BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)
CỦA VIỆT NAM”

LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

năm 2020


LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS.
Trần Mỹ Linh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam (VAST), TS. Nguyễn Tƣờng Vân – Viện Công nghệ sinh học,
VAST và ThS. Nguyễn Chi Mai - Viện Hóa sinh biển, VAST đã tận tình
hƣớng dẫn, động viên tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn
Nhiệm vụ HTQT cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số
QTBY01.05/18-19 do TS. Trần Mỹ Linh làm chủ nhiệm đã hỗ trợ trong q
trình thực hiện nghiên cứu.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Học viện Khoa
học và Cơng nghệ, VAST đã hết lịng truyền đạt kiến thức cho tôi xong suốt
hai năm học vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Phòng Nghiên cứu Tài
nguyên sinh vật – Viện Hóa sinh biển, VAST đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp
đỡ tơi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng

năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Huyền

2

1.2.2.

Các yếu tố chính ảnh hƣởng ni cấy mơ và tế bào cây thuốc in vitro....... 16

1.2.3.

Nuôi nhân chồi in vitro ................................................................................ 19

1.2.4.

Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù ......................................................... 20

1.3. Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cƣờng sx chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 23
1.4. Những thách thức trong sản xuất chất thứ cấp in vitro ...................................... 26
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 27
2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 27
2.1.1. Các giống thực vật nghiên cứu ........................................................................ 27
2.1.2. Các môi trƣờng dùng cho nghiên cứu ............................................................. 27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 28
2.2.1. Khử trùng và nảy mầm hạt .............................................................................. 28
2.2.2. Tạo nguồn vật liệu bằng phƣơng pháp nhân nhanh chồi in vitro ................... 28
2.2.3. Thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo từ đoạn thân dừa cạn .................................. 28
2.2.3.1. Tối ƣu hóa loại và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng lên khả năng tạo mơ
sẹo.............................................................................................................................. 28
2.2.3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của ví trí và kích thƣớc đoạn thân đến hình thành mơ
sẹo.............................................................................................................................. 29
3


2.2.3.3. Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân ................................................................. 29

4


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4,5-T

2,4,5-Trichlorophenoxyacetic axit

2,4-D

Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic

B5

Môi trƣờng nuôi cấy của Gamborg (1968)

BAP

6-benzyladenine

CT

Công thức

DDW

Nƣớc cất hai lần (double distilled water)

DW


TDZ

Thidiazuron

5


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thông tin ký hiệu mẫu dừa cạn ...................................................... 27
Bảng 2.2: Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy mô ...................................... 27
Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo mô sẹo của các đoạn lóng thân lên mơi trƣờng CT2 ...... 36
Bảng 3.2 A. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn giống QN02 thử nghiệm trên
các công thức của môi trƣờng nhân nhanh tế bào ........................................... 45
Bảng 3.2 B. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn giống H01 thử nghiệm trên các
công thức của môi trƣờng nhân nhanh tế bào ................................................. 45
Bảng 3.3. Sự tăng trƣởng của tế bào dừa cạn QN02 sau 27 ngày nuôi cấy ... 48
Bảng 3.4. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn thử nghiệm trong môi trƣờng lỏng
CT4 nhân nhanh tế bào huyền phù trong thí nghiệm cấy chuyển tế bào từ mơi
trƣờng đặc CT3 sang môi trƣờng lỏng CT4 .................................................... 51

6


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây dừa cạn .................................................................................... 10
Hình 2.1. Lựa chọn đoạn thân trong thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo ở dừa
cạn ................................................................................................................... 29
Hình 3.1. Hạt dừa cạn nảy mầm sau 1 tuần gieo hạt ...................................... 33
Hình 3.2. Hình ảnh thí nghiệm nhân chồi dừa cạn tạo ngun liệu cho TN tạo
mơ sẹo ............................................................................................................. 34

