Chương 1 GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Nem chua là thực phẩm lên men truyền thống được sản xuất thủ công, mang
sắc thái kinh nghiệm lưu truyền từ đời này sang đời khác của người Việt Nam. Tuy
nem chua không phải là một món ăn đòi hỏi cần phải chế biến công phu, cầu kỳ và
trang trí đẹp mắt, nhưng nó lại luôn là một món ăn được người dân yêu thích từ
trước đến nay. Hay cũng có thể nói chính sự đơn giản trong khâu chế biến cùng với
hương thơm và vị chua dễ chịu của nem chua đã mang lại lợi thế cho sản phẩm này.
Quá trình chín của nem chua không qua phương pháp xử lí nhiệt, nên phần lớn các
chất dinh dưỡng quí trong thịt như các acid amin hòa tan không bị mất đi. Hương
thơm và vị chua đặc trưng của nem chua giúp cho người sử dụng có cảm giác dễ
chịu khi ăn cũng như quá trình tiêu hóa được dễ dàng hơn.
Từ trước đến nay, nem chua được chế biến theo phương pháp truyền thống
nên không thể tránh khỏi những nhược điểm của phương pháp này. Đó là phụ thuộc
vào hệ vi sinh vật có trong tự nhiên và có trong thịt, phụ thuộc vào điều kiện giết
mổ, chất lượng thịt, môi trường bên ngoài, đặc biệt là nhiệt độ…Tất cả những yếu
tố đó không thể khống chế được, gây ra sự mất ổn định chất lượng của sản phẩm,
tăng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường hay khó kiểm
soát được sự phát triển của các tạp khuẩn có trong thịt gây nguy hiểm cho sức khoẻ
người tiêu dùng.
Trong chiến lược công nghiệp hóa qui trình sản xuất sản phẩm truyền thống
trên thị trường, việc tạo ra được một sản phẩm có chất lượng ổn định và mùi vị phù
hợp với thị hiếu tiêu dùng của người Việt Nam là cần thiết. Đề tài: “Phân lập và
định danh vi khuẩn lactic lên men nem chua tỉnh Đồng Tháp và Thành phố
Cần Thơ” nhằm mục đích là chủ động được giống vi khuẩn cho sản xuất nem chua,
từ đó làm cơ sở để tăng hương vị thơm ngon, tăng giá trị dinh dưỡng, rút ngắn thời
gian sản xuất, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng, giúp sản phẩm
được sản xuất với qui mô lớn, mang sản phẩm đến thị trường tiêu thụ rộng hơn.
1
1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua

g
g
g
g
mg
mg
410
68,0
21,7
4,3
3,7
24,0
78,0
3
2.1.2 Hệ vi sinh vật của thịt
Thịt của gia súc khỏe thường ít vi sinh vật, tuy nhiên thịt có thể bị nhiễm bẩn
khi giết mổ, vận chuyển và bảo quản. Hai nguồn chính gây nhiễm vi sinh vật trên
thịt là các cơ quan nội tạng có bệnh hoặc viêm nhễm, đặc biệt là các vi sinh vật ở
đường tiêu hóa và các vi sinh vật từ bên ngoài.
Vi sinh vật thường nhiễm nhiều ở trên bề mặt thịt và phát triển làm cho số
lượng tăng nhanh dần lên, đặc biệt là những miếng thịt giữ trong điều kiện nóng
làm cho số lượng vi sinh vật tăng nhanh, gây cho thịt chóng bị hư hỏng. Ở đây có
thể tìm thấy các bào tử của nấm mốc thuộc các giống như Mucor, Penicilium,… các
giống vi khuẩn như Bacillus, Salmonella,… trong đó các vi sinh vật phát triển trên
thịt ở nhiệt độ lạnh có Achromobacter, Pseudomonas…Ngoài ra nấm men cũng
được thấy phát triển trên thịt (Lương Đức Phẩm, 2002).
Sau khi vi sinh vật phát triển trên thịt sẽ dần ngấm sâu vào bên trong làm hư
hỏng thịt. Quá trình ngấm này phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật và vào những
điều kiện bên ngoài như ẩm độ, nhiệt độ, kỹ thuật bảo quản, phương pháp
chế biến… Vi khuẩn Salmonella trong điều kiện nhiệt độ bình thường sau 24-48 giờ

