TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





BÁO CÁO
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Chọn lựa điều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase
từ vi khuẩn Bacillus licheniformis
Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS. Ngô Xuân Mạnh
Khoa Công nghệ thực phẩm
Trường ĐHNN HN
Sinh viên thực hiện : Ngô Thị Mai
Lớp : CNSH - K51
“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu
cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học".
HÀ NỘI - 2010
ii
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các
thầy, cô giáo, các đơn vị tập thể, cá nhân trong và ngoài trường.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lòng kính trọng tới PGS.TS
Ngô Xuân Mạnh, người đã tận tình dìu dắt, dạy bảo em trong suốt quá trình thực hiện
đề tài và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn sự nhiệt tình chỉ bảo, dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi của
các thầy cô khoa Công nghệ thực phẩm, Khoa công nghệ sinh học trong suốt quá trình tiến
hành đề tài.
Em xin gửi lởi cảm ơn chân thành đến các anh chị khoá trên cũng như toàn thể

2.1.2.1. Tính chất vật lí 4
Hình 2.4: chitosan 5
2.1.2.2. Tính chất hoá học của chitosan 5
2.2. Enzyme chitosanase 8
2.2.3.1. Khối lượng phân tử 9
Bảng 2.1: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 9
2.2.3.2. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 9
Theo Fukamizo và Brezinski (1997) đã xác định được các sản phẩm dị vòng thu được
từ quá trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase là
một enzyme chuyển hoá 9
Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào vị trí β-(1-4)-
glycoside giữa hai D-Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng tấn công
vào liên kết này giữa hai phân tử D-Glucosamine và giữa D-Glucosamine với phần N-
ii
Acetyl-D-Glucosamine còn lại. Bảng 2.2 thể hiện vị trí liên kết bị tấn công bởi một số
chitosanase 10
Bảng 2.2: Kiểu phân cắt của các loại chitosanase 10
Hình 2.5: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 11
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn ưa nhiệt 11
2.3.1.1. Khái niệm 11
Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có nhân nguyên thuỷ 11
2.3.1.2. Hình thái và kích thước 11
Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau. Đường kính của
phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0.2-2µm, chiều dài cơ thể khoảng 2.0-8.0µm.
Hình thái vi khuẩn rất đa dạng : hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn, hình có
cuống… 12
2.3.1.3. Phân loại 12
Theo Vũ Thị Minh Đức (2001), có thể phân loại vi khuẩn theo hai tiêu chí sau: 12
-Dựa vào hình dạng tế bào vi khuẩn chia thành: 12
+Cầu khuẩn (coccus). Tế bào có hình tròn. Trong cầu khuẩn gồm có: Đơn cầu khuẩn,

Thành phần protein và lipid của màng tế bào cũng có vai trò quyết định đến tính chịu
nhiệt của vi sinh vật. Ribosom là nhà máy tổng hợp protein của tế bào, bản chất
protein của ribosom và khả năng chịu nhiệt của nó do các gen chịu nhiệt trong bộ gen
của vi sinh vật điều khiển. Nhiệt độ biến tính protein của ribosom càng cao thì khả
năng chịu nhiệt của vi sinh vật càng cao (Lê Gia Huy và cộng sự, 1997) 13
2.3.4.1. Hình thái khuẩn lạc 13
Bao gồm màu sắc, hình dạng , kích thước khuẩn lạc. Nó đặc trưng cho từng nhóm vi
khuẩn 13
2.3.4.2. Nhuộm Gram 13
Dựa vào sự bắt màu của vi khuẩn đối với thuốc nhuộm mà chia thành 2 dạng : Gram
(-) và Gram (+) 13
2.3.4.3. Hình thái tế bào vi khuẩn 13
iv
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ta sẽ thấy được hình dạng tế bào vi khuẩn. Dựa
vào đó mà có thể phân vi khuẩn thành các dạng: Hình cầu, hình que, hình dấu phẩy,
hình xoắn… 13
2.3.4.4. Khả năng di động 13
Có loài vi khuẩn không di động, một số ít di động, một số khác lại di động rất mạnh.
Để nhận biết được khả năng này, ta quan sát tiêu bản sống của vi khuẩn dưới kính hiển
vi sẽ nhìn thấy một cách chính xác. Tuy nhiên, ta cũng có thể quan sát hình thái khuẩn
lạc để dự đoán được khả năng di động của vi khuẩn: Những khuẩn lạc có viền nhẵn là
những tế bào vi khuẩn không có tiên mao nên không có khả năng di động, những
khuẩn lạc có viền không nhẵn là tế bào vi khuẩn có tiên mao nên có khả năng di động
(Trần Thị Thanh, 1995) 14
2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi
sinh vật 14
- Nguồn Cacbon: Thường sử dụng đường làm nguồn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các
vi sinh vật dị dưỡng. Trong công nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn cacbon rẻ tiền và
rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Muốn thu được
enzyme cao thì phải có cơ chất để cảm ứng giúp vi sinh vật có thể sinh tổng hợp

