TÔ VŨ AN
TÌM HIỂU SỰ BIÉN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC
ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐÓM TRẮNG TRÊN
TÔM SÚ (Penaeus monodon)
TẠI CÀ MAU
LUÃN VĂN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌc ThỦY sẢn
TÔ VŨ AN
TÌM HIỂU SỰ BIÉN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC
ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐÓM TRẮNG TRÊN
TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU
LUÃN VĂN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌc ThỦY sẢn
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
2008
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s TRẦN THỊ TUYÉT HOA
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
2008
MỤC LỤC
DANH SÁCH HÌNH
DANH SÁCH BẢNG
4
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa đã tận tình chỉ dẫn trong suốt quá
trình thực hiện đề tài này.
Chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Thủy Sản, các bạn lớp BHTS và NTTS K30 đã
tận tình giúp đở trong suốt quá trình học tập và làm luận văn này.
Xin cảm ơn cha, mẹ, chị, em là một chổ dựa vững chắc cho sự nghiệp và tương lai
của bản thân.
Tác giả
Tô Vũ

PHẦN I GIỚI THIỆU
Cà Mau là tỉnh nằm ở tận cùng cực nam của tổ quốc có ba mặt giáp biển và hệ thống
sông ngòi chằng chịt nên rất thuận lợi cho nghề nuôi trồng thủy sản phát triển. Từ
những đầu thập niên 80 nghề nuôi trồng thủy sản ở Cà Mau (đặc biệt là nghề nuôi tôm
sú) đã dần dần phát triển với hình thức nuôi quãng canh truyền thống nhưng năng suất
nuôi thấp. Để tăng năng suất thì việc chuyển đổi từ hình thức nuôi quãng canh truyền
thống sang bán thâm canh và thâm canh là rất cần thiết. Do hiệu quả kinh tế mà nghề
nuôi tôm đem lại nên diện tích và sản lượng tôm nuôi ở Cà Mau không ngừng tăng
trong những năm gần đây. Xuất khẩu thủy sản được xem là một trong những ngành
kinh tế mũi nhọn của tỉnh và trong khu vực.
Việc thâm canh hóa trong nuôi tôm sú không những tăng năng suất mà còn làm tăng
nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Theo thống kê của Bộ Thủy sản mỗi năm có hàng nghìn
hecta ao nuôi tôm thương phẩm phải thu hoạch sớm do bệnh trong đó 80% là bệnh đốm
trắng. Đây là bệnh nguy hiểm chúng có khả năng lây lan nhanh trong ao và gây thiệt hại
lớn (có thể gây chết đến 100% sau 3 - 10 ngày nhiễm bệnh) mà còn có khả năng lây lan
qua các khu vực lân cận qua nguồn nước hay các loài giáp xác. Nhưng mức độ gây hại
của chúng rất khác nhau ở các vùng và các vụ trong năm (có những ao tôm bị nhiễm
đốm trắng thì tôm chết rất nhanh nhưng cũng có ao nuôi bị nhiễm đốm trắng tôm vẫn
phát triển bình thường đến khi thu hoạch). Vấn đề này cũng có nhiều giả thiết được đặt
ra như: điều kiện môi trường, quản lý và chăm sóc sức khỏe tôm nuôi, tác nhân gây
bệnh: sự biến đổi kiểu gen WSSV. Do vậy,
Đề tài: "Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus
gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon) tại Cà Mau" được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài
Tìm hiểu về đặc điểm gen của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và
khả năng ứng dụng của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 trong nghiên cứu dịch tể
học của virus gây bệnh đốm trắng.
