LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, con xin gởi đến ba mẹ, người đã nuôi con
khôn lớn, là nguồn động viên, là chỗ dựa tinh thần vững chắc, luôn tạo mọi điều kiện
cho con ăn học nên người.
Em xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thu Thủy, chị Hồ Thị Thanh Thủy, anh
Nguyễn Trọng Hiếu, anh Nguyễn Văn Hưng và anh Nguyễn Duy Khánh, đã rất tận
tình hướng dẫn em thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học & Môi
trường, các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang đã
dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt 4 năm
qua.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và tất cả các anh chị trong công ty Cổ
phần Công nghệ Việt Á đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn
thành tốt đồ án này.
Em cảm ơn chị Ngô Huỳnh Phương Thảo, trưởng phòng CNSH Thủy Sản – Trung
tâm CNSH TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em rất nhiều trong công tác tìm mẫu làm
thực nghiệm.
Và cuối cùng, gởi lời cảm ơn đến tập thể 48 CNSH, các bạn trường ĐH Khoa học
tự nhiên, Đại học Mở và Đai học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, những người bạn đã
luôn động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập ở trường và trong
thời gian thực tập vừa qua.
Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2010
Sinh viên thực hiện
Võ Thị Lƣu
i
MỤC LỤC
Danh mục các từ viết tắt iii
2.2.2. Tách chiết DNA 18
2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 19
2.2.4. Điện di gel agarose 22
2.2.5. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR 23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA 26
3.2. Xây dựng quy trình PCR chẩn đoán bệnh IHHNV 26
3.2.1. Thiết kế mồi và kiểm tra các đặc tính của cặp mồi trên lý thuyết 26
3.2.2.1. Thiết kế mồi 26
3.2.2.2. Các thông số của mồi 26
3.2.2.3. Tính đặc hiệu của mồi 30
3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản
ứng PCR 34
3.2.2.1. Sự hoạt động của mồi trên thực tế. 34
3.2.2.2. Nhiệt độ lai 36
3.2.2.3. Độ đặc hiệu của mồi 37
3.2.2.4. Độ nhạy của quy trình 39
3.3. Ứng dụng quy trình để chẩn đoán bệnh IHHNV trên tôm 40
Kết luận và kiến nghị 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
PHỤ LỤC 45
iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
µl : Microliter
µM : MicroMol
Bảng 1: Loài tôm nhạy cảm với IHHNV 11
Bảng 2: Các thông số của cặp mồi IHHNV 318F/R 16
Bảng 3: Cách pha mix PCR 21
Bảng 4: Các cặp mồi tham khảo để thiết kế cặp mồi IHHNV 318F/R 27
Bảng 5: Một số đặc tính của cặp mồi IHHNV 318F/R 27 v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Bản đồ minh họa sự xuất hiện của virus IHHNV trên thế giới 4
Hình 2: Cấu trúc của IHHNV 6
Hình 3: Cấu trúc bộ gen IHHNV hoàn chỉnh 8
Hình 4: Ảnh minh họa tôm bị nhiễm IHHNV 10
Hình 5: Thể vùi Cowdry Type A được tìm thấy trên tế bào tôm nhiễm IHHNV . 12
Hình 6: Nguyên tắc của phản ứng PCR 14
Hình 7: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 28
Hình 8: Một số cấu trúc sefl - dimer của mồi 29
Hình 9: Một số cấu trúc hetero - dimer của mồi 30
Hình 10: Kết quả BLAST trình tự mồi xuôi và mồi ngược trên NCBI 31
bằng các phương pháp sinh học phân tử như PCR và Real-time PCR… Tại Việt Nam,
bộ Kit Real-time PCR nhằm phát hiện IHHNV đã được thương mại hóa bởi Trung
tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, giá thành và các yêu
cầu về trang thiết bị phòng thí nghiệm cũng như kỹ thuật của người làm xét nghiệm
đòi hỏi rất cao, do vậy phương pháp này chưa được áp dụng rộng rãi cho các trung
tâm kiểm dịch dịch bệnh thủy sản ở các tỉnh thành trong cả nước. Vì vậy, việc xây
dựng quy trình PCR phát hiện bệnh IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam là điều cần
thiết, nhằm phát hiện và xử lý kịp thời bệnh do IHHNV gây ra.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình PCR để
phát hiện virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV) trên tôm”.
2
Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây:
- Xây dựng quy trình PCR chuẩn phát hiện IHHNV trên tôm có độ nhạy
cao, chi hợp lý.
- Khảo sát khả năng ứng dụng quy trình trên các mẫu tôm nghi ngờ
nhiễm bệnh.
