TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
oOo BÙI THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ
ðẶC TÍNH ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN
BACILLUS LICHENIFORMIS VKNN1

LUẬN VĂN THẠC SỸ

HÀ NỘI – 2014

HÀ NỘI – 2014

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa hề được sử dụng.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và
các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc.
Hà nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014
Học viên Bùi Thị Hường

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn
nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh,
trưởng bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực
phẩm, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn chuyên
môn cho tôi trong thời gian thực hiện và hoàn chỉnh luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực
phẩm, khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Khái niệm về enzyme chitosanase 3
2.2 Phân loại enzyme chitosanase 3
2.2.1 Dựa vào sự tương đồng của chuỗi amino acid 3
2.2.2 Dựa vào sự phân cắt đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase 5
2.3 Một số đặc tính của enzyme chitosanase 6
2.3.1 Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase 6
2.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 7
2.3.3 Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase 8
2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới sự hoạt động của enzyme
chitosanase 9
2.3.5 Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt
động của enzyme chitosanase 10
2.4 Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide 12
2.4.1 Ứng dụng của enzyme chitosanase 12
2.4.2 Ứng dụng của CHOS 12

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page iv

2.5 Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase 15
2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme chitosanase đã được dùng trong sản xuất
chitosanase 15
2.5.2 Vi khuẩn Bacillus licheniformis 15
2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 17
2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase 20
2.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trên thế giới 20
2.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước 21
PHẦN 3 VẬT LIỆU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1 Vật liệu 23

4.2 Xác định điều kiện thu nhận và tinh sạch chitosanase từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis VKNN1 43
4.2.1 Tủa phân đoạn enzyme chitosanase bằng muối amoni sunphate 43
4.2.2 Phân chia enzyme chitosanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 44
4.2.3 Điện di đồ enzyme chitosanase 45
4.3 Xác định một số đặc tính chitosanase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis (chủng VKNN1) 46
4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính của chitosanase 46
4.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính của enzyme chitosanase 47
4.3.3 Ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến độ bền của enzyme chitosanase 47
4.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của enzyme
chitosanase 48
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50
5.1 Kết luận 50
5.2 Đề nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO
51

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page vi

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

2.1 Các chủng vi sinh vật đại diện cho mỗi họ enzyme 4
2.2 Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất 5
2.3 Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 7
2.4 Cơ chất đặc hiệu của enzyme chitosanase từ Bacillus sp. KCTC
0377BP 9

2.1 Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase thu được từ
Streptomyces sp.174 6
2.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 8
4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi
khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 34
4.2 Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis VKNN1 35
4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới quá trình sinh tổng hợp
chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 35
4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến hoạt tính chitosanase 39
4.5 Prediction Profiler của hàm mục tiêu chitosanase 40
4.6 Đường cong sinh trưởng và hoạt tính chitosanase của vi khuẩn
Bacillus licheniformis VKNN1 42
4.7 Sắc ký đồ phân chia enzyme chitosanase 44
4.8 Điện di đồ chitosanase qua các bước làm sạch 45
4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ bền của enzyme chitosanase 48
Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên ñầy ñủ
CHOS Chitosan Oligosaccharide
DA Degree of deacetylation
DP Degree of polymerization
DNS Acid dinitro salisylic
DEAE Diethylaminoethyl

khuẩn, nấm, hay một số thực vật…Nhưng enzyme thu nhận từ vi khuẩn thường có
hoạt tính cao hơn cả. Hơn nữa, các vi sinh vật này lại có khả năng sinh sản, phát triển
với một tốc độ cực kỳ lớn, do đó cho phép thu được một lượng enzyme trong thời gian
ngắn một cách dễ dàng. Mặt khác, môi trường nuôi cấy lại dễ kiếm, rẻ tiền.
Trong các loại vi sinh vật thu nhận enzyme chitosanase được sử dụng hiện 2
nay, thì vi khuẩn Bacillus licheniformis có ưu điểm là sẵn có và chưa được khai thác
nhiều trong các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam.
Trên thế giới cũng đã có khá nhiều đề tài nghiên cứu về enzyme chitosanase
được tổng hợp từ các loài vi sinh vật. Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến thời điểm này,
những nghiên cứu về chitosanase và các loài vi sinh vật sản sinh ra nó còn rất hạn
chế. Chính vì những lí do đó, để góp phần vào việc nghiên cứu và ứng dụng
chitosanase, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận và xác
ñịnh một số ñặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis
VKNN1”.
1.2. Mục ñích – yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1
để tổng hợp enzyme chitosanase, bước đầu làm sạch và xác định một số đặc tính của
enzyme này.
1.2.2. Yêu cầu