7
Nội dung nghiên cứu
* Xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm sú thu được tại Cà Mau

2.1.2 Việt Nam
Việt Nam với bờ biển trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Cà Mau vòng qua Kiên
Giang nên rất có tiềm năng cho nuôi trồng thủy sản nước lợ phát triển. Diện tích nuôi
tôm gia tăng nhanh chóng từ 50.000 ha (1985) lên đến 295.000 ha (1998) với 30 tỉnh
nuôi tôm sú và tăng lên 449.275 ha (2001). Đến năm 2004 diện tích nuôi tôm nước lợ
cảnướckhoảng 600.000 ha, với mô hình nuôi quãng canh cải
tiến là chủ yếu, ngoài ra còn có các mô hình bán thâm canh, thâm canh chiếm diện tích
nhỏ trong đó nuôi thâm canh đạt được năng suất cao khoảng 5 -7 tấn/ ha. Đồng bằng
sông Cửu Long là vùng có diện tích nuôi lớn nhất cả nước có khoảng
680.1 ha (2005). Sản lượng tôm cùng tăng theo từ 65.282 tấn (1999), tăng lên
103.845 (2000) đến năm 2001 sản lượng tôm nuôi là 162.713 tấn (Lê Xuân Sinh,
2003) , và sản lượng tiếp tục tăng đến 210.000 tấn (2003) (Nguyễn Văn Hảo,
2004) . Kim ngạch xuất khẩu các mặt hàng thủy sản năm 2005 là 2,65 tỷ
USD (Tạp chí khuyến ngư Việt Nam số 45), Năm 2007, xuất khẩu thủy sản của
cả nước đã đạt khoảng 925 nghìn tấn trị giá 3,756 tỷ USD, tăng 12,2% về khối
lượng và 14% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Tuy nhiên, trị giá xuất khẩu
trên khi được bổ sung đầy đủ số liệu luỹ kế của cả năm, rất có thể đạt đến mức
3,8 tỷ USD. (Báo thương mại, 2008). Việc xuất khẩu thủy sản được xem là một
trong các ngành kinh tế mũi nhọn ở Việt Nam.
2.1.3 Đồng bằng sông Cửu Long
Đồng bằng sông Cửu long là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất cả nước và cũng là một
trong các ngành kinh tế mũi nhọn của vùng. Tổng diện tích nuôi tôm của khu vực ở
năm 2003 chiếm 88% diện tích nuôi tôm của cả nước, sản lượng 146.000 tấn, chiếm
69.5% sản lượng tôm của cả nước, với hình thức nuôi quãng canh cải tiến là chủ yếu
9
như tôm rừng tập trung chủ yếu ở Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh, tôm lúa ở Cà Mau,
Kiên Giang, Sóc Trăng, bán thâm canh ở Sóc Trăng, Thâm
Canh ở Sóc Trăng, Bạc Liêu. Sóc Trăng là tỉnh có nghề nuôi tôm với tốc độ thâm canh
hóa cao, năng suất bình quân cao nhất vùng. Năm 2005, tổng diện tích nuôi tôm của
Sóc Trăng là 43.211 ha, sản lượng 42.817 tấn, trong đó diện tích nuôi thâm canh và bán

Indonesia và philippines giảm tương ứng 48% và 58% (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Ở
nhiều quốc gia do phát triển quá mức nghề nuôi nên phải chịu những hậu quả: tài
nguyên môi trường bị cạn kiệt, sử dụng nhiều nông dược, hóa chất, phá rừng, lấn đất
nông nghiệp làm cho đất bị nhiễm mặn, nguồn nước bị ô nhiễm. Việc thâm canh hóa
ngày càng cao làm bệnh bùng phát khắp nơi như Trung Quốc, Ecuador, Indonesia
(1992), Việt Nam, Thái Lan (1994 - 1996), Đài Loan, Philippines (1993), Với các tác
nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn, virus, ký sinh trùng, nấm. Nhưng bệnh do virus gây
tác hại nghiêm trọng nhất như MBV (Monodon Baculovirus), WSSV (White Spot
Syndrome Virus), YHV (Yellow Head Virus) Dịch bệnh đã làm giảm sản lượng tôm
trên thế giới từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, còn 693.000 tấn
1996 đến năm 1997 còn 660.000 tấn (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Như vậy dịch bệnh là
một trở ngại rất lớn cho sự phát triển nuôi trồng thủy sản trên Thế giới.
2.2.2 Trong nước và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long
Theo thống kê của Bộ Thủy sản năm 1995, từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh đã báo động
trên toàn quốc nó đã gây thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng. Trong năm 1994, có 84.558 ha bị
dịch bệnh, sản lượng bị thiệt hại 5.225 tấn trị giá 294 tỷ đồng (Nguyễn Văn Hảo,
2003). Đến năm 2001 dịch bệnh bùng phát ở miền Nam gồm các tỉnh Cà Mau, Bạc
1
1
Liêu, Sóc Trăng, Tiền Giang. Trong đó Bạc Liêu có diện tích thiệt hại cao nhất là
47.333 ha, Sóc Trăng là 10.000 ha (Nguyễn Văn Hảo,
2004) . Năm 2002 Cà Mau có 137.000 ha, Sóc Trăng Có 16.702 ha, Bạc Liêu
có 89.841 ha bị thiệt hại do bệnh, trong đó có 18.890 ha bị thiệt hại hoàn toàn
(Nguyễn Minh Niên, 2004). Ở Sóc Trăng đến tháng 10/2007 thì trong năm số hộ
nuôi lỗ là 3.908 chiếm 14.68%, diện tích thiệt hại 4.110 ha do bệnh phân trắng
( Sở Thủy sản Sóc Trăng, 2007).
