Phân lập một số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza
và xác định một số đặc tính của enzym Phạm Thị Xòe Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: GS.TS. Nguyễn Đình Quyến
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan về Kitin và Kitinaza. Tiến hành nghiên cứu phân lập một số vi
khuẩn có hoạt tính Kitinaza và một số đặc tính của Enzim. Trình bày các kết quả
nghiên cứu đạt được: Từ mẫu đất làm giàu, đã phân lập được 35 chủng vi khuẩn.
Tiến hành thử hoạt tính có 11 chủng có hoạt tính kitinaza; Chọn lọc 2 chủng sinh
kitinaza cao nhất xác định được nhiệt độ tối ưu của chủng HD1 là 400C, chủng HD5
là350 C; PH tối ưu của chủng HD1 là7,0 - chủng HD5 là7,5 và nồng độ cơ chất tối
ưu của cả hai chủng HD1 và HD5 là 15‰; Thử hoạt tính kitinaza 2 chủng trên cả
kitin thô và kitin tinh chế thấy nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất tối ưu là không đổi;
Hoạt tính enzym tương đối ổn định sau 4 tuần bảo quản tại 40C; Nếu trong điều kiện
không có kitin tinh chế có thể sử dụng kitin thô độ chính xác vẫn đảm bảo; Cả 2
chủng trên đều có hoạt tính kháng nấm; Có thể khẳng định cả 2 chủng trên đều thuộc
chi Bacillus.

Keywords. Vi sinh vật học; Hoạt tính Kitinaza; Enzim; Vi khuẩn
Content

O
5
N)
n
. Các chuỗi kitin riêng rẽ có thể dạng xoắn vì
mỗi phân tử đường bị đảo ngược so với những phân tử đường cạnh, dẫn đến sự ổn định về
cấu trúc của chúng.
1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin.
1.1.2.1. Cấu trúc của kitin.
Qua nghiên cứu sự thuỷ phân kitin bằng enzym hay HCl đậm đặc người ta thấy kitin là
một chuỗi polysaccarit của N- acetyl-D- glucozamin được tạo lên bởi mối liên kết β (1-4)
glicozit với công thức tổng quát (C
8
H
15
O
5
N)
n
. Các chuỗi kitin riêng rẽ có thể dạng xoắn vì
mỗi phân tử đường bị đảo ngược so với những phân tử đường cạnh, dẫn đến sự ổn định về
cấu trúc của chúng.
1.1.2.2 Đặc tính của kitin.[4]
Kitin có mầu trắng hay trắng phớt hồng, không mùi, không vị, không tan trong nước,
trong môi trường kiềm, axít loãng và các dung môi hữu cơ như rượu, ete,…nhưng tan trong
một số dung dịch kiềm đặc nóng.
1.1.3 Ô nhiễm môi trường có nguồn gốc kitin
1.1.4 Một sốquy trình sản xuất kitin
1.1.5 Một số ứng dụng của kitin.
1.2 SƠ LƢỢC VỀ KITINAZA

2.1.1 Mẫu vật
2.1.2 Hoá chất, dụng cụ
2.1.3 Môi trường
2.1.3.1 Môi trường phân lập
2.1.3.2 Môi trường giữ giống
2.1.3.3 Môi trường xác định hoạt tính enzym
2.1.3.4 Môi trường nuôi cấy lắc
Môi trường 1
Kitin: 5,0g
Pepton: 7,0g
Cao nấm men : 1,0g
Nước cất: 1000ml
pH: 7,0.
Khử trùng 121
0
C trong 30 phút.
Môi trường 2
ZnSO
4
: 1,0 g
(NH
4
)
2
SO
4:
1,0 g
KH
2
PO

PO
4
: 1,36g
Kitin: 10 g
MgSO
4
: 0,3 g
Nước cất: 1000ml
pH = 7,0
Khử trùng 121
0
C trong 30 phút.
=> Chú ý luôn pha song song kitin tinh chế và kitin thô cho mỗi loại môi trường.
2.1.3.5 Môi trường Czapek nuôi cấy nấm mốc
NaNO
3
: 2,0 g
Đường kính
:
30 g
KH
2
PO
4
: 1,0g
FeSO
4
: 0,05g
KCL: 0,5 g
MgSO

