B GIO DC V O TO
TRNG I HC NễNG NGHIP H NI
U XUN TUN Phân lập, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học
của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết
trùng ở chim và gà cảnh nuôi tại Vờn Thú Hà Nội
nhằm chọn chủng chế vacxin phòng bệnh LUN VN THC S NễNG NGHIP Chuyờn ngnh : TH Y
Mó s : 60.62.50
Ngi hng dn khoa hc: PGS.TS. C HU PH H NI - 2010
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp………… .
i

Lêi cam ®oan

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố
trong bất kì công trình nào khác.

học Nông nghiệp Hà Nội ñã dành nhiều thời gian và công sức giúp ñỡ tôi
trong quá trình học tập và thực hiện ñề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS. TS Cù Hữu Phú
PGS.TS Nguyễn Hữu Nam
ðã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong qua trình thực hiện và hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ñốc Viện Thú y, anh chị em Bộ
môn Vi trùng- Viện Thú y cùng bạn bè ñồng nghiệp và gia ñình ñã giúp ñỡ
ñộng viên tôi hoàn thành chương trình học tập cao học và hoàn thành Luận
văn tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2010
Tác giả luận văn Âu Xuân Tuấn
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
iii

Mục lục

Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu v

4.3.2 Kết quả kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn Pasteurella phân lập đợc. 51
4.3.3 Kết quả nghiên cứu các đặc tính sinh hóa của của vi khuẩn 52
4.4 Kết quả định type các chủng Pasteurella multocida phân lập
đợc tại Vờn Thú Hà Nội 56
4.5 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida
phân lập đợc. 58
4.6 Kết quả xác định LD50 trên chuột bạch (liều gây chết 50% động
vật thí nghiệm 60
4.7 Kết quả thử kháng sinh đồ các chủng Pasteurella multocida phân
lập đợc trên đàn chim, gà nuôi tại Vờn thú hà nội. 62
4.8 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng
chim, gà cảnh nuôi tại Vờn Thú Hà Nội. 65
4.8.1 Chế tạo thử nghiệm vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng
bệnh Tụ huyết trùng cho chim, gà cảnh tại Vờn thú Hà nội. 65
4.8.2 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của vacxin trên động vật thí
nghiệm. 66
4.8.3 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của vacxin trên gà thả vờn. 68
4.7.4 Kết quả thử hiệu lực của Vacxin trên chim, gà tại vờn thú Hà
Nội bằng phơng pháp bảo hộ thụ động trên chuột (Passive
mouse protection test- PMPT) 71
5 Kết luận và đề nghị 74
5.1 Kết luận 74
5.2 Đề nghị 75
Tài liệu tham khảo 76
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp………… .
v

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t vµ ký hiÖu

P. multocida: Pasteurella multocida

2.3 Kết quả định type Pasteurella multocida theo Carter (1955) -
Namioka (1961) 20
2.4 Kết quả định type P multocida 21
3.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng một số loại
kháng sinh 43
4.1 Tình hình nhiễm bệnh và tỉ lệ chết do tụ huyết trùng của chim, gà
cảnh tại Vờn Thú Hà Nội 45
4.2 Tỉ lệ chim, gà chết do Tụ huyết trùng theo tuổi ở Vờn Thú Hà Nội 47
4.3 Kết quả phân lập Pasteurella multocida gây bệnh từ chim, gà tại
Vờn Thú Hà Nội từ năm 2008- 2010. 50
4.4 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng
vi khuẩn Pasteurella phân lập đợc 53
4.5 Kết quả kiểm tra khả năng lên men đờng của các chủng vi
khuẩn P. multocida phân lập đợc từ Vờn Thú Hà Nội. 54
4.6 So sánh các đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn gây
bệnh phân lập đợc với các tác giả khác. 55
4.7 Kết quả định type các chủng P. multocida phân lập đợc 57
48 Tổng hợp kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella
multocida phân lập đợc trên chuột bạch (n= 25). 59
4.9 Kết quả xác định liều LD
50
trên chuột bạch của chủng Pas.1VT
phân lập đợc từ Vờn Thú Hà nội 61
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
vii

4.10 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng P.multocida phân lập đợc
từ Vờn Thú Hà Nội. 63
4.11 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu của lô vacxin 66
4.12 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin trên chuột 67

