Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thị Xoè

PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KITINAZA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT
SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 2
1.1 SƠ LƯỢC VỀ KITIN 7
1.1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của kitin trong tự nhiên 7
1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin. 8
1.1.3 Ô nhiễm môi trường có nguồn gốc kitin 11
1.1.4 Một sốquy trình sản xuất kitin 12
1.1.4. 1 Quy trình sản xuất kitin của Hackman [17] 12
1.1.4.2 Phương pháp điều chế kitin của Capozza [34] 12
1.1.4. 3 Quy trình sản xuất kitin của tác giả Trần Thị Luyến [1,2] 13
1.1.5 Một số ứng dụng của kitin. 13
1.2 SƠ LƯỢC VỀ KITINAZA 16
1.2.1 Phân loại kitinaza. 16
1.2.2 Cơ chế tác động của kitinaza. 19
1.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của kitinaza. 20
1.2.4 Các nguồn thu nhận kitinaza 21
1.2.5 Ứng dụng của kitinaza.[9, 24] 24
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26
2.1 VẬT LIỆU 26
2.1.2 Hoá chất, dụng cụ 26
2.1.3 Môi trường 27

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 4

2.2 PHƢƠNG PHÁP 30
2.2.1 Phân lập vi khuẩn 30
2.2.2 Xác định khả năng sinh kitinaza. 31
2.2.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào 32
2.2.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh kitinaza của các
chủng lựa chọn. 33

cứu và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua nhƣ proteaza, amylaza, cellulaza,….
Những năm sau này ngƣời ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzym khác đó là
kitinaza, đây là enzym thủy phân kitin.
Kitinaza rất phổ biến trong cuộc sống và đƣợc tìm thấy ở các loài bao gồm vi
khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Kitinaza phân huỷ kitin, đó là
polysaccarit dồi dào thứ hai trong tự nhiên sau khi xenlulôzơ. Do đó, kitinaza rất
quan trọng để duy trì một sự cân bằng giữa cacbon và nitơ bị mắc kẹt trong kitin,
dạng không hòa tan.
Vì vậy, kitinaza là công nghệ sinh học lớn đang rất đƣợc giới khoa học quan
tâm bởi các lý do: thứ nhất, các enzym này có thể đƣợc sử dụng để chuyển đổi phế
liệu giàu kitin thành các sản phẩm hữu ích; thứ hai, có thể khai thác kitinaza dùng
cho sự kiểm soát của mầm bệnh nấm và côn trùng; thứ ba, kitinaza chất ức chế
khả năng tăng trƣởng có chứa kitin (thực vật) mầm bệnh và côn trùng bệnh dịch
hạch cần kitinaza cho sự phát triển bình thƣờng. [12, 19]
Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong những nƣớc có điều kiện thiên nhiên ƣu
đãi đặc biệt cho ngành nuôi trồng thuỷ sản. Trong những năm qua đã có những
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 6

phát triển vƣợt bậc và song song với sự phát triển đó, hàng năm các nhà máy chế
biến thuỷ sản của nƣớc ta thải ra một lƣợng phế liệu giàu kitin khá lớn. Nguồn phế
liệu thuỷ sản này một phần đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc số còn lại chỉ một
phần nhỏ sử dụng để sản xuất kitin còn chủ yếu thải ra gây ô nhiễm môi trƣờng. Vì
vậy nghiên cứu công nghệ tạo ra các sản phẩm hữu ích từ nguồn phế liệu này là
một vấn đề không chỉ có ý nghĩa lí luận mà còn có ý nghĩa thực tiễn rất thiết thực.
Tuy nhiên việc ứng dụng kitin và kitinaza cho sản xuất các sản phẩm có ý nghĩa là
một việc không mấy dễ dàng. Dù kitin đƣợc sản xuất hàng năm với con số lớn
nhƣng khó tinh chế bởi sự có mặt của prôtêin và CaCO
3

