ĐỀ CƯƠNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHẦN I. CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
Câu 1. Khái niệm về Enzym giới hạn? Cách đặt tên, kiểu cắt, tần suất cắt? Ứng
dụng của Enzym giới hạn trong công nghệ gen?
Trả lời
1. Khái niệm Enzym giới hạn (Restriction enzym) – RE
- Là enzym chỉ cắt ADN tại những trình tự đặc hiệu (vị trí nhất định) do chúng chỉ
nhận biết được 1 trình tự đặc trưng và cắt trình tự đó tại 1 điểm cố định
- Các RE có vị trí cắt rất đặc hiệu nhưng lại không đặc hiệu về loài nghĩa là chúng
có khả năng cắt bất kỳ loại ADN nào tách chiết từ các nguồn khác nhau.
2. Cách đặt tên (cho RE loại II: loại phổ biến nhất hiện nay)
Tên gọi của các RE được quốc tế quy định:
- Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tiên trong tên chi vi khuẩn mà từ đó RE được phát
hiện
- Tiếp theo là 2 chữ đầu của tên loài không viết hoa
- Sau đó là một chữ viết hoa chỉ tên chủng
- Cuối cùng là chữ số La Mã chỉ thứ tự RE được phát hiện
3. Kiểu cắt (cho RE loại II)
Có 2 kiểu:
 Cắt tạo ra đầu bằng:
+ Cắt cả 2 mạch ADN ở cùng 1 vị trí
+ Các đoạn cắt theo kiểu này không có khả năng tự kết hợp lại mà phải dùng
Enzym nối hoặc adaptor đặc dụng cho từng loại enzym
 Cắt tạo đầu so le:
+ Cắt 2 mạch ADN ở vị trí lệch nhau
+ Tạo ra các đoạn ADN có các đầu so le có trình tự nu hoàn toàn bổ sung
cho nhau nên có thể tự nối với nhau, các đầu so le gọi là đầu dính.
4. Tần suất cắt (cho RE loại II)
Giả thiết sự sắp xếp của các bazo là ngẫu nhiên thì xác suất để 1 đoạn trình tự
được nhận biết là 1/4
n

- Tất cả vector nhân dòng phải có một hay nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc như
tính kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo màu => Nhận biết, chọn lọc
được những tế bào đã nhận được vecto nhân dòng.
- Các vector nhân dòng phải có ít nhất một điểm tái bản, để đảm bảo chúng có
thể tự nhân lên trong tế bào chủ mới.
3. Cấu trúc di truyền
- Là các phân tử ADN nhỏ, mạch vòng, nằm ngoài NST của TB vi khuẩn và có
khả năng tự nhân bản do có chứa 1 trình tự như 1 gốc tái bản ADN
- Thường chứa 1 số gen có tính đặc thù rất cao
+ Một số mang thông tin về giới tính và có thể chuyển từ TB này → TB
khác qua tiếp hợp
+ Một số mang đặc tính chống chịu với kháng sinh
+ Một số có gen đặc hiệu có khả năng sử dụng các chất trao đổi bất thường
+ Một số không mang gen mã hóa bất kỳ chức năng nào
- Kích thước plasmid dao động từ 1→vài trăm kb
4. nguyên tắc chọn lọc của vector plasmid
Câu 3. Nhân dòng gen (Cloning gen) là gì ? Trình bày kỹ thuật nhân dòng gen bằng
vector plasmid?
Trả lời
1. Khái niệm nhân dòng gen
Sau khi tách chiết ADN, cắt chúng bởi các E. giới hạn thì công đoạn quan trọng
tiếp theo là nhân bản các đoạn ADN đã cắt thành nhiều bản đồng nhất và sắp xếp
chúng thành từng dòng riêng. Quá trình này gọi là tách dòng gen hoặc nhân dòng gen.
2. Trình bày kỹ thuật nhân dòng gen bằng vector plasmid
 Bước 1. Chuẩn bị Plasmid
• Chọn plasmid : thường dùng pUC có các đặc tính sau :
+ Chứa đoạn gen kháng kháng sinh (ampicillin)
+ Chứa đoạn gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen này mã hóa cho
β galactosidase, enzym này + X - gal sẽ cho màu xanh)
• Cắt pUC = RE cùng loại đã cắt ADN

Câu 4. Trình bày phương pháp lai Southern Blot?
Trả lời
1. Khái niệm
- Được Edwin Southern đề xuất năm 1975
- Cho phép xác định sự có mặt của những trình tự nu/ 1 đoạn ADN trong một
hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò (ADN mẫu dò) đã
được đánh dấu P
32
với đoạn ADN có chứa trình tự bổ sung với mẫu đó
2. Các bước trong Southern Blot: bao gồm 7 bước
 Bước 1: Chiết tách ADN, cắt ADN => thu được hỗn hợp các đoạn cắt AND
khác nhau
 Bước 2: Điện di hỗn hợp/ gel agarose (nồng độ 0,8% + đẹm TBE) ở hiệu
điện thế 1,5V/cm chiều dài gel
 Bước 3: Làm biến tính (tách thành sợi đơn) các băng ADN trên gel điện di
= cách xử lý gel điện di 20ph trong NaOH 0,4M
 Bước 4: Đặt gel lên hệ thống giá chuyển → in các ADN đã biến tính lên tấm
lọc (màng lai). Tấm lọc này sẽ giữ chặt các đoạn ADN được chuyển lên. Quá trình này
được thực hiện với dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,4M
 Bước 5 : Lai các đoạn AND trên màng lai với dung dịch mẫu dò đã được
đánh dấu (P
32
hoặc chất gây phản ứng màu), thực hiện ở buồng lai (65 - 68
0
C trong 6 –
12h)
 Bước 6: Sau kết thúc phản ứng lai, đem rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò
không tham gia phản ứng lai
 Bước 7: Phát hiện vị trí lai nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Nơi xảy ra phản
ứng sẽ mang hoạt tính phóng xạ. Khi đặt phim lên tấm lọc, nơi có phản ứng lai sẽ phát