kitin thu được 31 chủng vi khuẩn kí hiệu NG1- NG31. Qua sơ tuyển bằng phương pháp đặt
thỏi thạch với môi trường cơ chất trong cả 2 trường hợp kitin tinh sạch và kitin thô thu được
7 chủng có hoạt tính kitinaza.
Từ mẫu đất được bổ sung nguồn kitin ở vùng đất trồng Ninh Giang - Hải Dương theo
phương pháp làm giàu thu được 35 chủng vi khuẩn trên môi trường phân lập NA. Bằng
phương pháp đặt thỏi thạch với môi trường cơ chất trong cả 2 trường hợp kitin tinh sạch và
kitin thô thu được 11 chủng có hoạt tính kitinaza.
3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH KITINAZA CỦA
CÁC CHỦNG LỰA CHỌN
3.2.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy lắc cả chủng HD1 và HD5 trên 3 loại môi trường 1,2,3 trong cả hai
trường hợp kitin tinh sạch và kitin thô. Sau 24h kiểm tra hoạt tính kitinaza theo phương pháp
nhỏ dịch nhằm chọn lọc được môi trường nuôi cấy thích hợp nhất. Kết quả thể hiện bảng 3

Bảng 3: Các chủng nghiên cứu nuôi cấy trên các loại môi trường
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Môi trường
Hoạt tính kitinaza
HD1
HD5
Môi trường 1

25
Kitin tinh sạch
26
23
Kitin thô
19
15
30
Kitin tinh sạch
27
25
Kitin thô
21
21
35
Kitin tinh sạch
29
27
Kitin thô
23
22
40
Kitin tinh sạch
31
21
Kitin thô
26
18
45
Kitin tinh sạch

CFU/ ml)
pH
Hoạt tính enzym (mm)
HD1
HD5
5,5
Kitin tinh sạch
21
19
Kitin thô
15
15
6,0
Kitin tinh sạch
23
20
Kitin thô
16
16
6,5
Kitin tinh sạch
27
23
Kitin thô
20
22
7,0
Kitin tinh sạch
29
27

Hoạt tính enzym (mm)
HD1
HD5
5‰
Kitin tinh sạch
29
27
Kitin thô
23
22
10‰
Kitin tinh sạch
32
30
Kitin thô
25
24
15‰
Kitin tinh sạch
35
34
Kitin thô
29
27
20‰
Kitin tinh sạch
33
34
Kitin thô
28

21
2 tuần
Kitin tinh sạch
23
24
Kitin thô
20
21
3 tuần
Kitin tinh sạch
22
22
Kitin thô
19
19
4 tuần
Kitin tinh sạch
22
21
Kitin thô
19
18
Bảng 7: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dưới ảnh hưởng
của thời gian bảo quản

3.3 HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU
Số lượng tế bào ( x 10
8
CFU/
ml)

Que, ngắn, rời rạc hoặc xếp
chuỗi ngắn
Nhuộm Gram
Gram dương
Gram dương
Hình thành nội bào tử
Có
Có

Bảng 9: Một số đặc tính sinh học của các chủng nghiên cứu
Căn cứ các đặc điểm trên và đối chiếu với bảng phân loại của Bergeycó thể khẳng định
rằng các chủng nghiên cứu trên có khả năng thuộc chi Bacillus. KẾT LUẬN

1. Từ mẫu đất nghiên cứu, chúng tôi đã phân lập được 35 chủng vi khuẩn. Tiến hành thử
hoạt tính có 11 chủng có hoạt tính kitinaza.
2. Chọn lọc 2 chủng sinh kitinaza cao nhất xác định được nhiệt độ tối ưu của chủng HD1
là 40
0
C, chủng HD5 là 35
0
C. PH tối ưu của chủng HD1 là7,0; chủng HD5 là7,5 và nồng
độ cơ chất tối ưu của cả hai chủng HD1 và HD5 là 15‰.
4. Thử hoạt tính kitinaza 2 chủng trên cả kitin thô và kitin tinh chế thấy nhiệt độ, pH và
nồng độ cơ chất tối ưu là không đổi.
5. Hoạt tính enzym tương đối ổn định sau 4 tuần bảo quản tại 4
0
C.