đợc 65

Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
1

1. Mở đầu

1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Vờn Thú Hà Nội là một cơ sở nuôi dỡng và trng bày động vật phục
vụ khách tham quan nâng cao dân trí. Đây còn là cơ sở để nghiên cứu khoa
học về động vật, là nơi bảo tồn và nhân nuôi, phát triển nguồn gen quý của
nớc ta. Trong số 96 loài và phân loài động vật đang đợc nuôi dỡng tại đây
có 35 loài thuộc diện quý hiếm và đặc hữu đợc ghi trong sách đỏ Việt Nam.
Trong nhiều năm qua vờn thú đ tập trung nghiên cứu bảo tồn đàn chim, thú
đặc biệt là các loài chim và gà cảnh. Tuy nhiên một trong những khó khăn
hiện nay là dịch bệnh còn rải rác xảy ra quanh năm và làm thế nào để phòng
chống dịch bệnh có hiệu quả trong điều kiện chăn nuôi của vờn thú.
Loài chim và gà cảnh đợc đa vào nuôi nhốt trong một không gian chật
hẹp, chúng luôn bị tác động bởi các yếu tố stress nh: Thời tiết, khí hậu, thức ăn
và các hoạt động x hội của con ngời làm thay đổi các tập tính tự nhiên, ảnh
hởng đến sức khoẻ, trạng thái sinh lý, dễ mắc các bệnh truyền nhiễm, dinh
dỡng, nội khoa .v.v dẫn đến tử vong. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm các giải
pháp và phòng trị bệnh cho các loài này trong điều kiện nuôi nhốt là cần thiết.
Một trong những bệnh truyền nhiễm xảy ra với chim và gà cảnh đó là
bệnh Tụ huyết trùng (Pasteurellosis). Bệnh đ gây chết chim và gà cảnh đặc
biệt trên các loài quý hiếm nh gà lôi lam mào trắng, gà lôi lam đuôi trắng, trĩ
khoang, công, trĩ sao và đ làm ảnh hởng lớn đến việc bảo tồn của loài này.

- Xác lập cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp về bệnh Tụ huyết
trùng ở loài chim, gà cảnh đặc hữu của Việt Nam góp phần trong công tác bảo
tồn nguồn gen của loài này.
- Đáp ứng yêu cầu và đòi hỏi cấp thiết của Vờn Thú Hà Nội về phòng
trị bệnh Tụ huyết trùng của đàn chim và gà cảnh.

Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
3

2. Tổng quan tài liệu

2.1. Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng gia súc, gia cầm trên
thế giới và trong nớc
Theo De Alwis (1992)[35], ngời đâu tiên phát hiện mầm bệnh gây Tụ
huyết trùng gà (Fowl cholera) là Louis Pasteur từ những năm 1880. Sau khi
phân lập đợc mầm bệnh từ xác gà chết, ông đ nuôi cấy trên môi trờng nớc
thịt rồi làm giảm độc lực để chế vacxin phòng bệnh.
Năm 1886 nhà giải phẫu học ngời Đức Hueppe nhận thấy những nét
tơng đồng của một loại bệnh ở các loài động vật khác nhau đợc gây ra do
cùng một loại vi khuẩn và Trevisan (1887) đ đề nghị đặt tên vi khuẩn là
Pasteurella để ghi nhớ công lao của Louis Pasteur.
Vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc giống (Genus): Pasteurella, loài
(Type species): Pasteurella multocida (Bergeys manual of Determinative
bacteriology- 1994). Trớc đây vi khuẩn Pasteurella sp. đợc gọi bằng nhiều
tên khác nhau nh Micrococcus gallicium (1883), Octopsis cholerae
gallinarrum (1885), Pasteurella cholerae gallinarum (1887), Pasteurella
avicida (1889), Bacterium bipolar multicidum (1893), Bacterium avicepticus
(1912). Đến năm 1939, Rosenbusch và Merchant [61] đặt tên vi khuẩn là
Pasteurella multocida và đợc thế giới chính thức công nhận.
Từ đó đến nay nhiều loại Pasteurella mới đợc liên tục đợc xác định:

Phấn (1986) [9] đ nghiên cứu về đặc tính của Pasteurella multocida và typ
huyết thanh học của chúng.
Theo Nguyễn Xuân Bình (1995)[1] bệnh Tụ huyết trùng ở Long An trên
gà 30 ngày tuổi tỉ lệ mắc thấp là 0,97%; giai đoạn 31- 60 ngày tuổi mắc cao
nhất 8,44%; giai đoạn trên 60 ngày tuổi mắc thấp hơn (5,08%).
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
5

Theo Lê Lập (1996) [5] tỷ lệ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida
trên gia cầm ở một số tỉnh miền Trung trung bình là 12,5%.
Dơng Thế Long và Lê Văn Tạo,(1995)[6] nghiên cứu phân lập đợc
các chủng P. multocida M
35
; M
36
, Q
16
ở Sơn La đ có kết luận M
35
, Q
16
, thuộc
type A, M
36
thuộc type D.
Để nâng cao hiệu lực của vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng, Phan
Thanh Phợng (1993)[12] đ nghiên cứu chế tạo vacxin Tụ huyết trùng gia cầm
từ chủng N
41
, tác giả Lê lập (1996)[5] nghiên cứu một số đặc tính sinh học và

đầu, không di động, không hình thành nha bào. Kích thớc vi khuẩn từ 0,6-
2,5à x 0,2- 0,4à, vi khuẩn thờng đứng riêng lẻ, đôi khi ghép đôi hoặc tạo
thành chuỗi ngắn (Pasteur, 1880)[71]; (Breed và cộng sự, 1952)[23].
Kích thớc và hình thái vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc của
chúng (Smith,1959)[65]. Theo một số tác giả khác nh Carter, 1967[29];
Rhoades và Rimler, 1992 [53], Rhoades, Rimler và Sandhu, 1992 [54], hình
thái vi khuẩn có xu hớng không ổn định trong quá trình nuôi cấy, nếu nuôi
cấy trong điều kiện không thuận lợi, hoặc cấy truyền nhiều lần, vi khuẩn có
hình sợi chỉ mặt khác, hình thái vi khuẩn còn thay đổi tuỳ theo sự hình thành
giáp mô của nó. Các vi khuẩn có giáp mô thờng lớn hơn các vi khuẩn không
có giáp mô.
Vi khuẩn Pasteurella trong các bệnh phẩm máu, các tổ chức của gia
súc, gia cầm bị bệnh, các canh khuẩn mới phân lập từ gia cầm mắc bệnh hoặc
chết trong các ổ dịch, đợc nhuộm bằng thuốc nhuộm Anilin thờng bắt màu
lỡng cực rõ rệt, nhuộm gram vi khuẩn bắt màu gram âm. Tính bắt màu lỡng
cực của vi khuẩn là do tế bào đang trong thời kỳ sinh sản, trớc khi phân chia
có sự tích tụ vật chất trong nguyên sinh chất tập trung ở 2 đầu, nên khi nhuộm
bằng Giemsa hoặc các thuốc nhuộm Anilin hoà tan khác tế bào vi khuẩn sẽ
bắt màu rõ ở hai đầu, còn phần giữa vi khuẩn không bắt màu.
Theo Wei và Carter, 1978 [67] tính bắt màu lỡng cực liên quan đến vị
trí của thể Chromatin trong vi khuẩn P. multocida.
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
7

Hình thái khuẩn lạc: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trờng thạch Dextrose
Starch agar (DSA) ở nhiệt độ 37
0
C, sau 24 giờ hình thành các khuẩn lạc hình
tròn, trơn, láng, đờng kình từ 1- 3mm, canh khuẩn có mùi đặc trng
(Rhoades và cộng sự, 1992)[53].