- Xác định được các điều kiện nuôi cấy và xây dựng được quy trình nuôi cấy
tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme
chitosanase cao
- Xác định được điều kiện thu nhận enzyme chitosanase thô từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis VKNN1 đã chọn để thu nhận enzyme chitosanase chế phẩm
- Xác định được một số đặc tính của enzyme chitosanase thu nhận từ vi

Các Chitosan Oligosaccharide chứa các

N–acetyl–D–glucosamine, D–glucosamine
4
Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật ñại diện cho mỗi họ enzyme
Họ
chitosanase
Các chủng vi sinh vật sinh
chitosanase ñặc trưng cho mỗi
họ
Những ñiều lưu ý
Họ 5 Streptomyces griseus HUT 6037
Các chitosanase của nhóm này còn có khả
năng xúc tác phản ứng vận chuyển nhóm
glycoside, ngoài ra còn thủy phân được cả
carboxymethylcellulose (CMC).
Họ 8
Bacillus sp. No.7M
Bacillus circulans WL-12
PaeniBacillus fukuinensis chủng
D2
Ngoài việc thủy phân chitosan còn có nhiều
hoạt tính enzyme khác như: cellulase,
endo–xylanase
Họ 46
Streptomyces sp. chủng N174
Nocardioides sp. chủng N106

Sphingobacterium multivorum

Các enzyme này mới được tinh sạch và theo
các kết quả phân tích trong phòng thí
nghiệm thì các vị trí cắt của enzyme thuộc
họ 80 này có những trình tự bảo thủ như của
enzyme chitosanase thuộc họ 40
Nguồn: [44] 5
2.2.2. Dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase
Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết đặc trưng trong chuỗi chitosan để
tiến hành phân cắt. Vị trí đó là liên kết β–1,4 glucoside giữa các phân tử
D–Glucosamine hoặc giữa D–Glucosamine và N–acetyl–D–Glucosamine.
Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào bất
kỳ vị trí liên kết này, mà có một số chitosanase chỉ có khả năng tấn công vào vị trí
β–1,4 glucoside giữa hai D–Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng
tấn công vào liên kết này giữa hai D–Glucosamine và giữa D–Glucosamine với
phần N–acetyl–D–Glucosamine còn lại. Dưới đây là một số vị trí tác dụng của
enzym chitosanase đã tìm thấy được chia theo họ.
Các liên kết đặc hiệu cho nhận của các enzyme chitinolytic và chitosanolytic
đã được điều tra bằng cách sử dụng cơ chất thông thường là acetylated chitosan
20–30%.
Dựa theo sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất chitosanase thì enzyme chitosanase
được phân thành ba loại khác biệt theo đề nghị của Fukamizo và CS [ 12].
Bảng 2.2: Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu của cơ chất
Chitosanase

Kiểu phân cắt

không có khả năng tấn công chitin.

Hình 2.1: Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase
thu ñược từ Streptomyces sp.174

Chitosanase cũng giống như mọi enzyme khác đều có bản chất là protein.
Chúng có khối lượng phân tử khoảng từ 30–70kDa và kích thước mỗi loại enzyme
chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau thì khác nhau. Khối lượng phân tử của
enzyme chitosanase thu được từ một số loài vi sinh vật khác nhau được trình bày ở
bảng 2.3. 7
Bảng 2.3: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase
Chitosanase
Khối lượng phân tử
(kDa)
Bacillus cereus 47
Bacillus circulans

31
Bacillus megaterium P1

43
Bacillus sp.

41
Bacillus sp. KCTC 0377BP

45

Hình 2.2: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase
Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase được nghiên cứu bằng cách sử dụng
dung dịch chitosan và một vài CHOS làm cơ chất. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)
(thin–layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase đã giải phóng ra CHOS từ
chitosan, phần lớn là các CHOS dài hơn (GlcN)
2
bằng cách phân cắt nội phân tử. Enzyme
này không thể thuỷ phân được (GlcN)
2
hoặc (GlcN)
3
. Còn (GlcN)
4
và (GlcN)
5
thì bền với
hoạt tính xúc tác của enzyme này. Tuy nhiên, chitosan oligosaccharide (GlcN)
6
và (GlcN)
7

được thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ. (GlcN)
6
chủ yếu được phân cắt thành (GlcN)
3
+
(GlcN)
3
và (GlcN)
2