from Bacillus brevis and its characterization as a laundry detergent additive”,
Biochemistry, 35 (1-2), pp. 213-19.
6. Cottrell MT, Moore JA, Kirchman DL. 1999. Appl Environ Microb, 65 (6): 2553-
2557.
7. Davis, B., and Eveleigh , D. E., 1984, Chitosanase: Occurrence, production and
immobilization, in: Chitin, Chitosan and Related Enzymes ( J. P. Zikakis, ed), pp.
161- 179, Academic Press, Orlando.
8. Deshpande, MV 1986. Journal of Scientific and Industrial Research 45:273-281
9. Enzymology, RAA Muzzarelli (ed). Atec Edizioni, Italia. 2:125- 133.
10. Flach. J., Pilet PE, and Jolles P.1992. Experientia 48, pp-701-716.
11. Fergus G.Priest, Extraccellular Enzyme Synthesis in the genus Bacillus,
Bacteriologycal Reviews, 41 (3), p. 711- 753.
12. Fuchs, RL, McPherson, SA and Drahos, DJ1986. Appl. Environ. Microbiol. 51,
504.
13. Gardner, H. H., and Blackwell, J., 1975, Refinement of the structure of β- chitin,
Biopolymers 14: 1581- 1595.
14. Gokul, B Lee, JH Song, KB Rhee, SK Kim, CH Panda, T. 2000, Bioprocess
Eng. 23(6):691-694
15. Gooday, G.W., 1983, The microbial synthesis of cellulose, chitin and chitosan, Pro.
Ind. Microbiol. 18: 85- 127.
16. Goorich, T. D., and Morita, R .Y., 1977a, Incidence and estimation of chitinase
activity associated with marine fish and other estuarine sample, Mar. Biol. 41: 349-
353.
17. Hackman R.H. (1962). Studies on Chitin. 5. Action of Mineral Acids on Chitin
Australian Journal of Biological Sciences 15 (3): 526- 532.
18. Henrissat BI and Bairoch A. 1993. Biochem. J., 293, 781-788.
19. Herrera-Estrella A. & Chet, I. 1999. EXS 87, 171.
20. Hillman, K., Gooday, G. W., and prosser, J. I., 1989, A simple model system for
small scale in vitro study of estuarine sediment ecosystems, Lett. Appl. Microbiol. 8:
41- 44.

JE .1999. World J Microb Biot 15 (2): 299-308.
36. Rudall, K. M., and Kenchington, W , 1973, The chitin system, Biol. Rev. 48: 597-
636.
37. Rudrapatnam N., Tharanathan and Farooqahmed S. Kittur. 2003. Crit Rev Food Sci
Nutr, 43(1):61.87.
38. Sahai, AS and Manocha, MS 1993. FEMS Microbiol. Rev., 11:317-338.
39. Salzer P, Feddermann N, Wiemken A, Boller T, Staehelin C. 2004. Planta 219 (4):
626-638.
40. Simpson, BK; Gagne, N. and Simpson, MV 1994. Bioprocessing of chitin and
chitosan. In: Fisheries Processing: Biotechnological applications. AM Martin
(Ed.). Chapman and Hall. London.155-173.
41. Shirai, K., Guerrero, I. and Hall, GM 1996. La quitina, ocurrencia, propiedades
yaplicaciones. Ciencia 47 (4):317-328.
42. S.Kavi Karunya, D.Reetha, P.Saranraj and D. John Milton. Department of
Microbiology,Annamalai University,Chidambaram – 608 002, India. Received 24
Aug 2011; Revised 26 Oct 2011; Accepted 07 Nov 2011
43. Smucker, R.A., 1984, Biochemistry of the streptomyces spore sheath, in: Biologycal,
Biochemical and Biomedical Aspects of Actinomycetes ( L. Ortiz- Ortiz, L. F.
Bojalib, and V. Yakoleff, eds.), pp. 171- 177, Academic Press, Orlando.
44. Smucker, R.A., and Dawson, R., 1986, products of phytosynthesis by marine
phytoplankton: chitin in CTA „ protein‟ precipitase, J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 104: 397-
408.
45. Sundheim, L., Poplawsky, AR & Ellingboe, AH 1988. Phys. Mol. Plant
Path. 33, 483.
46. S.Kavi Karunya, D.Reetha, P.Saranraj and D. John Milton. Department of
Microbiology,Annamalai University,Chidambaram – 608 002, India. Received 24
Aug 2011; Revised 26 Oct 2011; Accepted 07 Nov 2011
47. Todar‟s online Textbook of bacteriology ( 2008), Gram positive aerotic or faculative
endospore forming bacteria ( formerly, „the genus Bacillus”).