ES Phức hợp enzyme-cơ chất
E/S Tỷ lệ enzyme/cơ chất
N
TS
Nitơ tổng số
PE Petroleum ether

phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003)
15
1.4 Chỉ tiêu chất lượng của Chitosan sản xuất từ vỏ ghẹ (Trần Thị
Luyến, 2004).
16
1.5 Chỉ tiêu chất lượng của Chitosan sản xuất từ vỏ tôm Mũ ni
(Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, 2002).
17
1.6 Một số chỉ tiêu chất lượng của Chitosan sản xuất theo quy trình
Papain (Trần Thị Luyến, 2003)
20
2.1 Tiêu chuẩn màu sắc cho bột carotenoprotein do Thái Lan sản
xuất
48
2.2 Tiêu chuẩn mùi cho bột carotenoprotein do Thái Lan sản xuất 48
3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Thẻ chân trắng 51
3.2 Sự biến đổi trạng thái cảm quan của các mẫu theo thời gian 57
3.3 Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thí nghiệm 60
3.4 Ma trận trực giao cấp hai, ba yếu tố 61
3.5 Bảng kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy 62
3.6 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân phế liệu tôm bằng
enzyme
63
3.7 Mức thí nghiệm của các yếu tố 68
3.8 Ma trận trực giao cấp hai, ba yếu tố 69
3.9
Bảng kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy
70
3.10
Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết astaxanthin

Thu hồi các sản phẩm từ 100 kg đầu vỏ tôm
79

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Nội dung Trang

1.1 Sơ đồ ứng dụng của phế liệu tôm 5
1.2 Công thức cấu tạo của chitin 6
1.3 Công thức cấu tạo của chitosan 7
1.4 Quy trình của Stevens 8
1.5 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman 9
1.6 Quy trình thủy nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản) 10
1.7 Quy trình sản xuất của Pháp 11
1.8 Quy trình sản xuất của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản 12
1.9 Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp Thủy sản Hà Nội 13
1.10 Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện
khoa học Việt Nam
14
1.11 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học
với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003)
15
1.12 Quy trình công nghệ sản xuất chitosan từ vỏ ghẹ (Trần Thị Luyến,
2004)
16
1.13 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm Mũ ni (Huỳnh Nguyễn Duy
Bảo, 2002)
17

67

1
MỞ ĐẦU
Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đã phát triển mạnh trong những năm gần
đây và trở thành ngành kinh tế quan trọng, tạo công ăn việc làm, tăng thu nhập cho
hàng triệu người dân ven biển và tạo nguồn thu ngoại tệ đáng kể cho đất nước. Theo
thống kê của Tổng cục Hải quan, năm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đã qua
mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng gần 600 triệu USD so với năm 2005, trong đó mặt
hàng tôm truyền thống chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ USD, chiếm 44,3% tổng
kim ngạch xuất khẩu. Năm 2007 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt gần 3,8 tỷ USD,
tăng 12% so với năm 2006, xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 40% tổng kim ngạch
xuất khẩu. Cùng với sự gia tăng khối lượng tôm xuất khẩu thì một lượng lớn phế
liệu của ngành chế biến tôm thải ra. Phế liệu này có thể chiếm tới 40÷60% trọng
lượng của tôm nguyên liệu và nó có chứa các thành phần có giá trị như protein,
chitin, astaxanthin. Theo ước tính thành phần của protein trong đầu tôm Thẻ chiếm
khoảng 11% trọng lượng tươi và như thế cứ sản xuất 1 kg chitin thì sẽ thải hồi hơn
2 kg protein. Ngoài ra, còn chứa đáng kể astaxanthin (300mg/kg). Lượng astaxanthin
này có giá trị kinh tế rất cao (khoảng 2.500 USD/kg) được ứng dụng trong nuôi thủy
sản nhằm tạo ra sắc tố đỏ cam trong tôm, cua, cá hồi, cá hồng, cá cảnh,…đồng thời
tăng cường sức đề kháng, nâng cao sức sống và khả năng sinh sản của các loài động
vật này. Astaxanthin cũng có những ứng dụng quan trọng khác trong thực phẩm chức
năng, trong mỹ phẩm và trong công nghiệp thực phẩm.
Chitin và dẫn xuất của nó chitosan được ứng dụng rộng rãi không chỉ trong
công nghiệp thực phẩm mà còn trong công nghiệp dược, mỹ phẩm, xử lý nước thải
và trong nông nghiệp. Nhiều công trình nghiên cứu sản xuất chitin-chitosan trong
và ngoài nước đã và đang thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau. Đa số các
quy trình sản xuất chitin-chitosan dùng kiềm mạnh để khử protein dẫn đến dịch
protein thu được sau quá trình thường thải bỏ do có nồng độ hóa chất cao, gây ô
nhiễm môi trường nghiêm trọng. Hơn nữa, protein bị hạn chế sử dụng do các phản

