GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Tiểu luận
Thu nhận và khảo sát một số đặc tính
của enzyme protease từ vi khuẩn
Bacillus subtilis
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
MỤC LỤC
1. KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾ PHẨM
ENZYME PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG VI
KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VỚI CÁC LOẠI TÁC
NHÂN TỦA KHÁC NHAU
……………………………………………………………
1
2. KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ PROTEASE
……………………2
3. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO
PHƯƠNG PHÁP LOWRY
……………………………………………………….3
3.5 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa
bằng muối amoni sulfat
……………………………………………………………….4
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
1. KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾ PHẨM
ENZYME PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS VỚI CÁC LOẠI TÁC NHÂN TỦA KHÁC
NHAU .
Bảng 1.1: Lượng chế phẩm enzyme protease thu được và hiệu suất thu nhận
với các loại tác nhân tủa khác nhau.
Tác nhân tủa

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
NOÀNG ÑOÄ TYROSIN (µmol)
MAÄT ÑOÄ
QUANG OD
(750 nm)
Hình 2.1 : Đường chuẩn Tyrosin.
2.2 Khảo sát hoạt độ protease trong canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis:
Cân 20 g canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis, tiến hành như mục II.3.1, phần
dịch thu được 200 ml, pha loãng 2 lần, đem 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo
phương pháp Anson cải tiến như mục II.3.2
Bảng 2.2: Hoạt độ protease của canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis.
Lần OD
M
OD
ĐC
∆OD = OD
M
- OD
ĐC

- OD
ĐC
µmol
Tyrosin
Hoạt độ
(UI/g CPE)
Hoạt độ
trung bình
(UI/g CPE)
1 0,425 0,300 0,125 0,139 22,24
22,61
2 0,427 0,310 0,117 0,130 20,80
3 0,429 0,290 0,139 0,155 24,80
Nhận xét : Hoạt độ của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 96
0
là
22,61 UI/g CPE (giá trị trung bình) .
2.4 Khảo sát hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng aceton :
Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha
loãng 2 lần, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo phương pháp Anson cải tiến
như mục II.3.2
Bảng 2.4: Hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng acetone.
Lần OD
M
OD
ĐC
∆OD = OD
M
- OD
ĐC

Tyrosin
Hoạt độ
(UI/g CPE)
Hoạt độ
trung bình
(UI/g CPE)
1 0,517 0,458 0,059 0,064 10,24
6,93
2 0,489 0,462 0,027 0,027 4,32
3 0,524 0,487 0,037 0,039 6,24
Nhận xét : Hoạt độ của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng muối
amoni sulfat là 6,93 UI/g CPE (giá trị trung bình) .
2.6 Sự so sánh hoạt độ các CPE protease tủa bởi các tác nhân khác nhau:
Bảng 2.6: So sánh hoạt độ của các CPE protease với tác nhân tủa khác nhau.
Tác nhân tủa Hoạt độ (UI/g CPE) Hoạt độ trung bình (UI/g CPE)
Cồn 96
0
22,24
22,61
20,80
24,80
Acetone
14,56
14,2915,84
12,48
Amoni sulfat
10,24
6,93
4,32
6,24

Bảng 3.2: Hàm lượng protein của canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis :
Lần OD
M
OD
ĐC
∆OD
= OD
M
- OD
ĐC
Nồng độ
protein
tương ứng
(µg/ml)
Hàm lượng
protein
(mg/g CT)
Hàm lượng
protein
trung bình
(mg/g CT)
1 0,774 0,035 0,739 187,872 93,94
94,92
2 0,783 0,035 0,748 190,179 95,09
3 0,788 0,035 0,753 191,462 95,73
Nhận xét : Hàm lượng protein của canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis là
94,92 mg/g CT (giá trị trung bình) .
3.3 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng cồn 96
0
:

Nhận xét : Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng
cồn 96
0
là 318,60 mg/g CPE (giá trị trung bình) .
3.4 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng aceton:
Cân 1g chế phẩm enzyme protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha
loãng 20 lần, lấy 1ml xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry như
mục II.3.3
Bảng 3.4: Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn Acetone.
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Lần OD
M
OD
ĐC
∆OD
= OD
M
- OD
ĐC
Nồng độ
protein
tương ứng
(µg/ml)
Hàm lượng
protein
(mg/g CPE)
Hàm lượng
protein
trung bình