Loại thịt Thành phần hóa học (g/100 g)
Nước Protein Lipid Khoáng Năng lượng (Cal)
Bò 70,5 18 10,5 1 171
Lợn mỡ 47,5 14,5 37,5 0,7 406
Lợn ½ nạc 60,9 16,5 21,5 1,1 268
Lợn nạc 73 19 7 1 143
5
2.1.5.2 Muối
Muối có tác dụng làm tăng vị của sản phẩm, diệt khuẩn, hạn chế sự hoạt
động của vi sinh vật gây thối, tăng cường sự hoạt động của vi khuẩn lactic nên tạo
điều kiện lên men lactic và sản phẩm có hương vị thơm ngon, muối ở nồng độ cao
sẽ ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật, kể cả vi khuẩn lactic. Do đó có thể
điều chỉnh lượng acid lactic theo ý muốn bằng cách khống chế nồng độ muối ở mức
thích hợp (Nguyễn Văn Tiếp et al., 2003).
2.1.5.3 Tỏi
Tỏi được trồng khắp nơi trên thế giới, tỏi là loại gia vị dùng để ướp, khử mùi
hay tạo mùi cho nguyên liệu. Tỏi có vị cay, tính ôn, ngoài làm gia vị, các thành
phần khác trong tỏi còn có tác dụng kháng sinh mạnh. Ngoài một ít iode và tinh dầu
(100 kg tỏi chứa 60-200 g tinh dầu), thành phần chủ yếu trong tỏi là chất kháng sinh
alicin (C
6
H
10
OS
2
) là một hợp chất sulfur có tác dụng diệt khuẩn rất mạnh đối với vi
sinh vật như Staphylococcus, Salmonella, Shigella…
( />2.1.5.4 Tiêu
Tiêu là một loại gia vị thường được sử dụng để tăng giá trị cảm quan cho sản
phẩm. Thành phần hóa học của tiêu gồm có tinh dầu và hai loại ankaloid là piperin

H
6
O
3
Công thức cấu tạo: CH
3
-CHOH-COOH
( />2.2.3 Vi khuẩn lactic
Năm 1780, nhà bác học Thụy Điển Schaele lần đầu tiên đã tách được acid
lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1857, L. Pasteur đã chứng minh rằng sữa chua
là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn lactic. Năm
1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactis,
nay gọi là Streptococcus lactis (Nguyễn Thành Đạt, 2001).
2.2.3.1 Đặc điểm chung
Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu (hoặc hình ovan) và hình que, kích
thước 0,5-1,1 µm, đôi khi đến 1,6 µm, tạo khuẩn lạc nhỏ 2 mm-5 mm, khuẩn lạc có
đặc điểm bìa liền, lồi, nhẵn, sáng (Kandler và Weiss, 1986).
Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, không sinh bào tử, Gram
dương, kị khí không bắt buộc. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành acid
lactic rất khác nhau trong môi trường và như vậy sức chịu acid (hay độ bền với
7
acid) cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn
(khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển
ở pH trong khoảng 3,8-4. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH
trong khoảng 5,5-6 (Lương Đức Phẩm, 2002).
Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 35
o
C, các loài
ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40
o

Giống Leuconostoc có đường kính từ 0,5-0,8 µm và chiều dài khoảng 1,6
µm, trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1,3 µm.
8
Sau khi phân chia Leuconostoc thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám
tập trung (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Leuconostoc thường là vi khuẩn kị khí không bắt buộc và có nhu cầu cao về
dinh dưỡng. Leuconostoc phát triển từ 20°C-30°C và không phát triển ở 45°C. Đó là
những giống lây nhiễm thường xuyên trong thực phẩm và gây ra những rủi ro trong
quá trình sản xuất nhất là trong các sản phẩm đường, sản phẩm acid hay trong các
sản phẩm thực vật khác. Leuconostoc có vai trò chính trong quá trình lên men
malolactic của rượu vang và chúng cần thiết cho sự lên men của một vài loại
phômai. Ngoài ra, Leuconostoc cũng tham gia trong việc chế biến các sản phẩm
thức ăn gia súc lên men và trong các sản phẩm rau quả lên men (Roissart và Luquet,
1994; Guiraud, et al., 1998).
Leuconostoc thuộc nhóm lên men lactic dị hình, catalase âm tính.
Leuconostoc phát triển chậm, thường gây nên môi trường có độ nhớt cao mặc dù
chúng có thể tạo ra các hợp chất thơm như axetyle, axetole,…(Larpent et al., 1997).
* Pediococcus
Pediococcus có dạng tứ cầu hoặc song cầu. Pediococcus cần nhu cầu dinh
dưỡng cao và hoạt tính thủy phân protein yếu. Khuẩn lạc có màu vàng xanh, kích
thước khuẩn lạc 1-3 mm, hình dạng khuẩn lạc trơn láng (Nguyễn Thành Đạt, 2001).
Vi khuẩn lactic cũng được phân loại tùy theo hình thức lên men của chúng,
chúng được chia làm hai loại gồm nhóm vi khuẩn lactic đồng hình và nhóm vi
khuẩn lactic dị hình.
* Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình
Lactobacillus plantarum thường hiện diện trong nước bọt và đường tiêu hóa
của người. Tên khác của Lactobacillus plantarum là Lactobacillus pentosus,
Lactobacillus arabinosus (Robert, 1957). Lactobacillus plantarum là vi khuẩn kị
khí, ngẫu nhiên, trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi hoặc chuỗi. Nhiệt độ tối thích cho
vi khuẩn này sinh trưởng là 30