3.2.7.2. Quan sát hình thái tế bào 22
Tiến hành nhuộm Gram, được thực hiện như sau: 22
- Phiến kính được rửa sạch và làm khô. Nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính, dùng
que cấy lấy một lượng nhỏ vừa đủ tế bào vi sinh vật rồi dàn đều trong giọt nước 22
- Hong khô và cố định vết bôi 22
- Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian 1% hay tím kết tinh (1 – 2 phút), để nghiêng cho
thuốc nhuộm thừa cháy xuổng 22
- Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi (1 – 2 phút) 22
- Rửa tiêu bản bằng nước và tấy bằng ethanol 22
- Nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch Fuschin 0.1% hay safranin trong 1 – 2 phút .22
- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô trong không khí, soi với vật kính dầu 22
Trên tiêu bản nhuộm đúng, vi khuẩn G+ bắt màu tím, vi khuẩn G- bắt màu đỏ 22
vi
Điều kiện nuôi cấy là một yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh trưởng
phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều kiện
nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường,
nhiệt độ, thời gian nuôi cấy… Từng điều kiện nuôi cấy riêng rẽ đều có ảnh hưởng đến
hoạt động sống của vi khuẩn. Tìm được giá trị tối ưu của từng yếu tố riêng rẽ nhưng
chưa chắc sự kết hợp của từng yếu tố riêng rẽ đó đã là tìm được điều kiện tốt nhất cho
vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, bởi lẽ giữa các yếu tố riêng rẽ đó lại có sự tác động
tương tác lẫn nhau. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành chọn lựa điều kiện của tổng hợp
các yếu tố nuôi cấy cho vi khuẩn. Trong điều kiện có hạn, và căn cứ vào các tài liệu đã
công bố và một thí nghiệm khảo sát về khoảng nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất chitosan
cho sự phát triển của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành tìm điều kiện nuôi cấy gồm ba yếu
tố: nồng độ cơ chất chitosan trong khoảng [0.1%; 0.3%], pH môi trường trong khoảng
[7; 9] và nhiệt độ [ 400C; 560C]. 23
Từ phương trình hồi qui có dạng: 23
Y =b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11X1X1 + b22X2X2 + b33X3X3 + b12X1X2 +
b13X1X3 + b23X2X3 23
Trong đó: X1 - biến số mã hoá của biến thực Z1-nhiệt độ nuôi cấy (T0C), khoảng khảo

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1. Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của mẫu giống vi khuẩn Bacillus
licheniformis 27
Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính để thử hoạt tính sơ
bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính bằng cách đổ một lớp
mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là enzyme đặc hiệu đối với
cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh chitosanase ngoại bào sẽ tiết
enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan tạo nên vòng phân giải trên
môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân giải càng to, rộng và sáng 27
Hình 4.1: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis 27
Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ mẫu giống
vi khuẩn Bacillus licheniformis và các giống vi khuẩn khác 28
viii
Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống Bacillus
licheniformis 28
Bảng 4.2: Hoạt tính chitosanase của các mẫu được nghiên cứu 29
Đồ thị 4.1: Hoạt tính chitosanase của 4 mẫu được nghiên cứu 29
4.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis
30
Sau khi cấy trang mẫu giống Bacillus licheniformis và nuôi ở nhiệt độ 480C trong
24h, hình thái khuẩn lạc quan sát được như Hình 4.3, Hình 4.4 30
30
30
Hình 4.3, 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis 30
Khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis đầu tiên có màu trắng sau
thấy có váng tím trên bề mặt, khuẩn lạc tròn, nhăn, thường mọc thành cụm 30
Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học với độ phóng
đại 100 lần, hình thái tế bào quan sát được như Hình 4.5 31