của bộ xƣơng ngoài. Trong động vật bậc cao monome của kitin là một thành phần
chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và găn liền các vết thƣơng ở da. [29,
44]
Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ hàm lƣợng kitin khá
cao. Vì vậy, vỏ tôm, cua, ghẹ thƣờng là nguyên liệu chính để sản xuất kitin.
Kitin có khối lƣợng phân tử lớn, cấu trúc phức tạp, là tập hợp các
monosaccarit ( N-acetyl- β-D-glucôzamine) liên kết với nhau bởi cầu nối glucôzit
và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa, rất hiếm khi kitin tồn tại ở
trạng thái tự do và hầu nhƣ luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị với các prôtêin,
CaCO
3
và các hợp chất phản ứng khác.[29, 44]
Về mặt lịch sử, kitin dƣợc Henry Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811
trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Năm 1823 Galier phân lập đƣợc một chất từ
bọ cánh cứng mà ông gọi là kitin.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 8

1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin.
1.1.2.1. Cấu trúc của kitin.
Qua nghiên cứu sự thuỷ phân kitin bằng enzym hay HCl đậm đặc ngƣời ta
thấy kitin là một chuỗi polysaccarit của N- acetyl-D- glucozamin đƣợc tạo lên bởi
mối liên kết β (1-4) glicozit với công thức tổng quát (C
8
H
15
O
5
N)

vật chân đốt, vỏ giun tròn, răng bào của động vật thân mềm. Do cách sắp xếp nhƣ
vậy, ngoài có liên kết hiđrô trong mỗi lớp còn có liên kết hiđrô giữa các lớp, sự sắp
xếp theo nguyên tắc đối song song đó đã tạo ra tấm kitin rất bền vững. Dạng β-
kitin tìm thấy trong tảo silic, bộ xƣơng ngoài côn trùng, kén và là thành phần chính
của thành tế bào nấm, vỏ động vật thân mềm và một số động vật chân đốt . Dạng γ-
kitin là hỗn hợp của hai dạng α và β- kitin có trong dạ dày của mực ống, hai dạng β
và γ- kitin sắp xếp chiều các monome khác biệt so với dạng α- kitin nhƣ miêu tả
trên dẫn đến là dạng kém bền và dễ thoái hoá.
1.1.2.2 Đặc tính của kitin.[29]
Kitin có mầu trắng hay trắng phớt hồng, không mùi, không vị, không tan
trong nƣớc, trong môi trƣờng kiềm, axít loãng và các dung môi hữu cơ nhƣ rƣợu,
ete,…nhƣng tan trong một số dung dịch kiềm đặc nóng.
Kitin ổn định với chất ôxi hoá mạnh nhƣ thuốc tím( KMnO
4
) ôxi già (H
2
O
2
), nƣớc
ja ven,…lợi dụng tính chất này ngƣời ta sử dụng các chất oxi hoá trên để khử màu
cho kitin.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 10

Đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40-50%) ở nhiệt độ cao kitin bị
mất gốc acetyl và trở thành kitosan hoặc trong dung dịch HCl đậm đặc kitin bị cắt
mạch thu đƣợc glucozamin.
Kitin dễ dàng bị phân huỷ bằng việc phân cắt liên kết glicôzit dƣới tác dụng
của kitinaza đƣợc tiết ra bởi một số vi sinh vật, thực vật và động vật. [7, 16, 2014]