Lactobacillus brevis được tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải,
dưa chuột nên còn được gọi là trực khuẩn bắp cải. Trong lên men, ngoài acid lactic
(1,2%) nó còn tạo thành acid acetic, etanol (tới 2,4%), và CO
2
, nó còn tạo hương
làm cho sản phẩm có hương vị dễ chịu (Lương Đức Phẩm, 2002).
Weissella paremesenteroides đã được tìm thấy trên dưa chuột về khả năng
sinh bacteriocin DFR-8 có thể ngăn chặn một số lượng lớn mầm bệnh như Listeria
monocytogenes (Pal và Ramana, 2010).
2.2.3.3 Ý nghĩa thực tế của lên men lactic
Vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là
trong công nghiệp chế biến sữa. Các vi khuẩn này có một ý nghĩa rất lớn trong sản
xuất sữa, phômai, trong việc muối chua rau quả ủ chua thức ăn chăn nuôi. Những
10
năm gần đây vi khuẩn lactic đã được đưa vào trong việc chế biến một số dạng giò
chả, xúc xích
Trong công nghiệp đã xây dựng các dây chuyền công nghệ lên men để sản
xuất acid lactic. Acid lactic được dùng nhiều cho công nghệ đồ hộp và bánh kẹo,
sản xuất thức ăn kiêng, thức ăn chống suy dinh dưỡng ở người già và trẻ em
nguyên liệu dùng trong sản xuất acid lactic là mật bột, tinh bột và những vật liệu
chứa tinh bột (Lương Đức Phẩm, 2002).
Trong quá trình lên men thịt, chức năng chính của vi khuẩn lactic là làm pH
của bột thịt giảm nhanh (tăng tính ổn định của sản phẩm và khả năng sống của vi
khuẩn lactic bằng cách ức chế những vi sinh vật gây hư hỏng không mong muốn).
Vi khuẩn lactic còn góp phần tạo ra những thay đổi sinh hóa để có được những đặc
điểm cảm quan mới cho độ chín của sản phẩm (Ho et al., 2009).
Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh
vực probiotic (Champ et al., 1983). Hoạt động của Lactobacillus rất hiệu quả trong
việc tạo khả năng bám dính vào tế bào, loại trừ hoặc làm giảm sự lan truyền bệnh
(Muralihara, 1977).

O
6
C
3
H
6
O
3
+ C
2
H
4
(COOH)
2
+ CH
3
COOH + C
2
H
5
OH + CO
2
+ H
2
(Glucose) (Acid lactic) (acid succinic) (acid acetic) (etanol)
11
(Lương Đức Phẩm, 2002)
2.2.7 Điều kiện của quá trình lên men lactic
2.2.7.1 Các cấu tử môi trường
Glucid là một trong những thành phần chủ yếu của môi trường cần thiết cho