Từ đầu năm 2008 đến nay, Cà Mau có hơn 39.000 ha diện tích tôm nuôi bị chết, với
mức độ thiệt hại bình quân từ 25 đến 30%. Trong tháng 6/2008, hiện tượng tôm chết
xảy ra trên diện rộng ở các huyện như Ngọc Hiển: hơn 10.000 ha, Đầm Dơi: 4.300 ha
và Năm Căn trên 800 ha. Nguyên nhân là do thời tiết diễn biến bất thường, nhiệt độ

Hsiung Kou, Donald V. Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh, Peter J. Walker
đã phân loại virus gây hội chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus thuộc
họ mới Nimaviridae (Vlak et al., 2002). Virus được tìm thấy ở nhiều cơ quan
khác nhau như: chân bơi, mang, dạ dày, cơ bụng, huyết tương, ruột giữa, tim,
chân bò, lympho, màng bao bọc, mô thần kinh, gan, tinh hoàn, buồng trứng, tinh
dịch, cuống mắt (Lo et al, 1997).
2.4.2 Triệu chứng
Đặc trưng của bệnh này là tôm bơi lội lờ đờ, yếu ớt, bỏ ăn, di chuyển chậm chạp, cơ thể
có thể chuyển sang màu hồng hoặc hơi đỏ, phía dưới giáp đầu ngực có những đốm
trắng từ 1mm đến vài mm. Bệnh thường xuất hiện ở thời điểm 1 - 2 tháng sau khi nuôi,
khi môi trường nuôi bắt đầu xấu đi (Bùi Quang Tề, 2003). Khi tôm bị bệnh đốm trắng
có thể chết 100% trong 3 - 10 ngày (Lightner, 1996).
2.4.3 Phương thức lây nhiễm và loài cảm nhiễm
Theo Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 hiện nay bệnh đốm trắng ảnh hưởng lớn đến các loài
tôm có giá trị kinh tế thuộc họ Penaeid Một số loài tôm bị nhiễm WSSV như P.
1
3
monodon, P. japonicus, P. chinens, P. indicus Bên cạnh đó WSSV được phát hiện
cảm nhiễm trên 40 loài giáp xác: tôm, cua, còng, copepod, thậm chí là ấu trùng côn
trùng. Theo Bùi Quang Tề, (2003) thì bệnh đốm trắng lây theo chiều ngang là chính.
Virus lây từ các giáp xác khác (tôm, cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi
trường bên ngoài ao hay ngay trong ao nuôi tôm. Khi các loài tôm nhiễm đốm trắng
trong ao sức khoẻ của chúng yếu hoặc chết các con khoẻ ăn chúng dẫn đến bệnh lây lan
càng nhanh hơn. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao khác
và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẫu thừa và rơi vào ao.
2.4.4 Chẩn đoán
Lightner, (1996) đã đưa ra phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh đốm trắng. Với
phương pháp này ta có thể quan sát được thể vùi WSSV phì đại trong nhân của tế bào bị
nhiễm nó bắt màu của thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin.
Dựa trên dấu hiệu đặc trưng là xuất hiện các đốm trắng dưới vỏ. Kết hợp với chẩn đoán

trại giống và 350 mẫu tôm nuôi ( 40 - 60 ngày tuổi) từ 18 ao khác nhau. Kết quả 53%
mẫu dương tính với WSSV khi thực hiện PCR một bước. Okumura et al., (2004) đã
dùng kỹ thuật RPLA (Reversed passive latex agglutination) để phát hiện WSSV từ mô
dạ dày trên tôm he Nhật bản (Penaeus japonicus). Kỹ thuật này sử dụng hạt tổng hợp
có tỷ trọng cao và kháng thể đa dòng đặc hiệu, WSSV được phát hiện sau 12 giờ ủ độ
chính xác tương đương PCR.