dạng là khuẩn lạc có dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc có dung quang
mầu xanh (Blue). Những khuẩn lạc có dung quang mầu xanh thờng không có
hoặc có ít giáp mô, không có độc lực hoặc có ít độc lực, khuẩn lạc dạng R có
dung quang màu xanh lơ.
Hughes (1930) nghiên cứu hình thái khuẩn lạc của 210 chủng P.
multocida phân lập từ gà, tác giả chia làm 3 type: Type thứ nhất có dung
quang, gây bệnh cấp tính, với tỷ lệ chết cao, type thứ 2, các khuẩn lạc có ánh
xanh, độc lực thấp, gây bệnh nhẹ. Type thứ ba có tính chất trung gian giữa 2
type trên về dung quang và độc lực.
Rosenbusch và Merchant, 1939 [62] cho biết, vi khuẩn P. multocida
nuôi cấy trên thạch máu hay tiêm truyền qua động vật, thấy khuẩn lạc tăng
cờng độ dung quang. Các chủng cờng độc, mới phân lập có dung quang
mạnh. Tác giả cho rằng hiện tợng dung quang của khuẩn lạc liên quan tới
tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng có bớc
sóng nhất định có trong vi khuẩn. Hiện tợng sắc cầu vồng có liên quan tới
khả năng tạo giáp mô vi khuẩn.
2.2.2 Đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn Pasteurella multocida
2.2.2.1. Đặc tính nuôi cấy và môi trờng dinh dỡng vi khuẩn
Pasteurella multocida là loại vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện,
nhng thích hợp ở môi trờng hiếu khí hơn, đặc biệt cộng thêm 5% Carbon
dioxide- CO
2
(Carter, 1984) [32]. Vi khuẩn mọc tốt ở nhiệt độ 37- 38
0
C,

pH
hơi kiềm từ 7,2 đến 7,4. Vi khuẩn sẽ mọc tốt hơn nếu bổ xung thêm 10%
huyết thanh động vật. Môi trờng tốt nhất để nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .

10

- Nhóm 1: gồm các chủng P. multocida phân giải Arabinose và
Dulcitol, không phân giải Xylose.
- Nhóm 2: gồm các chủng phân giải Xylose, không phân giải Arabinose
và Dulcitol.
- Nhóm 3: gồm tất cả các chủng phân giải cả Arabinose, Dulcitol và
Xylose.
Tác giả còn cho thấy khi nuôi cấy lâu trong phòng thí nghiệm, vi khuẩn
mất khả năng phân giải Arabinose và Xylose. Tất cả các chủng nghiên cứu trên
đều sinh Indol, không di động, không dung huyết và không phân giải Urea.
Dorsey, 1963 [37] nghiên cứu 409 mẫu P. multocida phân lập từ gia
cầm cho thấy 81,42% thuộc nhóm I; 16,87% thuộc nhóm II; 1,71% thuộc
nhóm III. Ngoài ra có 23 mẫu phân lập không thể xếp loại.
Theo Carter, 1984 [32] Vi khuẩn Pasteurella multocida dơng tính
trong các phản ứng Nitrat, Indol, Oxydaza, Catalaza. Âm tính trong các phản
ứng dung huyết, di động, Gelatin, MacConkey, không lên men các loại đờng
Lactoza, Mantoza, Arbinoza, Dulcitol. Khả năng lên men Saccaroza và
Mannit, không lên men Lactoza là rất quan trọng để phân biệt Pasteurella
multocida với Salmonella (không lên men Saccaroza) và với Ecoli,
P.haemolytica (lên men Lactoza). Heddleston và cộng sự, 1972 [44] nghiên
cứu 948 mẫu P. multocida phân lập từ gia cầm, kết quả phản ứng sinh hoá học
nh bảng trang sau:
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
11

Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá học của Pasteurella multocida
TT

Phản ứng % (+) TT Phản ứng % (+)

Salicin 0
Heddleston và cộng sự, (1972)[44]; Rhoades và cộng sự (1992)[53] căn
cứ vào tính chất sinh hoá để phân biệt các loài vi khuẩn thuộc giống
Pasteurella theo bảng sau:
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
12

Bảng 2-2. Đặc điểm phân biệt các Pasteurella khác nhau
Pasreurella
Phản ứng
multocida haemolytica

anatipestifer

gallinarum
Dung huyết - + - -
Macconkey - + - -
Indol + - - -
Di động - - - -
Catalase + + + -
Oxidaza + + + +
Urease - - biến động -
Glucose + + - +
Maltose - - - +
Lactose - + - -
Sucrose + + - +
Gelatin - - - -

2.2.3. Kháng nguyên và độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida
Pasteurella là loại vi khuẩn sinh giáp mô, đó chính là yếu tố độc lực