Quá trình trao đổi chất mạnh nên sinh khối vi sinh vật và các sản phẩm trao đổi chất
đạt cao nhất ở pha này. Vì vậy trong sản xuất chúng ta nên chú ý đến pha này, tạo điều
kiện thuận lợi nhằm thu được lượng sản phẩm nhiều nhất. Từ 24-30h tốc độ phát triển
bắt đầu chậm lại và số lượng tế bào tương đối ổn định, đây được coi là pha ổn định của
vi sinh vật, vì ở pha này, quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào
mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Nguyên nhân của pha ổn định là sự tích luỹ các
sản phẩm trao đổi chất có hại cho vi sinh vật và việc cạn kiệt chất dinh dưỡng. Từ 30h
trở đi, số lượng tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis giảm. Đây là pha tử
vong của vi sinh vật. Nguyên nhân của pha này chưa thật rõ ràng nhưng có liên quan
đến điều kiện bất lợi của môi trường cũng như sự cạn kiệt về nguồn dinh dưỡng 33
Như vậy, chất lượng giống tốt nhất và thích hợp nhất cho việc tiếp giống vào môi
trường lên men là ở giai đoạn 8-24h (pha log) trên môi trường hoạt hoá hoặc nhân
giống 33
x
Điều kiện nuôi cấy là yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh trưởng và
phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều kiện
nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường,
nhiệt độ, thời gian nuôi cấy…. Các yếu tố này có tác động khác nhau đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme chitosanase. Qua tham khảo một số tài liệu và các thí nghiệm
khảo sát được, chúng tôi nhận thấy yếu tố nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan là
những yếu tố có ảnh hưởng mạnh hơn cả đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
chitosanase. Trong thực tế, hoạt tính của enzyme chitosanase thu được không chỉ bị
ảnh hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu
tố với nhau. Vì thế nếu chỉ dựa trên các nghiên cứu rời rạc để đưa ra điều kiện nuôi
cấy tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi khuẩn thì kết quả sẽ
không đạt độ chính xác cao. Do vậy chúng tôi tiến hành qui hoạch thực nghiêm nhằm
lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosan từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis. Chọn ba yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất đến khả năng sinh
hoạt tính chitosanase của vi khuẩn là nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan đưa vào
môi trường. Chúng tôi sử dụng phương pháp qui hoạch trực giao bậc hai, cấu trúc có

Trên Đồ thị 4.3, khi cố định yếu tố X3 = 0.2% (nồng độ cơ chất chitosan) và biến
đổi hai yếu tố X1 trong khoảng ( 40 – 560C), X2 trong khoảng (7 – 9) thì hoạt tính
enzyme chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại nhiệt độ 480C, pH = 8. 36
37
Đồ thị 4.4. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ, 0C), X3 (nồng độ cơ chất chitosan, %) và
Y (hoạt tính enzyme, U/ml) 37
Trên Đồ thị 4.4, khi cố định yếu tố X2 = 8 (pH) biến đổi hai yếu tố X1 trong
khoảng ( 40 – 560C), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme
chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại 48 0C và nồng độ cơ chất chitosan là
0.2% 37
37
Đồ thị 4.5. Mối quan hệ của X2 (pH), X3 (nồng độ cơ chất chitosan,%) và Y (hoạt
tính enzyme, U/ml) 37
xii
Trên Đồ thị 4.5 khi cố định yếu tố X1 = 48 (nhiệt độ) biến đổi hai yếu tố X2 trong
khoảng ( 7 – 9), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase
đạt cao nhất là 1.697U/ml tại pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2% 38
Từ mặt phẳng trong Đồ thị 4.3, Đồ thị 4.4 và Đồ thị 4.5 và Bảng 4.4, chúng tôi kết
luận rằng khi xét đồng thời cả ba yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất chitosan thì giá
trị Y sẽ đạt cực đại khi X1 = 48, X2 = 8 và X3 = 0.2. Vậy điều kiện nuôi cấy tối ưu để
vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh tổng hợp được enzyme chitosanase có hoạt tính
cao tại 480C, pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi trường nuôi cấy là
0.2% 38
4.4. Thu nhận enzyme chitosanase 38
Thực hiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis ở điều kiện nuôi cấy tối ưu đã
chọn lựa được ở trên ( tại 480C, pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan = 0.2), dịch nuôi
cấy được ly tâm loại bỏ cặn và thu lại phần dịch trong chính là enzyme thô. Hoạt tính
chitosanase thu được trong lần nuôi cấy này là 1.780 U/ml 38
Dịch enzyme thô thu được sau quá trình nuôi cấy có nồng độ protein thấp, do vậy khi
thực hiện các bước tinh sạch tiếp theo như tủa phân đoạn bằng cồn hay muối sẽ khó