Trong số các cơ chất được thử nghiệm như: Chitosan, CHOS, dịch keo chitin,
carboxymethyl cellulose (CMC) và peptidoglucan thì enzyme chitosanase thường thể hiện
hoạt tính cao nhất đối với cơ chất chitosan hoà tan (Bảng 2.4).
Mặc dù đã kéo dài phản ứng enzyme qua đêm nhưng nó vẫn không thể thuỷ phân
được (GlcNAc)
6
, chitin tinh thể và peptidoglycan nhưng nó lại có khả năng thuỷ phân
được dung dịch keo chitin và CMC. Độ bền của (GlcNAc)
6
đối với hoạt động của enzyme 9
chitosanase cho thấy rằng enzyme này không có hoạt tính chitinase. Hoạt tính chitinase là
khả năng phân cắt liên kết β–1,4 giữa GlcNAc – GlcNAc. Hoạt tính nhỏ đối với cơ chất
keo chitin có thể được giải thích là do enzyme chitosanase phân cắt β–1,4 của GlcN –
GlcN, GlcN – GlcNAc và GlcNAc – GlcN, chúng được tìm thấy trong dung dịch keo
chitin với DDA 10%.
Bảng 2.4: Cơ chất ñặc hiệu của enzyme chitosanase
từ Bacillus sp. KCTC 0377BP
Cơ chất Hoạt tính tương ñối (%)
 Chitosan oligosaccharide
Chitobiose………………………….
Chitotriose………………………….
Chitotetraose………………………
Chitopentaose………………………
Chitohexaose……………………….
Chitoheptaose………………………

–

Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt tính enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và
nhiệt độ đó là nhiệt độ tối ưu của enzyme (t
opt
). Nhiệt độ tối ưu của chitosanase thu được từ
các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau và t
opt
thường không cố định mà có thể thay đổi
tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng…
– ðộ bền pH và pH tối ưu cho sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase
Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme. Đa số các
enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 đến 9. Đối với enzyme chitosanase, pH thích hợp
cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 4.0 – 8.0. Tuy nhiên, pH tối ưu (pH
opt
) cho
hoạt động của chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau là khác nhau.
Bảng 2.5: Nhiệt ñộ và pH tối ưu cho hoạt ñộng của chitosanase thu ñược
từ một số vi sinh vật khác nhau
Vi sinh vật pH tối ưu Nhiệt ñộ tối ưu (
0
C)
Bacillus sp. KCTC 0377BP 5.0 60
Bacillus cereus 5.8 54
Streptomyces griceus HUT 6037 5.7 60
Streptomyces N174 5.5 65
Sphingomonas sp. CJ–5 6.5 56
Nguồn: [32, 22, 14, 34]
Như vậy, enzyme chitosanase có thể được phân loại vào nhóm enzyme có tính acid và
tính chịu nhiệt ôn hoà.
2.3.5. Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt ñộng

cuối cùng(
c)
Bacillus sp. strain KCTC 0377BP 45 Endo 4.0-6.0 1,700 Chitosan(40-100), CMC (2,5) G3 – G7
Aspergillus oryza IAM 2660
40 Endo 5.5 17.2 Chitosan (70-100) Oligomer
135 Exo 5.5 38.8 Chitosan (90-100) G1
Nocardia orientalis IFO 12806 97 Exo 5.5 35.8 Chitosan (100) G1
Acinetobacter sp. strain CHB101
37 Endo 5-9 334 Chitosan (70-90) G2, G3
30 Endo 5-9 800 Glycol chitosan
Enterobacter sp. strain G-1 50 Exo 7.0 5.84 Chitosan (80) G2
Myxobacter strain AL-1 31 Endo 5.0 ND
(d)

CMC, Chitosan ND
Matsuebacter chitosanotabidus 3001 34 Endo 4.0 250 Chitosan (90) G1-G3
B. cereus S1 45 Endo 6.0 196 Chitosan, CMC (21,6) G2-G4
B. megaterium P1 chitosanase Acetyl 43 Endo 4.5-6.5 154.8 Chitosan (81), CMC (0,4) Oligomer
Bacillus sp. strain KFB – C108 48 Endo 6.5 110 Chitosan G3-G5
Nguồn: [43]
Chú thích:
(a)
Được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)
(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) với enzyme tinh sạch
(b)
Exo: kiểu phân cắt ngoài; Endo: kiểu phân cắt trong
(c)
Sản phẩm cuối cùng khi sử dụng chitosan làm cơ chất
(d)
ND (not determined): không xác định được