. Năm 2000, xuất khẩu tôm thế giới đạt hơn 10,9 tỷ USD. Với hiệu
quả kinh tế và xã hội to lớn, nghề nuôi tôm thực sự trở thành nghề sản xuất thu hút
các nhà đầu tư.
Sự phát triển mạnh mẽ, có thể nói là bùng nổ nghề nuôi tôm trên thế giới ngoài
những mặt lợi còn có mặt trái của nó. Trong suốt 2 thập kỷ qua, nghề nuôi tôm trên
thế giới đã có rất nhiều thay đổi và trải qua nhiều khó khăn. Dịch bệnh đã liên tiếp
xuất hiện ở nhiều khu vực nuôi tôm, đặc biệt là các nước châu Á, trong đó bệnh do
virus ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền công nghiệp nuôi tôm. Ước tính tổng thiệt hại
do virus gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD
[2, 3]
.
Bệnh hoại tử máu và vỏ do IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic
necrosis virus) là một trong những bệnh virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm.
Virus này khi thâm nhập vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ. Nuôi
tôm ở giai đoạn postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này. Tôm
nhiễm virus có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi trên mặt nước, xoay tròn và chết. Tỷ lệ tôm
4
chết khi nhiễm bệnh khá cao: tôm P. vannamei 10-50%, tôm tự nhiên (Ecuado) 63%,
tôm nuôi (Panama) 95%
[9, 10]
.
IHHNV được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1981 ở Hawaii khi gây chết hàng
loạt tôm P. stylirostris
[10, 16, 17]
. Sau đó virus lan rộng đi khắp nơi như Tahiti, Florida,
Texas, Islands, Israel, Panama, Costa Rica, Belize, Ecuador, Brazil, Honduras, France
và Jamaica
[23]
và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành nuôi trồng thủy sản ở các
cao. Hiện tượng tôm nuôi thường bị dịch bệnh chết trên diện rộng từ năm 1993 đến
nay đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Năm 2003, diện tích
nuôi tôm bị nhiễm bệnh là 32.423 ha, chiếm 3,2 % gây nhiều thiệt hại cho người nuôi
tôm
[3]
.
Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh tôm
trên toàn quốc đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng. Riêng năm 1994, tổng diện tích
nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị
giá khoảng 294 tỷ đồng. Đến nay dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây
tổn thất nghiêm trọng. Đồng Bằng Sông Cửu Long là khu vực bị thiệt hại lớn nhất do
nơi đây tập trung khoảng 87 % diện tích nuôi tôm của cả nước
[1, 3]
.
Theo khảo sát của các nhà khoa học, bên cạnh WSSV, MBV và YHV, IHHNV
là một trong những virus gây bệnh phổ biến có mặt tại nhiều vùng nuôi tôm trọng
điểm của cả nước
[4, 5]
.
6
1.2. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dƣới vỏ (IHHNV)
1.2.1. Hình thái và cấu trúc
IHHNV là một trong những virus gây bệnh ở tôm Penaeid có kích thước nhỏ
nhất. Virus này có hình khối 20 mặt (Hình 2), đường kính khoảng 20 - 22 nm, không
có màng bao icosahedron, mật độ trong CsCl là 1,40 g/ml, vật liệu di truyền là DNA
sợi đơn với kích thước bộ gen ước lượng khoảng 4,1 kb
[4, 11, 17, 18]
.
. Polypeptide này là protein không cấu trúc 1 (NS1) với nhiều chức năng
khác nhau như: đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo DNA virus, tham gia vào
quá trình đóng gói DNA virus trong các tế bào của động vật có xương sống, tăng
cường biểu hiện gen mã hóa vỏ capside
[9]
…
ORF2 bắt đầu từ nucleotide thứ 56, tính theo chiều ngược và có đoạn chồng
lấp với ORF1. ORF này gồm 1092 nucleotide, tương đương với nucleotide từ vị trí
760-1851, mã hóa cho protein chưa biết rõ chức năng. Tuy nhiên, Shinke (2000) đã
nghiên cứu và dự đoán rằng ORF2 có thể mã hóa cho protein không cấu trúc 2 (NS2)
chưa biết chức năng cụ thể, gồm 434 amino acid
[9]
.
ORF3 gồm 990 nucleotide, bắt đầu từ nucleotide thứ 2758-3747. Đầu 5’ của
ORF3 cũng chồng lấp với ORF1 và mã hóa cho 1 polypeptide gồm 329 amino acid
[9,
17]
, là protein vỏ capsid của virus (VP). Dựa trên cấu trúc và tổ chức gen của các
Parvovirus khác, người ta thấy rằng ORF3 mã hóa cho các protein cấu trúc
[9, 14, 16]
.