 Bước 2: Đánh dấu phóng xạ P
32
tại đầu 5’
 Bước 3: Chia các sợi đơn thành 4 mẫu riêng rẽ và xử lý với hóa chất đặc hiệu để
phá hủy 1 hoặc 2 trong 4 loại bazơ (tức là thay đổi trật tự gốc phosphat)
 Bước 4: Xử lý tiếp các mẫu này với piperillin để bẻ gãy ADN tại các bazơ đã bị
phá hủy
 Bước 5: Điện di riêng rẽ 4 mẫu này. Khi đó sự phân bố các đoạn này trên điện di
đồ tương ứng với kích thước của chúng có chiều dài hơn kém nhau 1 nu.
 Bước 6: Đưa gel hiện hình rồi đọc các băng hình trên phim để xác định trình tự
sợi đơn ADN
Đọc tiếp mạch bổ sung còn lại
2. Phương pháp Sanger (phương pháp enzym)
Dựa vào hoạt động của enzym ADN polymerase (xúc tác để gắn các đoạn
ADN chỉ chênh lệch nhau 1 nu)
- Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá
trình kéo dài ADN khi tổng hợp. Nhân tố này là các 2,3 didesoxynucleotit
triphosphat (ddNTP)
+ Các phân tử này có thể kết hợp vào chuỗi ADN đang tổng hợp bình
thường nhưng không kết hợp được với phân tử desoxynucleotit
triphosphat (dNTP) tiếp theo
+ Khi trộn lẫn lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp
nhờ enzym ADN polymerase → cho một loạt các đoạn ADN được kết
thúc 1 cách đặc hiệu bởi gốc ddNTP
- Tiến hành thí nghiệm tương tự cho 4 phản ứng tổng hợp ADN tách rời, mỗi
phản ứng bổ sung 1 loại ddNTP khác nhau → các đoạn ADN kết thúc bằng
gốc ddNTP và hơn kém nhau 1 nu
- Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng → Ta có thể xác định trình tự
chuỗi ADN.
3. Giải trình tự gen bằng phương pháp tự động

0
C, 2 - 5ph
Gắn mồi vào các sợi đơn
(30 - 65
0
C, 30s)
Biến tính mẫu ADN thành các sợi
đơn (94
0
C trong 5ph)
Một chu trình gồm khoảng 30 – 35 chu kỳ là đủ, nếu kéo dài thêm chu kỳ không
những số sản phẩm tăng không đáng kể mà tăng thêm cả sự sai sót.
 Các yêu cầu cần thiết của PCR
- 2 mồi phải có trình tự bổ sung với 2 đầu của đoạn ADN cần nhân dòng (mối
xuôi và mồi ngược)
- Khoảng cách giữa 2 mồi này không quá 1kb để tránh hiện tượng bắt cặp giữa
các mồi.
- Các mồi có kích thước ít khác nhau
 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
- Độ tính sạch của ADN khuôn
- Sự hoạt động của RE
- Nồng độ các loại nu
- Nồng độ của các dung dịch đệm
2. Ứng dụng của kỹ thuật PCR
- Giúp tách nhanh và chính xác từng gen hoặc từng đoạn ADN riêng biệt
- Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan
trọng
- Chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác các bệnh di truyền
- Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm
- Khôi phục các gen của các loài sinh vật cổ xưa

• Các mARN sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành liên kết A – T
• Dùng dung dịch NaCl để đẩy tARN + rARN ra khỏi phễu
 Tách riêng được mARN
 Bước 2 - Giải phóng mARN khỏi phễu : dùng dung dịch đệm Tris EDTA cho
chảy qua phễu, các mARN sẽ được giải phóng do liên kết A – T bị phân giải
 Bước 3 - Dùng các mARN này làm khuôn với sự có mặt của Enzym sao chép
ngược + các nguyên liệu → Quá trình tổng hợp ADN xảy ra
=> Thu được các cADN
 Bước 4 - Các cADN sẽ tiếp tục được nhân dòng và tập hợp thành các thư viện
cADN. Để tìm ra các cADN cần thiết, người ta có thể sử dụng các phương
pháp lai ADN hoặc phản ứng với protein kháng thể.
PHẦN II. CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT
Câu 1. Định nghĩa về công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ? Khả năng ứng dụng của
nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân và chọn tạo giống cây trồng ?
Trả lời
1. Định nghĩa về công nghệ nuôi cấy mô TBTV
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là phạm trù khái niệm để chỉ
chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật
trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng.
Bao gồm :
• Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành
• Nuôi cấy cơ quan : rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh
• Nuôi cấy phôi : phôi non và phôi trưởng thành
• Nuôi cấy mô sẹo (callus)
• Nuôi cấy TB đơn
• Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong TBTV sau khi tách vỏ (nuôi
cấy TB trần)
2. Khả năng ứng dụng
Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân và
chọn tạo giống cây trồng được thể hiện qua bảng dưới đây