3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TÔM VÀ CÁC HƯỚNG TẬN DỤNG
1.1.1. Phế liệu tôm
Theo thống kê của Trung tâm Nghiên cứu Chế biến Thủy sản, Đại học Thuỷ
sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính khoảng 45.000 tấn phế liệu,
năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn/năm. Trần Thị Luyến (2004) cho biết trong vỏ
tôm tươi chitosan chiếm khoảng 5% khối lượng, trong vỏ tôm khô khoảng 20-40%
khối lượng. Như vậy hàng năm có thể sản xuất gần 5000 tấn chitosan phục vụ sản
xuất trong nước và xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế cho ngành Thuỷ sản [8].
Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và các mảnh vỏ, ngoài ra còn phải kể đến phần
thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận, một số tôm bị hỏng. Tuỳ theo giống loài,
phương pháp gia công chế biến mà lượng phế liệu có thể lên đến 60% sản lượng
khai thác được. Ví dụ tôm càng xanh, phần đầu tôm chiếm khoảng 60% khối lượng
toàn bộ, với tôm sú thì đầu chiếm khoảng 40% so với khối lượng toàn bộ. Đối với
sản phẩm tôm bóc nõn và rút ruột mất mát theo vỏ và đuôi khoảng 25%.
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tôm từ 30-70%
(Watkin và cộng sự, 1982 [50]. Holanda và Netto (2006) cho rằng phế liệu tôm có
thể chiếm 50-70% so với nguyên liệu [32].
Phần lớn tôm được đưa vào chế biến dưới dạng bóc vỏ, bỏ đầu. Phần đầu
thường chiếm khối lượng 34-45%, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10-15% trọng
lượng của tôm nguyên liệu. Tuy nhiên, tỷ lệ này tuỳ thuộc vào giống loài và giai
đoạn sinh trưởng của chúng [8] [9].

protein (30 – 40%), khoáng (30 – 50%), chitin (13 – 42%) [45].

5
Bảng 1.2. Thành phần (%) đầu và vỏ tôm [17]
Bộ phận Protein thực Chất béo Chitin Tro Canxi Photpho
Đầu 53,5 8,9 11,1 22,6 7,2 1,69
Vỏ 22,8 0,4 27,2 11,7 11,1 3,16

1.1.3. Các hướng tận dụng phế liệu tôm
Phế liệu tôm có thể tận dụng để thu hồi protein, astaxanthin, chitin, chitosan và
enzyme protease. Qua nhiều tài liệu khoa học, có thể tổng kết các lĩnh vực ứng dụng
khác nhau của phế liệu tôm như sau:

Công nghiệp
dư
ợc

Ứng dụng
trong công
nghiệp dược
Bổ
sung
vào
thực
phẩm
Bổ sung
vào
thức ăn
chăn
nuôi
Ứng dụng
trong công
nghiệp thực
phẩm
Ứng dụng
trong công
nghiệp dược
Ứng dụng
trong công
nghiệp sinh
học
Ứng dụng
trong nông

loãng và các dung dịch hữu cơ như este, rượu nhưng nó lại tan được trong dung dịch đặc
nóng của muối trung tính thyoxyanat liti và thyoxyanat calci, tạo thành dung dịch keo.
- Ổn định với chất chống oxy hóa như KMnO
4
, nước javen, NaClO…người ta
lợi dụng tính chất này để sử dụng các chất trên khử màu cho chitin.
- Kết tinh ở dạng tinh thể vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac
và trong thuốc thử Schweizei sapranora. Điều này có thể do nhóm amino acid
(-NHCOCH
3
) ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết.
- Có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884 – 890 cm.
- Là polysaccharite nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao, có tính hòa
hợp sinh học và tự phân hủy trên da.
- Bị enzyme lyozyme – một loại enzyme chỉ có trên cơ thể người, phân giải
7
thành monome N – acetyl – D – Glucosamine.
- Khi đun nóng chitin trong HCl đậm đặc tạo thành 88,5% D-Glucosamin và
21,5% acid acetic.
- Khi đun nóng chitin trong NaOH đậm đặc thì chitin bị mất gốc acetyl tạo
thành chitosan (C
6
H
11
O
4
)n.
Chitosan là dạng N-deacetyl của chitin, khi deacetyl chitin bằng kiềm đặc ta
thu được chitosan, chitosan là một polymer hữa cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn
vị β – D glucosamine liên kết với nhau nhờ cầu nối β – 1,4 glucoside.