Những nghiên cứu về dịch tể học nhằm tìm hiểu đặc điểm gen của virus gây bệnh đốm
trắng để ứng dụng trong việc xác định con đường lây truyền của WSSV như:
Wongteerasupaya et al., (2003) đã nghiên cứu về dịch bệnh đốm trắng trên 65 mẫu tôm
bệnh từ 55 ao tôm nuôi đã bùng phát bệnh đốm trắng ở Thái Lan bằng phương pháp
PCR-genotyping sử dụng đoạn mồi khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 để tìm số
vùng lặp lại có kích thước 54 bp. Kết quả cho thấy số lần lặp lại từ 6 đến 20 lần, trong
đó 8 lần lặp lại chiếm nhiều nhất 32%. Bui Thi Minh Dieu et al., (2004) phân tích mẫu
tôm sú nhiễm WSSV từ 8 ao khác nhau ở 7 tỉnh thuộc khu vực Miền Trung và Miền
1
5
Nam Việt Nam để so sánh các dòng WSSV ở Việt Nam với dòng WSSV ở Thái Lan
(WSSV - TH), Đài Loan (WSSV - TW) và Trung Quốc (WSSV - CN). Sử dụng các cặp
mồi được thiết kế dựa trên đoạn gen của WSSV thuộc ORF14/15, ORF24/25, ORF75,
ORF94, ORF125. Kết quả chứng minh các dòng WSSV ở việt Nam có cùng nguồn gốc
với WSSV - TW (Đài Loan) và WSSV - TH (Thái Lan) khi sử dụng 2 cặp mồi
ORF23/24 và ORF14/15, và kết quả này cho thấy ORF75 và ORF125 có ý nghĩa quan
trọng trong việc nghiên cứu dịch tể học của bệnh đốm trắng sau này ở Việt Nam. Tran
Thi Tuyet Hoa et al., (2005) sử dụng phương pháp PCR-genotyping khuyếch đại vùng
lặp lại thuộc ORF94 trên các mẫu tôm nuôi và tôm giống ở Việt Nam. Kết quả nghiên
cứu đã xác định được số vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên tôm giống từ 4 đến
8 và trên tôm nuôi là 4 đến 9 trong đó kiểu gen của WSSV có 7 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ
cao nhất. Lê Vân Hải Yến, (2006) sử dụng phương pháp PCR- genotyping khuếch đại
vùng lặp lại thuộc ORF94 để xác định số vùng lặp lại của virus gây bệnh đốm trắng trên
130 mẫu tôm sú thu tại Sóc Trăng, Trà Vinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy WSSV có 5,

LD50.
Khi xác định được tác nhân gây bệnh, phương thức lây truyền, và những ảnh hưởng của
WSSV thì có nhiều nghiên cứu nhằm khống chế sự phát triển và khả năng gây hại của
WSSV như: Witteveldt et al., (2003) đã sử dụng vacxin chứa vỏ của WSSV để phòng
WSSV. Thí nghiệm đã chỉ ra rằng những tôm sống sót sau khi bị nhiễm WSSV sẽ có tỉ
lệ sống cao hơn khi tái cảm nhiễm. Chúng tôi nghiên cứu khả năng của vacxin cho tôm
thông phương pháp cho ăn, vacxin này chứa protein vỏ của WSSV. Tôm sú (Penaeus
monodon) được cho ăn thức ăn viên áo bên ngòai 1 lớp vi khuẩn không họat động biểu
hiện 2 lọai protein vỏ của WSSV là VP19 và VP28. Vacxin chứa VP28 cho thấy tỉ lệ
chết của tôm thấp hơn có ý nghĩa khi so sánh với lô đối chứng (vi khuẩn chỉ chứa
vector rổng) thông qua phương pháp ngâm (tỉ lệ sống 61%), trong khi đó vacxin chứa
VP19 không thể hiện sự bảo vệ nào. Để xác định sự tấn công và thời gian bảo vệ của
vacxin, thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện sau khi sử dụng vacxin 3, 7 và 21 ngày.