(mg/g CPE)
Hàm lượng
protein trung
bình
(mg/g CPE)
1 0,456 0,035 0,421 106,333 212,67
203,44
2 0,414 0,035 0,379 95,564 191,13
3 0,444 0,035 0,409 103,256 206,51
Nhận xét : Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng
aceton là 203,44 mg/g CPE (giá trị trung bình) .
3.6 Sự so sánh hàm lượng protein của chế phẩm protease tủa bởi các tác nhân
khác nhau :
Bảng 3.6: So sánh hàm lượng protein của các loại chế phẩm enzyme protease
với tác nhân tủa khác nhau.
Tác nhân tủa Hàm lượng protein
(mg/g CPE)
Hàm lượng protein trung bình
(mg/g CPE)
Cồn 96
0
338,31
318,60
306,51
310,97
Aceton
285,49
284,63
283,44
284,97

22,61 318,60 0,072
Acetone 14,29 284,63 0,050
Amoni sulfat 6,93 203,44 0,034
Nhận xét : Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn là
cao nhất 0,072 UI/mg CPE (giá trị trung bình)
5. KHẢO SÁT SỰ PHỤ THUỘC HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHẾ
PHẨM ENZYME PROTEASE VÀO NHIỆT ĐỘ.
5.1 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng cồn) theo
nhiệt độ:
Cân 1g chế phẩm enzym hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha loãng 2 lần,
ở mỗi nhiệt độ khảo sát từ 30
0
C đến 80
0
C, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ
theo Anson cải tiến như mục II.3.2
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Bảng 5.1: Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ protease của CPE (tủa bằng cồn) theo
nhiệt độ.
Nhiệt
độ
(
o
C)
Lần OD
M
OD
ĐC
∆OD

42,56
3 0,564 0,337 0,227 0,256
40,96
55
1 0,707 0,365 0,342 0,387 61,92
63,40
2 0,730 0,359 0,371 0,420 67,20
3 0,705 0,367 0,338 0,382
61,12
60
1 0,705 0,367 0,338 0,382 61,12
61,55
2 0,698 0,365 0,333 0,377 60,32
3 0,708 0,359 0,349 0,395 63,20
70
1 0,532 0,441 0,091 0,100 16,00
13,55
2 0,526 0,445 0,081 0,089 14,24
3 0,498 0,438 0,060 0,065 10,40
80
1 0,480 0,463 0,017 0,016 2,56
2,99
2 0,482 0,460 0,022 0,022 3,52
3 0,484 0,465 0,019 0,018 2,88
Nhận xét : Ở 55
0
C, chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 96
0
có hoạt
độ cao nhất là 63,40 UI/g CPE (giá trị trung bình).

độ
(
o
C)
Lần OD
M
OD
ĐC
∆OD
= OD
M
- OD
ĐC
µmol
Tyrosin
Hoạt độ
(UI/g CPE)
Hoạt độ
trung bình
(UI/g CPE)
30
1 0,493 0,410 0,083 0,091 14,56
14,29
2 0,492 0,402 0,090 0,099 15,84
3 0,495 0,424 0,071 0,078 12,48
40
1 0,518 0,402 0,116 0,129
20,64
21,60
2 0,519 0,398 0,121 0,135

1,12
3 0,465 0,460 0,005 0,002 0,32
Nhận xét : Ở 55
0
C, chế phẩm enzyme protease được tủa bằng aceton có hoạt
độ cao nhất là 42,88 UI/g CPE (giá trị trung bình).
-10
0
10
20
30
40
50
0 20 40 60 80 100
NHIEÄT ÑOÄ (ÑOÄ C)
HOAÏT ÑOÄ
(UI/g CPE)
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Hình 5.2: Sự phụ thuộc của hoạt độ chế phẩm protease (tủa bằng aceton) theo nhiệt
độ.
5.3 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ enzyme vào nhiệt độ đối với CPE (tủa
bằng amoni sulfat) :
Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha
loãng 2 lần, ở mỗi nhiệt độ khảo sát từ 30
0
C đến 80
0
C, lấy 0,5ml tiến hành xác
định hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2

40
1 0,544 0,457
0,087 0,096 15,36
16,00
2 0,554 0,459
0,095 0,105 16,80
3 0,541 0,451
0,090 0,099 15,84
50
1 0,660 0,487
0,173 0,194 31,04
30,88
2 0,657 0,490
0,167 0,187 29,92
3 0,662 0,485
0,177 0,198 31,68
55
1 0,753 0,545 0,208 0,234 37,44
37,33
2 0,749 0,549 0,200 0,225 36,00
3 0,755 0,541 0,214 0,241 38,56
60
1 0,704 0,528 0,176 0,197 31,52
31,57
2 0,701 0,531 0,170 0,191 30,56
3 0,707 0,525 0,182 0,204 32,64
70
1 0,608 0,557 0,051 0,055 8,80
9,71
2 0,610 0,555 0,055 0,059 9,44