độ thì sẽ xảy ra sự biến tính protein (Đồng Thị Thanh Thu, 1995).
* pH của môi trường
Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzym của chúng, chịu tác
động mạnh của pH. Mỗi enzym đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của
12
enzym cao nhất. Các vi khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,6-6,2
(Lactobacillus); 5,5-6,5 (Pediococcus) (Trần Minh Tâm, 1998). Trong quá trình lên
men lactic, acid lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các vi sinh vật khác. Sau
đó khi lượng acid tích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế. Tốc độ
phát triển cũng như lượng sản phẩm trao đổi chất sẽ giảm khi lượng acid lactic quá
nhiều. Acid lactic sinh ra làm giảm pH của sản phẩm và là một phương thức bảo
quản sản phẩm hữu hiệu. pH < 4 vi khuẩn lactic ngừng hoạt động (Trần Minh Tâm,
1998).
* Oxy
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn yếm khí không bắt buộc. Do đó, oxy không ảnh
hưởng đến quá lên men của vi khuẩn tuy nhiên càng thiếu oxy sẽ có lợi cho quá
trình lên men lactic (Trần Minh Tâm, 1998).
2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN NEM CHUA
Quá trình lên men lactic trong sản xuất nem chua xảy ra đồng thời hai quá
trình sinh hóa là quá trình lên men lactic và quá trình thủy phân protein. Trong quá
trình lên men lactic, các vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa lượng đường có trong nem
thành acid lactic và các sản phẩm phụ tạo cho nem có vị chua và các mùi vị khác
đặc trưng. Trong quá trình lên men lactic, vi khuẩn lactic tạo ra một lượng nhỏ
protease góp phần vào quá trình thủy phân protein. Song song với quá trình lên men
lactic là quá trình thủy phân protein được thực hiện bởi enzyme protease có sẵn
trong nguyên liệu và do vi sinh vật tạo ra trong quá trình trao đổi chất của nó, tạo
thành các polypeptid, peptid, acid amin làm tăng chất lượng sản phẩm.
Mặt khác, acid lactic tạo thành từ quá trình lên men làm giảm pH của thịt
xuống thấp (khoảng 4,5) làm protein của thịt bị đông tụ. Bên cạnh đó môi trường
acid còn giúp ức chế hoạt động của các vi khuẩn gây thối rữa, giúp miếng nem

quan trọng trong việc hình thành các chất tham gia vào quá trình tạo hương. Các
14
loài lên men dị hình đưa lại cho sản phẩm hương thơm nhờ việc sinh ra các acid dễ
bay hơi, rượu và CO
2

(Susanna, 2001).
2.5 PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VI KHUẨN BẰNG KỸ THUẬT PCR
2.5.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR do Mullis phát minh vào năm 1985 được sử dụng rộng rãi
nhất. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền
nhờ enzym polymerase) là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự ADN đặc hiệu in
vitro, không cần sự hiện diện của tế bào; chỉ với sự hiện diện của một cặp mồi
(primers pair) chuyên biệt, enzym ADN polymerase, các nucleotide tự do, dung
dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Đây là
sự khuếch đại theo cấp số nhân. Đoạn trình tự ADN đặc trưng sẽ được khuếch đại
với số lượng là 2
n-1
với n là số chu kỳ phản ứng. Theo tính toán sau 30 chu kỳ, sự
khuếch đại sẽ là 10
6
so với số lượng bản mẫu ban đầu. Mỗi chu kỳ phản ứng gồm
ba bước.
Giai đoạn biến tính (denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm
các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94
o
C- 95
o

“kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi. Tm của mồi
xuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau. Thành phần nucleotide của các mồi
phải cân bằng tránh lặp lại nhiều lần các cặp GC. Các mồi được chọn phải đặc trưng
cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lai trên gene.
Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu
trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-
thuat-PCR-can-ban-30k).
ADN mẫu
Phản ứng PCR tối ưu khi ADN thật tinh sạch. Tuy nhiên nhiều kĩ thuật chẩn
đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả đối với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào
hoặc ngay cả mẫu ADN không được bảo quản tốt. Ngoài ra, phản ứng PCR tối ưu
cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu. Lượng ADN mẫu sử dụng cũng có khuynh
hướng giảm (1 µg xuống còn 100 ng) khi sử dụng các ADN polymerase cho hiệu
quả cao. Việc giảm lượng mẫu còn hạn chế được sự khuếch đại “kí sinh” tạo những
sản phẩm phụ không mong muốn.
(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-
thuat-PCR-can-ban-30k).
16
Enzym
Enzym được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I. Đây
là enzym không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Hiện nay, một số
enzym mới có hiệu quả hơn. ADN polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi
khuẩn hiện diện trong suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzym này được viết tắt
Taq polymerase. Polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt
động như một enzym phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mg
2+
; ngược
lại, khi khuôn là ADN và có ion Mg
2+

do hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của
phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được
tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau
17
(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-
thuat-PCR-can-ban-30k).
2.6 Điện di gel agarose
Sau phản ứng PCR, các ADN của vi khuẩn được nhuộm bởi Ethidium
bromide và điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và quan sát kết quả dưới tia UV.
2.6.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các
nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi
chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện
trường (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
2.6.2 Gel agarose
Đây là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng
để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5-20 kb. Gel được đổ trên
một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một
hóa chất có tên là ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các
base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Trong
thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ. Sau điện di, gel được
chiếu sáng bằng tia tử ngoại, nucleic acid sẽ hiện dưới dạng những vạch màu đỏ
cam (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
2.7 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ADN
Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương
pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và
giải các nhầm lẫn do kỹ thuật. Có hai loại mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng cho
mỗi mạch đơn ADN. Tiến hành biến tính ADN trong môi trường có urea và nhiệt