Lipopolysaccharide và một phức hợp Protein (Rimler và Rhoades, 1989) [58]
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên giáp mô, bằng phản ứng
ngng kết gián tiếp hồng cầu, Carter, 1955 [25], Rimler và Rhoades, 1987
[57] đ phân chia P. multocida thành 5 Serotype kháng nguyên giáp mô khác
nhau là Serotype A, B, D, E và F.
Woolcock, 1992 [68] cho rằng giáp mô của P. multocida type A cấu tạo
bởi Acid Hyaluronic có liên kết mật thiết với các thành phần khác nh
Polysaccharide, Protein và Lypit.
Acid Hyaluronic không gây hoạt hóa kháng thực bào nhng chất tiết
giáp mô có thể ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân bò (Ryu và cộng sự,
1984)[63]. Nếu tách Acid Hyaluronic khỏi giáp mô sẽ tăng khả năng bám
dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào động vật và tăng tính mẫn cảm của vi
khuẩn đối với đại thực bào.
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
14

Theo nghiên cứu của Bain, 1954 [18] thì thành phần giáp mô có chứa
Acid Hyaluronic và một lớp Polysaccharide giáp mô là yếu tố bề mặt quan
trọng không chỉ đối với P. multocida mà còn đối với một số vi khuẩn gram âm
gây độc khác. Nhng nếu chiết tách Polysaccharide tinh khiết thì không gây
độc và không bảo vệ đợc chuột hay thỏ.
Theo Esslinger và cộng sự, 1992 [38], các chủng P. multocida Serotype
A đều có tính bám dính mạnh đối với tế bào Hela, trong khi đó các Serotype
B,D,E có độ bám dính thấp hơn nhiều
Theo Snipes và Hirsh, 1986 [66], giáp mô vi khuẩn P. multocida có khả
năng hoạt hoá bổ thể, sự hoạt hoá bổ thể không ảnh hởng đến vai trò của các
tế bào đại thực bào đối với vi khuẩn
Để quan sát giáp mô ngời ta nhuộm vi khuẩn bằng mực ấn Độ, hoặc
dùng phơng pháp nhuộm Hiss. Có thể nhận dạng giáp mô bằng quan sát
dung quang khuẩn lạc, theo Rimler, 1992 [59] nếu các khuẩn lạc có dung

trúc của các loại kháng nguyên: Polysaccharide (CPS), Lypopolysaccharide
(LPS

), kháng nguyên Protein, Acid amin.
+ Lypopolysaccharides (LPS): LPS của vi khuẩn Pasteurella multocida
có tính chất về hoá học và sinh học giống nh trong nhiều loài vi khuẩn gram
âm nh những kháng nguyên LPS đ có liên quan đến sự tạo kháng thể bảo vệ
cho động vật và cũng đ đợc dùng nh cơ sở hoá học cho hệ thống phân loại
kháng nguyên thân. LPS thì đ đợc chiết tách từ nhiều chủng khác nhau của
vi khuẩn Pasteurella multocida, tơng tự nh vậy thì LPS cũng đợc chiết
tách từ những vi khuẩn cùng họ, những phân tích về hoá học thấy thành phần
LPS từ Pasteurella multocida bao gồm lipid A, 2-keto-3-deoxyoctonate
(KDO), l- glycero-D-mannoheptose, glucose và glucosamine ( Rimler và cộng
sự 1987 [55]).
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
16

Những loại đờng khác nh Galactose, Rhamnose, D-glycero-D-
mannoheptose và Galactosamine cũng thờng thấy trong LPS của những
chủng Pasteurella khác nhau. Ngoài ra còn có 4 typ đờng khác đ đợc nhận
diện bởi Erler và cộng sự (1977).
Rimler và Rhoades, (1989)[58] cho rằng: LPS tinh khiết không gây
đợc miễn dịch tạo kháng thể ở chuột, trâu bò và thỏ, nhng là chất gây miễn
dịch chính chống lại bệnh Tụ huyết trùng của gà tây là phức hợp kháng
nguyên Protein - Lypopolysaccharide
+ Polysaccharide tinh khiết (CPS ):
CPS tinh khiết của vi khuẩn Pasteurella multocida là một kháng nguyên
và nó có thể phản ứng kích thích taọ kháng thể chống lại toàn bộ vi khuẩn. Riêng
một mìmh CPS tinh khiết sản sinh ra một ít hay không có hoạt động sinh miễn
dịch bảo vệ cho chuột (Bainvà Knox, 1961; Reber và Heddleston 1974; Schmerr