β–1,4–glycoside của chitosan tạo ra CHOS. Do đó cấu tạo của CHOS là một chuỗi
phân tử được cấu tạo bởi một số đơn vị D–glucosamine (GlcN) (thường là từ 2 đến
10 đơn vị GlcN). Chiều dài chuỗi phân tử và mức độ deacetyl (DDA) được coi là 2
yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của CHOS. CHOS dài hơn
hexamer có khả năng ức chế vi sinh vật, chống ưng thư, tăng cường miễn dịch tốt
hơn so với các CHOS ngắn. Sự tăng mức độ deacetyl làm tăng hoạt tính sinh học
của CHOS. Bởi vậy, kiểm soát chặt chẽ chiều dài chuỗi phân tử và DDA là điều
kiện tiên quyết để sản xuất CHOS có giá trị cao [18].
2.4.2.1. Sản phẩm Prebiotic
Choi et al (2006) cũng nghiên cứu sử dụng CHOS vào sữa cho thấy CHOS có
thể sử dụng trong các sản phẩm sữa thương mại có lợi cho sức khỏe mà rất ít ảnh 13

hưởng tới các đặc tính vật lý và cảm quan của sản phẩm.
CHOS là chất có khả năng ngăn chặn sự tích lũy các chất béo bên trong các
cơ quan cỏ thể sinh vật, đặc biệt là ở trong thận của những người sau khi uống rượu.
Quan trọng hơn CHOS ngăn chặn những tác động xấu của rượu lên gan ngăn chặn
những ảnh hưởng xấu đến các bệnh về gan cho những người nghiện rượu.
Không giống với chitosan, CHOS dễ đồng hóa bên trong cỏ thể và bên cạnh
đó nó có thể làm tăng sự đồng hóa của một số nguyên tố vi lượng như sắt, Canxi,
Ứng dụng của Oligosaccharide cho phép giải quyết một số vấn đề về dinh dưỡng
liên quan đến thiếu hụt một số nguyên tố vi lượng. Nó loại bỏ một cách hoàn toàn
Cholesterol và lipoprotein mật độ thấp từ mạch máu. Bởi vậy việc bổ sung CHOS
vào cơ thể của các bệnh nhân bị bệnh béo phì thì có kết quả tốt. CHOS là cation
dương vì vậy nó có thể liên kết với các ion Cl

có trong mạch máu rồi thải ra ngoài
làm giảm huyết áp.

C từ 9 ngày đến 70 ngày với nồng độ
CHOS là 4g/l [22].
Chitosan tạo ra bột Chitofood thay thế hàn the độc hại nhưng đảm bảo sản
phẩm vẫn dai, ngon. Phụ gia này được dùng trong chế biến bảo quản các sản phẩm
từ nhóm thịt (giò, chả, thịt hộp, nem), thực phẩm tươi sống, thịt nguội, đồ uống,
nước giải khát, sản phẩm sữa
CHOS là chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe. những nghiên cứu đã cho thấy
rằng CHOS có khả năng liên kết với các chất béo và cholesterol, làm giảm
cholesterol trong máu có tác dụng tốt đối với những người bị cao huyết áp, những
người béo. CHOS có cấu trúc dạng sợi và có các thuộc tính giống như các cấu trúc
dạng sợi như Cellulose nên có thể dùng cho những người ăn kiêng, thay thế thức ăn
chứa nhiều calo.
Sử dụng bao bì làm từ chitosan để bảo quản thực phẩm. Từ trước đến nay,
việc bảo quản các loại thực phẩm tươi sống giàu đạm, dễ hư hỏng như thịt, cá trong
điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta là một trong những vấn đề đã và đang được
các nhà sản xuất, chế biến và các nhà khoa học quan tâm, nên sau khi vỏ bọc chitosan
từ vỏ tôm được hoàn thành, các nhà nghiên cứu đã nghĩ ngay đến việc dùng màng
bọc chitosan từ vỏ tôm nay để làm vỏ bọc xúc xích để có tác dụng kéo dài thời gian
sử dụng mà không độc hại, an toàn cho người sử dụng, không làm mất màu, mùi vị
dặc trưng của nguyên liệu xúc xích. 15

2.4.2.3. Trong nông nghiệp
CHOS được sản xuất dưới hai dạng rắn và lỏng. Trong thành phần của nó
chứa Cacbon và giàu Nitơ vì vậy nó trở thành nguồn cung cấp các chất này cho cây
trồng. Nó có thể được dùng như một chất kích thích sinh trưởng được bón cho cây
trồng để cải thiện lượng rau, hoa, quả và nó có thể ngăn chặn sự nhiễm sâu bệnh,
sinh ra các chất kháng khuẩn trong đất và làm phân bón sinh học. Sản xuất phân