bệnh có nguồn gốc từ thực vật, hơn 60% thuốc điều trị ung thƣ trực tiếp hoặc
gián tiếp từ thực vật và có nhiều loại khơng có sản phẩm tổng hợp hoặc bán
tổng hợp thay thế. Vì thế nguồn sinh khối thực vật đang ngày một tăng cao và
những nghiên cứu nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có
hoạt tính dƣợc học là đòi hỏi cấp bách..
Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật đã có
những bƣớc phát triển vƣợt bậc, là một phƣơng pháp thay thế thích hợp trong
việc tạo các nguồn sinh khối ở quy mơ khác nhau khơng phụ thuộc vào mùa
vụ. Ngồi ra, việc ni cấy mơ tế bào cịn có thể tiến hành ở bất cứ nơi nào
trong điều kiện vô trùng và không phải sử dụng các chất bảo vệ thực vật độc
hại. Một trong những tiến bộ đáng kể trong kỹ thuật ni cấy mơ thực vật
chính là tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào không bị biệt hóa) của thực vật để
nghiên cứu các hoạt tính sinh học và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá
trị. Ni cấy tế bào huyền phù cịn là một trong những giải pháp để cải thiện
khó khăn khi nồng độ các chất trao đổi thứ cấp trong cây thấp và đã đƣợc phát
triển thành công nhƣ chất artemisinin (phân lập từ cây thanh hao hoa vàng, có
tác dụng chữa sốt rét) và chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ cây thơng đỏ,
có tác dụng chữa ung thƣ).
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) G. Don) là cây dƣợc liệu, chứa
nhiều chất thứ cấp khác nhau trong đó có nhóm chất terpenoid alkaloid có
nhân indole (TIA) nhƣ vinblastine và vincristine để điều trị một số bệnh ung
thƣ nguy hiểm nhƣ bệnh bạch cầu, ung thƣ hạch bạch huyết
8


(lymphosarcoma), ung thƣ biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần
kinh, ung thƣ vú, ung thƣ phổi, bệnh Hodgkin, các khối u dạng Wilkin và ung
thƣ tế bào lƣới. Trên thực tế nhu cầu về các alkaloid ngày một tăng, nhƣng
quá trình sản xuất những hợp chất này vẫn gặp nhiều khó khăn do hai hợp
chất này chỉ có mặt trong cây dừa cạn với hàm lƣợng rất thấp, khoảng 0,00020,0005% tổng hàm lƣợng alkaloid trong cây và phụ thuộc vào giống và các

Catharanthus gồm 8 lồi, trong đó 7 lồi có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar
(C. coriaceus, C. lanceus, C. longifolius, C. ovalis, C. roseus, C. scitulus, C.
trichophyllus) và 1 loài C. pusillus từ Ấn Độ. Loài Catharanthus roseus (L)
G. Don (dừa cạn) đƣợc du nhập vào Việt Nam, phân bố ở nhiều vùng, trải dài
từ Bắc vào Nam [1]. Loài cây này chủ yếu đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới, ở
những vùng lạnh cây đƣợc trồng vào mùa hè vì khơng chịu đƣợc lạnh.

Hình 1.1: Cây dừa cạn (Nguồn: http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/195)
Dừa cạn là dạng cây thƣờng xanh hoặc cây thân thảo, cao tới 80 cm
đến 1 m và hoa nở liên tục quanh năm với hoa màu hồng, tím hoặc trắng [2].
Lá cây có hình từ bầu dục đến thuôn, dài từ 2,5- 9,0 cm và rộng từ 1- 3,5 cm,
khơng có lơng, màu xanh bóng với một gân ở giữa màu nhạt và cuống lá
ngắn khoảng 1-1,8 cm và đƣợc sắp xếp theo cặp đối diện. Hai giống C.
roseus phổ biến nhất đƣợc đặt tên dựa trên màu hoa, bao gồm một giống hoa
màu hồng Rosel và một giống hoa màu trắng Alba. Hoa có nhiều màu từ màu
trắng đến hồng đậm với hoa gồm 5 cánh mỏng, tiểu nhụy gắn với phần trên
10


của ống vành, tâm bì rời ở nỗn sào với năm cánh giống thùy hoa. Quả là
một cặp nang dài khoảng 2-4 cm và rộng 3 mm. Dừa cạn C. roseus là một
loài khác biệt với hầu hết các loài khác trong họ ở khả năng tự tƣơng thích.
Tuy nhiên, q trình tự thụ phấn trong hoa thƣờng khơng xảy ra ở cây dừa cạn
vì sự tách biệt vật lý giữa nhụy và bao phấn, một hiện tƣợng đƣợc gọi là
herkogamy ngƣợc, khi nhụy bị thấp xuống dƣới mức bao phấn [3].
Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tƣơng
đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập
trung ở các tỉnh miền Trung nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế,
Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú n. Ngồi ra dừa cạn cịn xuất
hiện ở các đảo nhƣ Cô Tô, Côn Đảo và Phú Quốc [1]. Ở những vùng phân bố

cao huyết áp, trị bệnh tiểu đƣờng, tiêu hóa kém, lỵ thơng tiểu tiện, bệnh đi
tiểu đỏ và ít... Một số trƣờng hợp cịn dùng để trị ung thƣ máu, ung thƣ phổi
[7]. Trƣớc đây, nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tƣơng đối dồi dào.
Trƣớc năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1-3 tấn/năm.
Những năm gần đây, lƣợng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm)
thƣờng xuyên hơn, nhƣng chủ yếu là từ cây trồng tại Phú Yên.
1.2.

Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc bắt đầu từ đầu thế kỷ 20. Trong

những năm 1940 và 1960, những tiến bộ công nghệ đã dẫn đến sự phát triển
của kỹ thuật nuôi cấy mô tế thực vật nhằm nghiên cứu hoạt động của tế bào
(bao gồm tế bào học, dinh dƣỡng, chuyển hóa, q trình phát sinh hình thái,
hình thành phơi và bệnh học), tạo ra cây sạch bệnh và điều kiện lƣu trữ tế bào
và nhân giống vơ tính. Từ những năm 1960, q trình sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa thứ cấp đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi trong nhiều loại tế bào thực
vật và nhiều ứng dụng mới đã đƣợc phát triển, cải thiện đáng kể cho q
trình ni cấy mô và tế bào thực vật. Hiện nay, việc nuôi cấy tế bào thực vật
trở thành công cụ hiệu quả để sản xuất quy mô lớn các chất chuyển hóa thứ
12


cấp dùng trong chăm sóc sức khỏe cho con ngƣời (ví dụ, thuốc chống ung
thƣ) [8].
Những ƣu điểm chính của hệ thống nuôi cấy mô tế bào so với trồng trọt
ngoài tự nhiên bao gồm: các hợp chất thực vật đƣợc lựa chọn có thể đƣợc tạo
liên tục khơng phụ thuộc các yếu tố bên ngoài nhƣ mùa vụ, điều kiện đất đai
và khí hậu; các tế bào ni cấy không bị đe dọa bởi sự tấn công của vi sinh
vật hoặc côn trùng; các tế bào của bất kỳ lồi thực vật nào thậm chí là những

phân sinh, các mảnh lá non và các mô phù hợp khác, đƣợc khử trùng bề mặt
(vô trùng) để loại bỏ vi sinh vật sử dụng cồn 70% hoặc natri hypochlorite.
Tiếp theo, các vật liệu ban đầu đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp để
bắt đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro. Khởi đầu của hệ thống có thể là
tạo mơ sẹo từ các các mơ phân sinh, tạo cây hồn chỉnh, tạo chồi hoặc chỉ là
tạo rễ in vitro. Một vài vật liệu ban đầu nhƣ mảnh lá, có thêm một một số giai
đoạn đƣợc gọi là organogenesis để biến các dạng tế bào chuyên biệt thành các
tế bào có khả năng phân bào và phát triển mô sẹo (indirect organogenesis)
hoặc chồi và chồi trực tiếp từ mô ban đầu (direct organogenesis). Sau khi
thiết lập thành công giai đoạn khởi đầu nuôi cấy in vitro, không bị nhiễm với
vi khuẩn và nấm, các giai đoạn tiếp theo bao gồm quá trình nhân các tế bào,
mô, chồi và rễ. Các giai đoạn này rất quan trọng, có tính quyết định về hiệu
quả kinh tế của quá trình, chủ yếu là do càng nhiều tế bào và mô đƣợc sản
xuất, năng suất của các chất thứ cấp mục tiêu càng cao.
Việc nuôi cấy in vitro của các lồi cây thuốc có thể giúp sản xuất cây
dƣợc liệu theo nhiều phƣơng thức khác nhau nhƣ : i) vi nhân giống trên các
dịng vơ tính quy mô lớn với chất lƣợng di truyền ổn định và nồng độ chất
thứ cấp cao và nhân giống các lồi khó nhân giống bằng các phƣơng pháp
thơng thƣờng, chẳng hạn nhƣ cây có chu kỳ sinh trƣởng dài hoặc bị nhiễm
bệnh, ví dụ virus và vi khuẩn nếu nhân bằng phƣơng pháp vơ tính thơng
thƣờng; ii) sử dụng elicitor (sinh học hoặc phi sinh học áp dụng để kích thích
sản xuất các chất thứ cấp) để kích thích các mô trong điều kiện in vitro để sản
14


xuất chất thứ cấp mục tiêu; iii) biến đổi gen của cây thuốc để sản xuất chất
thứ cấp trong các mô cụ thể, nhằm cải thiện hiệu quả sản xuất sinh khối, tế
bào và do đó, chất thứ cấp từ các lồi hiếm hoặc khó phát triển trong tự nhiên,
hoặc các chất ở nồng độ thấp trong các loài ban đầu đƣợc cải thiện hiệu quả
hơn.