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 11

1.1.3 Ô nhiễm môi trường có nguồn gốc kitin
Xuất khẩu thuỷ sản đã và đang là ngành kinh tế thu đƣợc lợi nhuận cao
không chỉ cho nền kinh tế nƣớc ta mà còn cho nền kinh tế thế giới. Tuy nhiên,
một thực trạng đáng báo động hiện nay là song song với sự gia tăng kinh tế
thì vấn đề ô nhiễm môi trƣờng do chất thải rắn (vỏ tôm, cua, ghẹ…) của các
nhà máy chế biến thuỷ sản xuất khẩu thải ra môi trƣờng cũng tăng lên đáng
kể.
Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của ngành thuỷ sản Việt Nam,
chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lƣợng tôm năm
2003 là 193973 tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản phẩm cuối cùng,
phế liệu tôm có thể lên tới 40 – 70% khối lƣợng nguyên liệu. Tƣơng ứng với
sản lƣợng tôm hàng năm sẽ có khối lƣợng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ
tôm đƣợc tạo ra. Biết rằng các chất gây ô nhiễm môi trƣờng ở đây có nguồn
gốc kitin vẫn lƣu trữ giá trị kinh tế lớn nên bất chấp hậu quả vì thu lợi trƣớc
mắt đã mọc lên nhiều cơ sở sơ chế vỏ đầu tôm địa phƣơng.
Qua thực tiễn cho thấy, những khu vực có cơ sở chế biến vỏ đầu tôm,
mọi ngƣời dân đều bất bình vì ô nhiễm nguồn nƣớc và bầu không khí. Nguồn
nƣớc bị ô nhiễm bởi các chất nhƣ protein, khoáng và cả hoá chất HCl hay
NaOH, đƣợc thải ra trong quá trình chế biến. Bầu không khí bị bao trùm bởi
mùi hôi tanh của nguyên vật liệu khiến cho ngƣời dân ở đây thƣờng xuyên
phải nín thở thậm chí phải di tản ngƣời già và trẻ nhỏ.
Tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học công
nghệ, cho ngành thuỷ sản là phải sử dụng hợp lý và hiệu quả lƣợng phế liệu
tôm rất lớn do các nhà máy chế biến thuỷ sản tạo ra hàng ngày để sản xuất ra
sản phẩm có giá trị cao nhƣ kitin.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

phẩm dạng bột màu kem. Quy trình dừng lại đến sản phẩm là chitin.

1.1.4.2 Phương pháp điều chế kitin của Capozza [34]
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 13

Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy
khuấy, thêm từ từ 825ml HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 40
0
C trong
thời gian 48 giờ. Sản phẩm sau quá trình khử khoáng
đƣợc rửa sạch bằng nƣớc đến pH = 7. Xác định hàm lƣợng tro 0,4 - 0,5%. Sau
đó sản phẩm đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng với 1500ml axit fomic HCOOH
90%, để qua đêm. Hỗn hợp đƣợc lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nƣớc
nhiều lần cho đến khi pH = 7. Sản phẩm sạch sau đó đƣợc ngâm ngập trong 2
lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng ở 90
0
C - 100
0
C trong 2,5 giờ. Dung dịch
đƣợc lọc và rửa sạch với nƣớc đến pH = 7, sau đó sản phẩm đƣợc tráng
rửa lại trong êtanol 96
0
và ête, sấy khô ở 40
0
C. Khối lƣợng kitin khô sạch thu
đƣợc là 66g hiệu suất 44,3%.
1.1.4. 3 Quy trình sản xuất kitin của tác giả Trần Thị Luyến [1,2]
Vỏ tôm khô hoặc tƣơi đƣợc loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1

trời và màn hình điện thoại di động. [30]
1.1.5.2 Trong nông nghiệp.
Hầu hết các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng kitin là một chất cảm ứng tốt
cho cơ chế bảo vệ trong cơ thể thực vật, giúp tăng cƣờng hệ miễn dịch. Nó cũng đã
đƣợc đánh giá nhƣ là một phân bón có thể cải thiện năng suất cây trồng tổng
thể. [19, 26, 27]
…
1 .1.5.3 Trong y học.
Do đặc tính của kitin đƣợc dùng làm chỉ phẫu thuật, chữa lành vết thƣơng.
Đặc biệt, vì một số tính chất khác thƣờng, kitin giúp đẩy nhanh tốc độ hàn gắn vết
thƣơng ở ngƣời.
Ngoài ra kitin đƣợc dùng trong sản xuất gạc chống khuẩn, y phục bệnh viện,
túi đựng máu nhân tạo, chất ức chế khối u, điều chỉnh lƣợng cholesteron trong
máu.
…
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 15