3.1.1 Thời gian thực hiện
Từ tháng 06 năm 2009 đến tháng 07 năm 2010.
3.1.2 Địa điểm
Mẫu được thu từ 6 hiệu nem tại huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp gồm Út
Thẳng được kí hiệu là UT, Tư Kiên được kí hiệu là TK, Giáo Thơ được kí hiệu là
GT, Cô Hiệp được kí hiệu là CH, Thanh Sơn được kí hiệu là TS, Sáu Xệ được kí
hiệu là SX và nem ở tại Cần Thơ gồm nem Cái Răng (Cô Phúc được kí hiệu là CP),
Thanh Vân được kí hiệu là TV (Cần Thơ).
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học Khoa Khoa Học
Tự nhiên và phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ .
Hình 1: Tên một số loại nem được dùng trong phân lập
20
3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.2.1 Dụng cụ, thiết bị
- Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm: đĩa Petri, ống nghiệm,
que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, kính mang vật, kính đậy vật
- Cân phân tích (Mettler Toler, Switzerland)
- Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)
- Máy lắc (Heidolph MR3001, Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt (HVE.50)
- Máy li tâm (Eppendorf, Đức)
- Tủ sấy (Memmer, Đức)
- Máy đo pH (Thermo Oriox, Belgium)
Hình 2 Một số dụng cụ trong phòng thí nghiệm
A B
C
D
21
Chú thích: A: Máy PCR Perkin Elmer 9700

Dung dịch Lugol iodine
Dung dịch safranin
Hóa chất dùng để trích ADN vi khuẩn lactic
Môi trường LB (Luria Bertani)
22
Bảng 4 Môi trường LB
TE để hòa tan ADN (gồm 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA).
Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% hòa tan ADN và giúp proteinase K hoạt
động tách protein khỏi ADN hiệu quả hơn.
Isopropanol nhằm tủa ADN và etanol 70% dùng rửa ADN
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% NaCl 0,75 M.
Proteinase K (20 mg/ml) để loại bỏ protein hoặc polysaccharid khỏi ADN.
Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) nhằm tủa protein và tạo màng ngăn
giữa ADN và protein.
Lysozyme và RNase A ; nước cất hai lần vô trùng.
Hóa chất dùng để chạy PCR nhận diện vi khuẩn lactic
PCR buffer, Taq-polymerase
ADN vi khuẩn
Deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs) gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP
Nước cất vô trùng, primer
Hóa chất dùng để chạy điện di sản phẩm PCR
Agarose 1%-1,2%, TAE buffer (hỗn hợp của Tris base, Acetic acid và
EDTA), loading buffer, Ethidium bromide (EtBr), ADN chuẩn để ước lượng kích
thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose.
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phân lập vi khuẩn lactic
2 g mẫu nem được cho vào bình tam giác 100 ml nước cất đã khử trùng, lắc
trên máy lắc khoảng 30 phút. 50 µl dung dịch sau khi lắc được cho vào dĩa petri có
chứa môi trường đặc MRS đã chuẩn bị trước. Mẫu được trải đều và ủ ở 30
o

Cấy vào ống thạch nghiêng
Trữ ở 4
o
C
Trải vi khuẩn
24
cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó, vi khuẩn được nhuộm với một đến hai giọt
crystal violet trên kính mang vật trong 2 phút.
Sau khi rửa tiêu bản bằng nước cất vô trùng và để khô, tiếp tục cho một đến
hai giọt dung dịch iod lên kính mang vật trong 1 phút. Tiêu bản được rửa bằng nước
cất vô trùng hai lần và rửa bằng cồn 70
o
thật nhanh để tẩy hết màu tím của crystal
violet. Sau đó tiêu bản được rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây và để khô.
Vi khuẩn được tiếp tục nhuộm bằng một đến hai giọt fushin, rồi trải đều bằng
que cấy trong 1 phút. Cuối cùng tiêu bản được rửa bằng nước cất vô trùng, để khô
và quan sát dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram
của vi khuẩn. Vi khuẩn Gram dương sẽ có màu tím xanh, vi khuẩn Gram âm có
màu hồng đỏ.
3.3.2.2 Phản ứng catalse
Enzym catalase được tìm thấy trong đa số vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn hiếu
khí, có khả năng biến đổi H
2
O
2
thành O
2
và H
2
O. Catalase có thể được phát hiện