ở nhiệt độ 55
0
C, mỗi pH khảo sát từ 3 đến 10, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ
theo Anson cải tiến như mục II.3.2
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Bảng 6.1: Sự biến đổi hoạt độ của CPE protease theo pH.
pH Lần OD
M
OD
ĐC
∆OD
= OD
M
- OD
ĐC
µmol
Tyrosin
Hoạt độ
(UI/g CPE)
Hoạt độ trung
bình(UI/g CPE)
3
1 0,448 0,436 0,012 0,010 1,60
1,76
2 0,451 0,433 0,018 0,017 2,72
3 0,446 0,438 0,008 0,006 0,96
4
1 0,514 0,459
0,055 0,059 9,44

20,64
2 0,694 0,572 0,122 0,136 21,76
3 0,688 0,578 0,110 0,122 19,52
9
1 0,584 0,557 0,027 0,027 4,32
3,89
2 0,580 0,561 0,019 0,018 2,88
3 0,586 0,558 0,028 0,028 4,48
10
1 0,454 0,449 0,005 0,002 0,03
0,18
2 0,457 0,451 0,006 0,003 0,48
3 0,456 0,451 0,005 0,002 0,03
Nhận xét : ở pH = 6,0; chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 96
0
có
hoạt độ cao nhất là 78,45 UI/g CPE (giá trị trung bình )
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12

Albumin
0 5,625 5,650 5,650
0,158 0,158 0,158 0,158
1 5,875 5,900 5,875
0,165 0,165 0,165 0,165
2 6,200 6,175 6,175
0,174 0,173 0,173 0,173
3 6,500 6,500 6,490
0,182 0,182 0,182 0,182
4 6,850 6,870 6,850
0,192 0,192 0,192 0,192
5 7,150 7,140 7,160
0,200 0,199 0,200 0,200
6 7,350 7,350 7,375
0,206 0,206 0,207 0,206
7 7,500 7,525 7,500
0,210 0,211 0,210 0,210
8 7,570 7,550 7,550
0,212 0,211 0,211 0,211
9 7,550 7,550 7,550
0,211 0,211 0,211 0,211
10 7,550 7,550 7,550
0,211 0,211 0,211 0,211
11 7,550 7,550 7,550
0,211 0,211 0,211 0,211
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Nhận xét :
Với cơ chất là albumin, quá trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh trong khoảng
từ 0 – 5 giờ. Giờ thứ 6 và thứ 7, lượng N-formol có tăng nhưng lượng có chiều

4 7,175 7,175 7,200 0,201 0,201 0,202 0,201
5 7,625 7,600 7,600 0,214 0,213 0,213 0,213
6 8,100 8,125 8,100 0,227 0,228 0,227 0,227
7 8,675 8,675 8,700 0,243 0,243 0,244 0,243
8 9,300 9,325 9,325 0,260 0,261 0,261 0,261
9 10,050 10,100 10,000 0,281 0,283 0,280 0,281
10 10,250 10,250 10,250 0,287 0,287 0,287 0,287
11 10,375 10,400 10,375 0,291 0,291 0,291 0,291
12 10,450 10,475 10,475 0,293 0,293 0,293 0,293
13 10,475 10,475 10,475 0,293 0,293 0,293 0,293
14 10,475 10,475 10,475 0,293 0,293 0,293 0,293
15 10,475 10,475 10,475 0,293 0,293 0,293 0,293
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Nhận xét :
Với cơ chất là casein, quá trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh trong khoảng
từ 0 – 9 giờ. Giờ thứ 10 và thứ 11, lượng N-formol có tăng nhưng lượng có chiều
hướng giảm. Từ giờ thứ 12, quá trình thủy phân gần như ổn định.
7.3 Khảo sát quá trình thủy phân protid đậu nành hạt :
Với điều kiện nhiệt độ 55
0
C và pH = 6,0
Bảng 7.3: Sự biến đổi lượng N
F
theo thời gian thủy phân đậu nành hạt bởi
CPE protease .
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Cơ chất Thời
gian

15 8,900 8,900 8,900 0,249 0,249 0,249 0,249
Luận văn tốt nghiệp
GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo
Nhận xét :
Với cơ chất là đậu nành hạt, quá trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh trong
khoảng từ 0 – 10 giờ. Giờ thứ 11, lượng N-formol có tăng nhưng lượng có chiều
hướng giảm. Từ giờ thứ 12, quá trình thủy phân gần như ổn định.
7.4 Khảo sát quá trình thủy phân protid nấm rơm :
Với điều kiện nhiệt độ 55
0
C và pH = 6,0
Bảng 7.4: Sự biến đổi lượng N
F
theo thời gian thủy phân nấm rơm bởi CPE
protease .
Luận văn tốt nghiệp