Tỉ lệ sống cao hơn có ý nghĩa được quan sát sau khi tôm sử dụng vacxin 3, 7 ngày
1
7
(64% và 77%), nhưng sự bảo vệ đã giảm sau 21 ngày (tỉ lệ sống 29%). Trái với những
hiểu biết hiện tại, động vật không xương sống không có hệ thống đáp ứng miễn dịch
nhưng kết quả này cho thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và khả năng bảo vệ có thể tạo
ra ở P. monodon. Các thí nghiệm trên mở ra con đường mới phòng WSSV mang lợi ích
cho công nghiệp nuôi tôm. Hứa Quyết Chiến, (2004) đã nghiên cứu và sử dụng thành
công việc sử dụng chế phẩm SH'99 trong việc phòng bệnh virut đốm trắng trên tôm sú.
Khi cho tôm ăn liên tiếp chế phẩm SH'99 ngay sau khi thả có thể giúp tôm phòng bệnh
đốm trắng. Sarathi et al., (2007) đã sử dụng vi khuẩn có chứa VP28dsRNA vào trong
thức ăn viên cho tôm ăn để làm giảm khả năng gây hại của WSSV. Có hai phương pháp
được thử nghiệm. Phương pháp thứ nhất là trộn vi khuẩn có chứa VP28dsRNA vào
trong thức ăn viên cho tôm ăn. Phương pháp hai trộn phức hợp mảnh nhỏ VP28dsRNA-
chitosan vào trong thức ăn viên cho tôm ăn. Tôm khoẻ được gây cảm nhiễm bệnh đốm
trắng bằng cách cho ăn tôm bị bệnh đốm trắng. Thí nghiệm được thực hiện trong 30
ngày. Kết quả cho thấy ở những lô tôm nhiễm WSSV có cho ăn dsRNA thì tỉ lệ sống

cần khuếch đại. ( />2.6.2 Những ứng dụng của PCR
Kỹ thuật PCR được áp dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau. Theo Trần Thị Tuyết Hoa
(2004), kỹ thuật PCR được ứng dụng vào các lĩnh vực sau
Trong thủy sản: (i) Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá
trình chọn lọc cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi; (ii)
Chẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết khi dịch bệnh
xảy ra, đồng thời đề ra hướng ngăn chặn sự xuất hiện của dịch bệnh; (iii) Phòng bệnh
và kiểm soát bệnh: kiểm tra tôm giống và tôm bố mẹ ở các trại giống, kiểm tra tôm
nhập khẩu trước khi cho thả nuôi ở các địa phương.
Trong các lĩnh vực khác: (i) Nghiên cứu khoa học: xác định trình tự đoạn ADN cần
nghiên cứu, phát hiện đột biến, nghiên cứu quá trình tiến hóa phân tử, phục hồi gen tồn
tại hàng triệu năm; (ii) Chọn giống vật nuôi và cây trồng từ đó lựa chọn được những cá
1
9
thể bố mẹ thuần chủng, sạch bệnh trong thời gian ngắn; (iii) Y học và khoa học hình sự:
áp dụng để chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi rút, vi khuẩn, nấm, chẩn
đoán sớm ung thư và các bệnh do di truyền, xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội
phạm.
2.6.3 Hạn chế
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) phương pháp PCR có những hạn chế sau.
Phương pháp PCR thừơng không hoạt động với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb, điều
kiện tối ưu cho phản ứng phải qua thực nghiệm.
Sự ngoại nhiễm là vấn đề cực kỳ quan trọng, nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các
sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước.
Sự sai sót do Taq polymerase, cứ 10.000 nucleic thì enzyme gắn sai 1 nucleic.
PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 01 đến tháng 07 năm 2008.
Các mẫu tôm có dấu hiệu đốm trắng đã được thu từ các huyện Đầm Dơi (2 ao), Phú
Tân (1 ao), Thới Bình (2 ao), Trần Văn Thời (3 ao), và Thành Phố Cà Mau (14 ao),

Kit IQ 2000-WSSV, TE buffer, Ethanol, Ethidium Bromide, dung dịch diện di TAE
0.5X, Agarose, dNTPs, MgCl
2
, dung dịch đệm, mồi, Taq ADN polymerase, Primer
3.4 Phương pháp Nested-PCR (Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng của bộ kit IQ-
2000 WSSV của công ty Farming Intelligene Technology Coperation, Đài Loan)
gồm các bước: ly trích DNA, khuyếch đại DNA, điện di, đọc kết quả.
3.4.1 Qui trình ly trích DNA
ADN được ly trích từ mang tôm sú với bộ chiết tách DTAB - CTAB.