8
Hình 3: Cấu trúc bộ gen IHHNV hoàn chỉnh
Bộ gen của IHHNV (GenBank, AF218266) bao gồm 4075 bp, với 3 khung đọc
mở. Trong đó, ORF1 mã hóa cho protein không cấu trúc ( từ nucleotide 816-2816),
ORF2 mã hóa cho protein chưa biết chức năng (từ nucleotide thứ 760-1851) và
ORF3 mã hóa cho protein cấu trúc (từ nucleotide 2758-3747)
Sử dụng phương pháp điện di protein (SDS-PAGE) để phân tích cấu trúc
IHHNV ở Hawaii. Trình tự ở Madagascar thể hiện sự tương đồng thấp hơn, 85,9% so
với IHHNV ở Hawaii. Trình tự ở Mauritius chỉ khác trình tự ở Madagascar 1
nucleotide
[6, 14, 16]
.
1.2.2. Cách thức lan truyền
IHHNV lan truyền theo chiều ngang hoặc chiều dọc. Sự lan truyền theo chiều
ngang là do tập tính ăn thịt lẫn nhau hoặc do nguồn nước bị nhiễm, lan truyền theo
chiều dọc do trứng bị nhiễm mầm bệnh
[4]
.
Sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus cởi áo trong không bào của tế bào
chất và DNA được vận chuyển đến nhân, nơi nó được phiên mã thành RNA thông tin.
Giống nhiều virus DNA khác, chu trình nhân lên của IHHNV có thể chia thành hai
giai đoạn: giai đoạn khởi đầu sao chép DNA virus và giai đoạn sau, tổng hợp các
protein chức năng của virus. Các gen tham gia vào giai đoạn đầu và giai đoạn sau tập
trung ở hai vùng khác nhau trên bộ gen của virus. Sự biểu hiện của chúng được điều
hòa bởi hai promoter phiên mã độc lập
[9]
. 1.2.3. Dấu hiệu tôm bị nhiễm IHHNV
Các dấu hiệu tôm bệnh phát triển chậm và biến dạng vỏ do IHHNV thường
xuất hiện ở giai đoạn hậu ấu trùng ở 35 ngày tuổi. Trước giai đoạn này tôm có thể
mang mầm bệnh nhưng không có biểu hiện ra bên ngoài
[8, 21]
.
10
làm lớp vỏ ngoài bị dị dạng
[4, 9, 14, 18]
. Những nghiên cứu cho thấy rằng IHHNV có mối
liên hệ mật thiết với bệnh đục cơ tôm và có ảnh hưởng đến tỉ lệ sống.
Bảng 1: Loài tôm nhạy cảm với IHHNV
Tên loài
Xuất hiện bệnh
Farantopanaeus aztecus
Farantopanaeus californiensis
Penaeus duorarum
Penaeus japonicus
Penaeus monodon
Penaeus semisulcatus
Litopenaeus setiferus
Penaeus stylirostris
Penaeus vannamei
Chứng minh bằng thực nghiệm
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Chứng minh bằng thực nghiệm
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Chứng minh bằng thực nghiệm
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Bệnh do IHHNV thường xảy ra nghiêm trọng cho hầu hết tôm ở vùng Thái
Bình Dương, virus có thể gây dịch cấp và có thể gây chết trên 90% tôm P. stylirostris
trong vòng 20 ngày. Đối với P. stylirostris, ở giai đoạn tôm non và giai đoạn gần
trưởng thành bị ảnh hưởng nghiêm trọng
[8, 9, 10, 12, 13, 10, 21]
.
Hình 5: Thể vùi Cowdry Type A đƣợc tìm thấy trên tế bào tôm nhiễm IHHNV
Mũi tên hướng lên chỉ nhân của tế bào tôm bị nhiễm IHHNV, mũi tên hướng xuống chỉ
nhân của tế bào tôm bình thường
Nghiên cứu mô học thường được sử dụng để phát hiện những tổn thương ở vỏ,
mang, tế bào biểu bì, mô máu, dây thần kinh… Đây là phương pháp phổ biến nhất
13
trong chẩn đoán bệnh thủy sản
[10, 20]
nhưng thường chỉ cho kết quả chính xác khi tôm
nhiễm bệnh nặng.
1.3.2. Phƣơng pháp lai tại chỗ
Lai tại chỗ (in situ hybidrization) là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự
nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hoặc trong mô. Lai tại chỗ
cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra
khỏi mô, tế bào.
Phương pháp lai tại chỗ cũng được phát triển để chẩn đoán bệnh IHHNV
[8]
.
Mặc dù phương pháp này nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng tốn nhiều thời gian
để hoàn thành (2-3 ngày).