Sau khi cô đặc, chúng tôi tiến hành tinh sạch sơ bộ enzyme của mẫu giống vi khuẩn
này. Việc xác định hoạt tính enzyme chitosanase và hàm lượng protein ở từng phân
đoạn nhằm tìm ra phân đoạn cho hoạt tính enzyme cao nhất. Đây là việc rất quan trọng
vì nó quyết định đến hiệu suất thu hồi và chất lượng enzyme. Do vậy, chúng tôi tiến
hành thực hiện tủa phân đoạn bằng hai phương pháp là tủa cồn và tủa bằng muối
amoni sunphate. Phương pháp thực hiện như đã trình bày trong phần phương pháp
nghiên cứu, lấy 50ml dịch enzyme đã cô đặc để tủa phân đoạn, kết tủa thu được đem
hoà tan trong 5ml đệm phosphate pH = 6 (với tủa phân đoạn bằng cồn) và hoà tan
trong 5ml đệm acetate pH =5.5(với tủa phân đoạn băng muối amoni sunphate) 39
Khảo sát hai phương pháp tủa phân đoạn bằng cồn và muối amoni sunphate, thấy rằng
cả hai phương pháp đều có khả năng phân tách protein thành các phân đoạn thể hiện
hoạt tính của chitosanase khác nhau 39
a, Tủa cồn 39
Kết quả xác định hoạt tính chitosanase, hoạt tính riêng của các phân xuất tủa cồn được
thể hiện trong Bảng 4.7 40
xiv
Bảng 4.7: Hoạt tính chitosanase, nồng độ protein và hoạt tính riêng của các phân
xuất tủa bằng cồn 40
Số liệu trong Bảng 4.7 cho ta thấy ở phương pháp tủa cồn, các phân xuất 0-30% và 30-
40% thì hoạt tính riêng của mẫu giống vi khuẩn này tăng dần khi tăng nồng độ cồn:
phân xuất 0-30%, hoạt tính riêng chỉ đạt 4.35U/ml và hiệu suất thu hồi là 31.57% mà
đến phân xuất 30-40%, hoạt tính riêng đạt 9.12U/ml và hiệu suất thu hồi là 30.82%.
Nhưng đến phân đoạn từ 60-70% trở đi thì hoạt tính riêng lại giảm dần, ở phân đoạn
50-60% hoạt tính riêng là 38.73U/ml và hiệu suất thu hồi đạt 67.29%, thì ở phân đoạn
60-70% hoạt tính riêng giảm còn 20.21U/ml và hiệu suất thu hồi cũng giảm còn
40.28%. Như vậy, phân đoạn thu enzyme có hoạt tính riêng cao nhất là phân đoạn 50-
60% ( 38.73 U/mg). Tuy nhiên ở phân đoạn 40-50% hoạt tính riêng cũng rất cao, đạt
33.06 U/ml nên chúng tôi chọn cả hai phân đoạn 40-50% và 50-60% là những phân
đoạn có hiệu suất thu hồi và tinh sạch enzyme cao để thu hồi chitosanase từ mẫu giống
vi khuẩn Bacillus licheniformis. 40

dụng muối amoni sunphate cho thấy hiệu quả phân đoạn enzyme cao hơn. Đối với tủa
phân đoạn bằng cồn thì hoạt tính riêng đạt cao nhất ở phân đoạn 50-60% là 38.73U/ml
và hiệu suất thu hồi chỉ là 67.28%. Trong khi đó, Tủa bằng muối ở phân đoạn 50-60%
hoạt tính riêng đạt cao nhất là 59.17U/ml và hiệu suất thu hồi enzyme khá cao đạt tới
84.51%. Do vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn phương pháp tủa muối để tách enzyme
chitosanase trong dịch enzyme thô, phân đoạn được lựa chọn là 50-70%. Kết quả được
trình bày trong Bảng 4.9 42
Bảng 4.9: Hoạt tính enzyme chitosanase từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis
tủa bằng muối amoni sunphate trên phân xuất 50- 70% 42
Như vậy, enzyme thu được trong phân đoạn 50-70% muối cho hoạt tính riêng (81.28)
cao hơn 4.5 lần so với hoạt tính riêng của enzyme trong dịch thô ban đầu (18.12U/ml).
Mức độ tinh sạch đạt 4.5 lần và hiệu suất thu hồi enzyme đạt 91.40% 42
Phần V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Đề nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
xvi
4
4
5
5
xvii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tên đầy đủ
COS Chitosan oligosaccharid
GlcN D-glucosamine
GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
DDA Mức độ deacetyl hóa
(degree of deacetylation)