Mang tôm được cho vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 600 ^l DTAB. Sử dụng que
nghiền tiệt trùng để nghiền mẫu mang tôm. Ủ mẫu sau khi nghiền ở 75
0
C khoảng 10
phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. Trộn đều bằng máy vortex, ly tâm nhẹ. Sau đó thêm
700 ^l Chloroform, lắc đều 20 giây và ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút. Cẩn thật
chuyển phần nước trong ở bên trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm vào 100 ^l
CTAB và 900 ^l nước cất, lắc đều, ủ 75
0
C khoảng 10 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng,
sau đó ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút. Bỏ phần nước trên, thêm 150 ^l Dissolve
Solution, ủ ở 75
0
C khoảng 10 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Ly tâm 12.000 vòng
trong 5 phút. Chuyển phần dịch trong sang ống eppendorf 1,5 ml mới có chứa 300 ^l
ethanol 95%. Sau đó lắc đều, ly tâm
12.1 vòng trong 5 phút. Rửa ADN bằng 200 ^l ethanol 70%, làm khô ADN trước
khi hoà tan trong 120 ^l TE buffer. Trữ mẫu ADN ly trích ở -20
0
C cho đến khi
phân tích.

0
C trong 20 giây, nhiệt độ 72
0
C
trong 30 giây, lặp lại chu kỳ này 25 lần. Tiếp theo, nhiệt độ 72
0
C trong 30 giây. Cuối
cùng, nhiệt độ 20
0
C trong 30 giây.
3.4.3 Cách chuẩn bị phản ứng
Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng Nested-PCR bước 1 và bước 2 được thực hiện dựa
theo số lượng mẫu cần phân tích. Mỗi lần chuẩn bị mẫu cần có 1 đối chứng dương và 1
đối chứng âm (nước cất)
Bước 1 Cho 8 ^l hỗn hợp thứ nhất cho vào ống eppendorf 0,2 ml đã được làm dấu,
thêm 2 ^l ADN chiết tách hoặc đối chứng. Thực hiện qui trình khuếch đại PCR bước 1.
Bước 2 Sau khi qui trình khuếch đại thứ nhất kết thúc thêm 15 ^l hỗn hợp thứ hai
vào mỗi ống eppendorf chứa sản phẩm của bước 1. Thực hiện qui trình khuếch đại PCR
bước2.
3.4.4 Chạy điện di
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0.5X và bản thạch (gel) chứa
1. 5% agarose.
2
3
Chuẩn bị gel: Cân 1.5g agarose vào chai 250 ml thêm vào 100 ml TAE 0.5X, lắc đều và
đun nóng dung dịch bằng lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn, để dung dịch
nguội khoảng 50 - 60
o
C cho 4^l Ethidium Bromide lắc đều và đổ gel vào khay đã được
gắn lược và dán băng keo ở hai đầu. Khi gel đặc lại, cẩn thận gỡ lược và keo dán ra

3.5.1.2 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR-genotyping (ORF94)
Tổng thể tích cho phản ứng là 50 ^l với các thành phần hoá chất có nồng độ được liệt
kê ở bảng 3.1
Bảng 3.1: thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR-genotyping
(ORF94)
2
4
Hóa chất Nồng độ phản ứng
PCR Buffer 1 X
MgCl2 1,5 mM
dNTP mix 200 ^M
ORF94-F 25 pmol
ORF94-R 25 pmol
Taq polymerase 2,5 U
AND 1 ^l
Trình tự cặp mồi ORF94
Tên mồi Trình tự mồi
ORF94-F
ORF94-R
5'-TCT-ACT-CGA-GGA-GGT-GAC-GAC-3'
5'-AGC-AGG-TGT-GTA-CAC-ATT-TCA-TG-3
3.5.1.3 Đọc kết quả
Kết quả điện di được ghi nhận bằng thiết bị chụp ảnh gel (Vilber Loumart).
Căn cứ vào thang ADN (1 kb plus ladder) để xác định số lần lặp lại của mẫu phân
tích. Công thức tính số lần lặp lại của trình tự 54 bp: X = x + (54* n)
Trong đó: X là chiều dài sản phẩm
x là số nuceotide từ vị trí gắn mồi đến vùng lặp lại n
là số lần lặp lại của trình tự 54 bp
3.5.2 PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 (ứng dụng qui
trình được thực hiện trong đề tài của Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008)