* Một số ví dụ cụ thể ứng dụng kitin hay dẫn xuất kitin trên trế giới và Việt
Nam.
- Sử dụng kitin “kẹp” ion kim loại tại Nhật.
Tại Nhật kitin đƣợc sử dụng trong công nghiệp xử lí nƣớc thải để loại bỏ ion
kim loại nhờ kitin có thể tạo phức với ion.

glycohydrolaza thứ 18 và 19 [ 18]
Họ glycohydrolaza 18 là họ kitinaza lớn nhất với khoảng 180 chi, có hoạt tính
mạnh và có cấu trúc xác định gồm 8 xoắnα/β cuộn tròn, gặp ở nhiều loại sinh vật
từ nhân sơ đến nhân thật. Enzym thuộc họ này hoạt động thông qua một cơ chế
kiểm soát trong đó các đoạn β polyme bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anome.
Kitinaza thuộc họ này thuỷ phân mối liên kết GlcNAc-GlcNAc và mối liên kết
giữa GlcNAc-GlcN
Họ glycohydrolaza 19 có khoảng 130 chi, gặp ở thực vật bậc cao và
Streptomyces gricues.Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn, kitinaza
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 17

thuộc họ này đƣợc ví nhƣ lyzôzym và kitosanaza. Chúng hoạt động thông qua cơ
chế nghịch chuyển và thủy phânmối lien kết GlcNAc-GlcNAc và GlcN-GlcNAc
* Dựa vào trình tự axit amin kitinaza chia thành 5 lớp. [31]
Lớp I: là những đồng phân enzym trong phân tử có đầu nitơ giàu cystein nối với
tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl. Vùng
giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzym và cơ chất
kitin nhƣng không cần cho hoạt động xúc tác.
Lớp II:là những đồng phân enzym trong phântử chỉ có tâm xúc tác, thiếu
đoạn giàu cystein ở đầu nitơ và có trình tự axit amin tƣơng tự kitinaza ở
nhóm I.
Lớp III: Trình tự axit amin hoàn toàn khác với kitinaza lớp I và II.
Lớp IV: là những đồng phân enzym có 41 – 47% trình tự axitamin ở tâm
xúc tác của chúng tƣơng tự kitinaza lớp I, phân tử cũng có đoạn
giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so với
kitinaza lớp I.
Lớp V:Dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn
kitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều.

mạch cacbon và sản phẩm tạo thành chủ yếu là kitobiose và kiotriose.
Những chất này sau đó tiếp tục bị phân cắt thành các monome là các N-acetyl- D-
glucozamin.
Quá trình phân giải kitin đƣợc tóm tắt nhƣ sau :
Kitin → kitobiose, kitotriose → N-acetyl- D-glucozamin.
Sự thủy phân kitin có thể xảy ra theo 2 cơ chế : cơ chế giữ lại các cấu tử β-
anome trong sản phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng β sang dạng α đƣợc thể
hiện ở hình 3.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 20 Hình 5: cơ chế phân giải tại trung tâm hoạt động của kitinaza
1. Cơ chế giữ lại các cấu tử β- monome của kitinaza họ 18
2. Cơ chế chuyển nghịch từ dạng β sang dạng α
1.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của kitinaza.
1.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ [5]
Hầu hết kitinaza hoạt động ở giới hạn nhiệt độ 20
0
C – 50
0
C. Nhìn chung nhiệt
độ tối ƣu cho kitinaza ở vi sinh vật hoạt động là 30
0
C- 40
0
C, ngoại trừ kitinaza
của Aspergillusnigercó nhiệt độ tối thích là 50

Ở động vật có xƣơng sống, kitinaza đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày
của các loài nhƣ: cá, lƣỡng cƣ, chim và thú ăn sâu bọ để tiêu hoá nguồn thức ăn
chứa kitin và chúng chủ yếu đƣợc xếp vào loại endo- kitinaza.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 22