sản xuất các loại chất có hoạt tính khác nhau nhƣ vắc-xin, hormone và kháng
thể [11].
1.2.2. Các yếu tố chính ảnh hưởng ni cấy mơ và tế bào cây thuốc in vitro
Kiểu gen là yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp đối với việc sản xuất sinh
khối thực vật và chất thứ cấp. Các giống có hàm lƣợng chất thứ cấp cao là lựa
chọn đầu tiên cho việc sử dụng ni cấy mơ. Ví dụ nhƣ cây gai Ấn độ
(Pilocarpus microphyllus) có hàm lƣợng pilocarpin, một alkaloid có vai trị
tăng cƣờng hoạt động của hệ thần kinh giao cảm, nằm trong khoảng từ 16,3
đến 235,9 µg/g lá khơ tùy thuộc vào giống [12], có sự chênh lệch đến 14,5
lần về hàm lƣợng pilocarpin. Tuy nhiên, các kiểu gen quý của cây dƣợc liệu
có hàm lƣợng chất có hoạt tính cao cịn hạn chế và cần phải có những nghiên
cứu chi tiết đối với các giống ở từng vùng địa lý khác nhau.
Việc sử dụng các kiểu gen có hàm lƣợng chất thứ cấp tự nhiên cao là
điều kiện cần thiết để đảm bảo hiệu quả trong ni cấy in vitro cây thuốc do
chi phí của hệ thống nuôi cấy thƣờng cao hơn so với các kỹ thuật thơng
thƣờng khác. Bên cạnh đó, vì ni cấy in vitro dựa trên nguyên phân, các
kiểu gen sinh tổng hợp các chất có hoạt tính cao sẽ dẫn đến hàm lƣợng chất
mong muốn cao hơn đáng kể trong cây hoặc các mô đƣợc nuôi cấy. Tuy
nhiên, ngay cùng với một kiểu gen thì trong điều kiện phát triển ngồi tự
nhiên quần thể cây thƣờng có nhiều biến động về di truyền, dẫn đến biến
động về sinh khối và hàm lƣợng chất trao đổi thứ cấp [13]. Do đó, điều cần
thiết là phải nghiên cứu tƣơng tác giữa kiểu gen và môi trƣờng, để tạo ra điều
kiện nuôi trồng tốt nhất, kể cả với hệ thống nuôi cấy in vitro. Trong điều kiện
ni trồng ngồi tự nhiên, yếu tố nội sinh nhƣ kiểu gen, loại cơ quan và tuổi
16


mô, đồng hồ sinh học; và các yếu tố ngoại sinh, chẳng hạn nhƣ chu kỳ quang,
cƣờng độ chiếu sáng và bƣớc sóng, nhiệt độ, nguồn nƣớc, loại đất và thành
phần khơng khí, có thể riêng rẽ hoặc phối hợp ảnh hƣởng đến cả thành phần

thƣờng bao gồm môi trƣờng bán rắn, chứa agar hoặc mơi trƣờng lỏng, có
khuấy trộn khơng liên tục hoặc trong hệ thống bioreactor ngập tạm thời (TIB).
Việc sử dụng TIB đƣợc cho gia tăng tích lũy sinh khối tốt hơn so với nuôi cấy
trên môi trƣờng bán rắn [17, 18].
Các yếu tố phi sinh học, chẳng hạn nhƣ nhiệt độ, ánh sáng cƣờng độ,
thời gian chiếu sáng và bƣớc sóng, độ ẩm tƣơng đối và thành phần khơng khí
quyển trong bình ni cũng ảnh hƣởng mạnh đến sự tích lũy sinh khối tƣơi và
khô, nồng độ chất trong sinh khối và thời gian nuôi. Những đặc điểm trên
cũng phụ thuộc vào từng lồi cây thuốc cần ni cấy. Mơi trƣờng nuôi cấy và
các thành phần dinh dƣỡng, chẳng hạn nhƣ lƣợng nƣớc và áp suất của môi
trƣờng nuôi cấy, dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, carbohydrate, vitamin và axit
amin, và các chất kích thích sinh trƣởng thuộc các nhóm khác nhau nhƣ
auxin, cytokinin [19], gibberellin, jasmonate và salicylate [20] cũng ảnh
hƣởng sâu sắc đến các đặc điểm này.
Các yếu tố ảnh hƣởng khác là loại, cƣờng độ và thời gian tƣơng tác với
các elicitor, đƣợc sử dụng để kích thích sinh tổng hợp và tăng nồng độ PDMC
vào cuối chu kỳ tăng trƣởng hoặc tích lũy sinh khối thực vật [21]. Elicitor là
các chất hóa học đƣợc đƣa vào mơi trƣờng ni cấy, là bức xạ ion hóa hoặc
các yếu tố vật lý khác áp dụng cho các tế bào và mơ, hoặc thậm chí đồng ni
cấy mơ thực vật với các vi sinh vật nào đó [22] hoặc áp dụng các điều kiện
môi trƣờng bất lợi, chẳng hạn nhƣ nhiệt độ cao hoặc thấp trong một thời gian
nhất định. Trong số các chất elicitor hóa học đƣợc áp dụng cho mơi trƣờng
ni cấy, có cả các chất điều hịa sinh trƣởng nhƣ axit salicylic và jasmonic
[23], chitosan [24], chiết xuất từ vi sinh vật [25] và các dạng phân tử thế hệ
mới khác [26]. Trong số các yếu tố vật lý, bức xạ cực tím đã đƣợc sử dụng