1.3.3. Phƣơng pháp kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng được ứng dụng thành công trong y học từ lâu, đặc biệt gần
đây nó được sử dụng để chẩn đoán bệnh YHV, WSSV và IHHNV trên tôm
[9]
.
Trước tiên, kháng nguyên GP3 protein của IHHNV được trộn với tá dược rồi
15
1.3.4.2. Kỹ thuật Real-time PCR
Realtime PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA diễn ra theo từng
chu kỳ và được theo dõi trực tiếp. Hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR)
được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Realtime PCR gồm hai quá
trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh
quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành. Để có được tín hiệu Real-time
phản ứng đang diễn ra, người ta sử dụng chất phát huỳnh quang (fluorophores), hoặc
các mẫu dò đánh dấu (labeled probes) như: Beacon, TaqMan,… có gắn chất phát
huỳnh quang (FAM, TAMRA, …). Các phẩm nhuộm như SYBR Green, Hoechst khi
chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang. Mix PCR có chứa phẩm nhuộm phát
huỳnh quang, khi gắn vào mạch đôi DNA sẽ thể hiện cường độ màu tương ứng với
nồng độ ban đầu của DNA bản mẫu.
Đối với tôm, kỹ thuật Real-time PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh
do virus gây ra như bệnh đỏ đuôi (Taura), bệnh hoại tử (IHHNV)…
[2]
. Kỹ thuật Real-
time PCR phát hiện và định lượng IHHNV cho kết quả nhanh và có độ nhạy cao
[4]
. Để
tăng cường kiểm soát khả năng tạp nhiễm, người ta sử dụng thêm mẫu chứng là DNA
được tách chiết từ tôm, chứa những trình tự đã biết trước, chẳng hạn như gene β-actin,
để khuếch đại song song với DNA của virus. Cài đặt chu kỳ nhiệt cho phản ứng, xây
dựng đường chuẩn và dựa vào giá trị chu kỳ ngưỡng (C
T
) để kết luận mẫu có nhiễm
IHHNV hay không.
So với phương pháp PCR truyền thống thì phương pháp này đòi hỏi phòng thí
nghiệm được đầu tư trang thiết bị hiện đại hơn, cán bộ phụ trách xét nghiệm phải
dài
(bp)
Độ dài
sản
phẩm
khuếch
đại
(bp)
Nhiệt
độ biến
tính
(T
m,
0
C)
IHHNV
318F
5’-TATGACTACCTCCAACACTTAGTCA-3’
25
318
54.8
IHHNV
318R
5’-GTCTGCTACGATGATTATCCAAGC -3’
24
55.5
C (Sanyo, Nhật)
Tủ vô trùng để tách chiết và đặt phản ứng PCR (Việt Á, Việt Nam)
Máy ly tâm (Eppendorf, Đức)
Máy vortex (IKA, Hàn Quốc)
Máy PCR (Stratagene, New Zealand)
Bồn ủ nhiệt khô (Việt Á, Việt Nam)
18
Bộ điện di (UVP, USA)
Bàn đèn tử ngoại (UVP, USA)
Máy chụp hình kỹ thuật số (Canon, Nhật)
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Thu mẫu
- Mẫu thu từ các trung tâm nghiên cứu, xét nghiệm bảo quản nguyên con hoặc
từng bộ phận (ví dụ đầu tôm bị nhiễm virus) trong ethanol 95%.
- Đối với các mẫu thu nhận từ trại tôm còn tươi sống, có thể bảo quản trong đá
lạnh để vận chuyển về phòng thí nghiệm rồi tiến hành các thao tác lưu mẫu
trong dung dịch bảo quản mẫu như trên hoặc bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 80
0
C
đến - 20
0
C trong tủ đông.
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA
2.2.2.1. Nguyên tắc
DNA từ các mẫu tôm được tách chiết bằng phương pháp kết tủa (Chomozynski
và Sacchi, 1987). Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến
tính mạnh để phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn
(protein, màng tế bào…). DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu
hồi qua các lần ly tâm. Cặn DNA được hòa tan trong đệm TE 1X và bảo quản ở -
- Thu 600 µl dịch nổi có chứa DNA vào eppendorf sạch khác có sẵn 600 µl
dung dịch isopropanol đã bổ sung chất trợ tủa, trộn đều, để yên 10 phút
trong tủ lạnh, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (hoặc hồng), cho từ từ 900 µl dung dịch
ethanol 70% vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn và làm khô ở 60
0
C trong 10-15 phút.
- Hòa tan trong 50 µl dung dịch TE 1X.
2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR
2.2.3.1. Nguyên tắc
Phản ứng PCR bao gồm một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
thường gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ nóng chảy (T
m
) của phân tử, thường là 94 - 95
0
C trong vòng 30 giây
Copyright: Tài liệu đại học ©