Kitinaza của côn trùng đƣợc quy định bởi các kích thích tố trong quá trình
hình thành ấu trùng. Ở côn trùng kitinaza có vai trò hết sức quan trọng trong việc
bảo vệ để chống lại các kí sinh nhƣ nấm gây bệnh.
Kitinaza trong động vật giáp xác nhƣ tôm, cua,…chúng đã hoạt động trƣớc
khi quá trình lột xác của nhóm động vật này xảy ra.
1.2.4.2 Kitinaza từ thực vật
Kitinaza đƣợc tìm thấy trong cây ở các bộ phận nhƣ hạt, thân cây, củ, hoa, mô và
liên quan phát triển của cây. Trong cây kitinaza đƣợc sản xuất bởi sự tiếp xúc mầm
bệnh.
Các thực vật bậc cao có kitinaza nhƣ: trong khoai tây, thuốc lá, trái cây, đậu,
cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan,…Chúng đã đƣợc biết đến với vai trò
phòng bảo vệ tránh khỏi các tác nhân gây hại cho cơ thể thực vật. [22].
1.2.4.3 Kitinaza từ vi sinh vật [6, 8, 35]
Trong các nguồn thu nhận kitinaza thì kitinaza từ vi sinh vật là nguồn quan trọng
nhất và cónhiều bằng chứng chỉ ra rằng, kitin là nguồn dinh dƣỡng của hầu hết vi
sinh vật.Phần lớn các sinh vật nhân sơ, trong đó thuộc vi khuẩn phải kể đến nhƣ
Bacilli, Serratia,Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium,
Vibrio, Arthrobacter,Beneckea, Aeromonas và Streptomyces. Trong nấm nhƣ
Trichoderma, Penicillium, Lecanicillium, Neurospora, Mucor,
Beauveria,Lycoperdon, Aspergillus, Myrothecium, Conidiobolus, Metharhizium,
Stachybotrys và Agaricus.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học


ngoại bào của chúng rất phong phú bao gồm: Cacbohydrat, proteaza,
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 24

penicilinaza,…. Trong đó thƣờng gặp trong nhóm Cacbohydrat là amilaza,
cenlulaza và kitinaza [21].
1.2.5 Ứng dụng của kitinaza.[9, 24]
Kitinaza phổ biến ở hầu hết các sinh vật từ nhân sơ đến nhân thật và có mặt ở cả
virus nhóm sinh vật chƣa có cấu tạo tế bào. Dựa vào tính chất kitinaza đƣợc sử
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ: công nghiệp, nông nghiệp và
thuỷ sản.
Kitinaza phân giải kitin từ các sản phẩm thải vỏ tôm, cua,…thành nguồn nitơ và
cacbon đơn giản đƣợc sử dụng nhiều trong quá trình lên men dùng để sản xuất
protein đơn bào: thức ăn nuôi cá, gà, lợn, trâu, bò.
Trong nông nghiệp các chủng vi sinh vật chứa enzyme này đƣợc dùng trong biện
pháp đấu tranh sinh học chống lại nhiều côn trùng và nấm gây hại.
Trong thuỷ sản, các vi sinh vật tiết kitinaza đƣợc sử dụng để sản xuất các chế
phẩm làm sạch các ao nuôi tôm.
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam đã và đang nghiên cứu chế phẩm sinh học
chứa kitinaza có tác dụng phân giải sản phẩm thải kitin tăng hiệu quả kinh tế trong
nông nghiệp và chăn nuôi thuỷ sản nhƣ: chế phẩm sinh học BIMA chứa hệ enzym
trong đó có kitinaza của Viện KH-CN thành phố Hồ Chí Minh có tác dụng kháng
nấm và côn trùng gây hại cây trồng, đồng thời tăng khả năng phân giải chất hữu
cơ, tăng năng suất cây trồng.
Mỹ và Anh đã đang sản xuất chế phẩm sinh học diệt trừ mối và đang đƣợc
ứng dụng rộng rãi.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 25