Hình 4.1: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis 27
Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống Bacillus
licheniformis 28
Đồ thị 4.1: Hoạt tính chitosanase của 4 mẫu được nghiên cứu 29
Hình 4.3, 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis 30
Hình 4.5: Đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 31
Bacillus licheniformis 31
Đồ thị 4.2: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian
33
Đồ Thị 4.3. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ,0C), X2 (pH) và Y (hoạt tính enzyme,
U/ml) 36
Trên Đồ thị 4.3, khi cố định yếu tố X3 = 0.2% (nồng độ cơ chất chitosan) và biến đổi
hai yếu tố X1 trong khoảng ( 40 – 560C), X2 trong khoảng (7 – 9) thì hoạt tính
enzyme chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại nhiệt độ 480C, pH = 8. 36
Đồ thị 4.4. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ, 0C), X3 (nồng độ cơ chất chitosan, %) và Y
(hoạt tính enzyme, U/ml) 37
Trên Đồ thị 4.4, khi cố định yếu tố X2 = 8 (pH) biến đổi hai yếu tố X1 trong khoảng
( 40 – 560C), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase đạt
cao nhất là 1.697U/ml tại 48 0C và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2% 37
37
xx
Đồ thị 4.5. Mối quan hệ của X2 (pH), X3 (nồng độ cơ chất chitosan,%) và Y (hoạt tính
enzyme, U/ml) 37
Trên Đồ thị 4.5 khi cố định yếu tố X1 = 48 (nhiệt độ) biến đổi hai yếu tố X2 trong
khoảng ( 7 – 9), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase đạt
cao nhất là 1.697U/ml tại pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2% 38
4
5

hình thái tế bào của giống vi khuẩn này. Tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất
cho mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis là 48
0
C, nồng độ cơ chất chitosan
0.2%, pH =8. Trong quá trình tiến hành thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật, chúng
tôi đã xác định được phân xuất tủa cồn là 40-60% và tủa amoni sunphate là 50-70% là
các phân xuất thích hợp để làm sạch enzyme chitosanase từ mẫu giống Bacillus
licheniformis. Tuy nhiên trong hai phương pháp đó thì phương pháp tủa phân đoạn
bằng muối amoni sunphate là phương pháp cho kết quả tốt nhất.
xxii
Phần I MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Chitosan là polymer hữu cơ được thu nhận bằng cách deacetyl hoá chitin.
Chitin có trong động vật thuỷ sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ. Hàm lượng chitin
chiếm tỉ lệ khá cao, từ 14-35% so với khối lượng chất khô. Hiện nay chitin, chitosan
và các dẫn xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như
trong nông nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ
phẩm, xử lý nước thải và bảo vệ môi trường…do đó việc nghiên cứu sản xuất chitin,
chitosan và các dẫn xuất của chúng đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu.
Chitosan – oligosaccharide (COS) là sản phẩm thuỷ phân của chitosan. Chúng
là những chất có hoạt tính sinh học cao như chúng có tác dụng điều hoà huyết áp, làm
tăng khả năng hấp thụ canxi, thúc đẩy quá trình bài tiết uric, chống ung thư, trị được
bệnh viêm loét dạ dày, chuột rút và có khả năng làm tăng sức đề kháng của cây trồng.
COS được ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hoà tan trong nước
mà COS được ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm : COS giúp kích thích tiêu
hoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng
miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư…COS có thể được sản xuất bằng
phương pháp hoá học ( thuỷ phân chitin, chitosan bằng acid HCl đậm đặc ) hoặc bằng
phương pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicenlulase, cellulase để thuỷ
phân chitin, chitosan ). Tuy nhiên việc thuỷ phân chitin, chitosan bằng acid đậm đặc có