SO
4
cho phản ứng lên màu tím.
Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan.
- Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một
polycationic (pH<6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein,
aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm
amino (NH
2
) (Knorr, 1984, Muzzanelli, 1996)[47].
8
- Chitosan có tính kháng nấm, kháng khuẩn cao.
- Trên mỗi mắc xích của phân tử chitosan có ba nhóm chức, các nhóm chức này
có khả năng kết hợp với chất khác tạo ra các dẫn xuất có lợi khác nhau của chitosan
(O-acetylchitosan, N-acetylchitosan, N-phatylchitosan).
- Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ
sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể.
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và
Việt Nam
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hoá ứng dụng của chitosan
đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành công trong
lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp.
Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin - chitosan, với
nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ như:
- Quy trình của Stevens [31]
Cao h
ơn 1%
9
- Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman [9] Hình 1.5. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman
Vỏ tôm Hùm
Ngâm HCl
Rửa trung tính, sấy khô,nghiền mịn
Ngâm HCl

Li tâm
Rửa trung tính
Ngâm NaOH
HCl 2M
T
0
phòng
 = 5
h

w/v = 1/10 Li tâm
Rửa trung tính
Ngâm NaOH
Li tâm
HCl 2M


Rửa trung tính
Rửa sạch bằng li tâm
Làm khô
Chitin dạng bột màu kem
10
Nhận xét: Quy trình này gồm nhiều công đoạn, thời gian sản xuất kéo dài 65
giờ nên chỉ có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu thí nghiệm vì khi đưa ra sản xuất
đại trà thì thiết bị cồng kềnh, tốn kém, hóa chất đắt tiền, dễ hao hụt khi sản xuất.
- Quy trình thủy nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản) [9] Hình 1.6. Quy trình thủy nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản)
Nhận xét: Quy trình đã đơn giản hóa công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản
xuất so với các quy trình khác. Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được
có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp do nhiệt độ
xử lý ở các công đoạn khá cao.

Vỏ cua khô
Khử chất vô cơ
Rửa trung tính
Sấy khô
Chitosan

Khử protein và chitin
Rửa trung tính
Sấy khô

Thủy sản bắt đầu nghiên cứu tách chiết chitin – chitosan do Đỗ Minh Phụng thực hiện.
V
ỏ tôm

Hấp chín, phơi khô
Xay nhỏ
Tách protein
Chitosan
Rửa trung tính
Ngâm HCl
Ngâm aceton
Ngâm NaOCl
Rửa trung tính
Deacetyl chitin
Rửa trung tính
NaOH 3.5%
T
0
= 65
0
C
 = 2
h

w/v = 1/10

NaOH 40%
T
0
= 85


Hình 1.8. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản
Nhận xét: Sản xuất chitosan theo quy trình này thì sản phẩm tạo thành có chất
lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp. Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy
hóa do đó dễ làm ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm.
Gần đây, khi chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có
giá trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu như: Trường Đại học Thủy sản, Trung tâm
nghiên cứu polymer - Viện khoa học Việt Nam, Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội, Trung
tâm Công nghệ và sinh học Thủy sản - Viện nghiên cứu môi trường thuỷ sản 2,…đã
tập trung vào nghiên cứu và ứng dụng công nghệ này. Trong đó, các kết quả công bố
gần đây của các nhà khoa học thuộc trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã đi sâu
nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử
dụng hóa chất trong xử lý, ứng dụng công nghệ enzyme. Những kết quả đó đã góp
Vỏ tôm khô
Ngâm HCl
Rửa trung tính
Ngâm NaOH
Chitosan
Rửa trung tính
Tẩy màu
Chitin

Nấu trong NaOH
Rửa trung tính
NaOH 8%
T
0
= 100
0
C


Hình 1.9. Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp Thủy sản Hà Nội
Nhận xét: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy
màu. Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công,
nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử
khoáng) làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm.
NaOH 2%
T
0
= 9095
0
C
 = 3
h

w/v = 1/2

HCl 4%
T
0
phòng
 = 24
h

w/v = 1/2

NaOH 2%


Chitin

Tách khoáng l
ần II

R
ửa trung tính

Tách protein l
ần II

R
ửa trung tính

Tách khoáng l
ần III

R
ửa trung tính

S
ấy khô

HCl 4%
T
0
phòng
 = 24
h

0
C
 = 3
hHCl 4%
T
0
phòng
 = 24
h

Rửa trung tính
HCl 4%
T
0
phòng
 = 24
h

NaOH 40%
T
0
= 9095
0
C
 = 3
h


Hàm lượng các chất không tan

1,6% Độ tan 98,32%
Độ nhớt 14,38
0
E Phản ứng biure Âm tính
Vỏ tôm khô
Ngâm HCl
Chitosan
Vỏ tôm tươi
Ngâm HCl
HCl 10%
T
0
phòng
 = 5
h

w/v = 1/10

HCl 10%
T
0
phòng
 = 5
h

w/v = 1/5

Rửa trung tính