18


thƣờng xun và có tác dụng kích hoạt các q trình khác nhau trong ni cấy

[19] đã bắt đầu bằng cấy đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 0,5 cm của cây trong
mơi trƣờng có bổ sung các loại cytokinin ở các nồng độ khác nhau. Đỉnh sinh
trƣởng đƣợc tách ra từ hạt đã đƣợc khử trùng và nảy mầm trên môi trƣờng
MS. Kết quả cho thấy, BAP (2-4 µM) có khả năng kích thích việc nhân chồi
và tạo sinh khối cao nhất. Liên quan đến việc sử dụng elicitor, Sharma và vs
[23] phát hiện hàm lƣợng bacoside cao nhất (8,73 mg/g sinh khối khô) thu
đƣợc ở chồi cây đắng biển Bacopa monnieri là từ các chồi đƣợc kích thích
với 45 mg/L CuSO4 trong mơi trƣờng nuôi cấy từ 6 đến 9 ngày. Đồng thời,
1,0 mg/l axit jasmonic và 50 µM axit salicylic trong thời gian 6 đến 9 ngày
cũng làm tăng tăng nồng độ bacoside là 8,46 và 8,14 mg/g so với đối chứng
khơng có elicitor (6,41 mg/g sinh khối khô).
1.2.4. Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù
Tạo mô sẹo và nhân mô sẹo đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất
sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học. Đây là hệ thống đƣợc cho là hiệu
quả nhất để sản xuất chất có hoạt tính trong thực vật ở quy mô lớn bởi chất
đƣợc tạo ra trực tiếp trong mô và các mô đƣợc nhân nhanh in vitro [16]. Các
yếu tố ảnh hƣởng đến việc nhân nhanh mô sẹo đã đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng
và nhiều quy trình nhân ni mô sẹo ổn định ở nhiều loại cây khác nhau đã
đƣợc sử dụng thƣơng mại [29].
Việc nuôi cấy mô sẹo cũng liên quan đến khả năng đáp ứng phản phân
hóa của nhiều dạng tế bào và mô từ các cơ quan khác nhau để tạo ra mô sẹo
trên môi trƣờng có các chất điều hịa sinh trƣởng thuộc nhóm auxin nhƣ
2,4D và/hoặc cùng với cytokinin [29]. Ƣu điểm của mô sẹo là hầu hết các tế
bào trong khối mô đều có khả năng tăng trƣởng liên tục trong mơi trƣờng
ni cấy thích hợp. Do đó, các tế bào duy trì các chu kỳ phân chia liên tục
trong giai đoạn đƣợc gọi là giai đoạn tăng trƣởng lũy thừa, sau đó là giai đoạn
dừng tăng trƣởng rồi giảm tăng trƣởng. Khả năng duy trì các tế bào này trong
điều kiện khơng biệt hóa giúp có thể dễ dàng tính đƣợc lƣợng sinh khối tạo ra
20




phyllantine và hypophyllanthin của các tế bào mô sẹo. Các mô sẹo thu cũng
đƣợc sử dụng tiếp để thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù và trở
thành một giai đoạn mới của nuôi cấy mô sẹo.

Nuôi cấy tế bào cây

Hypericum perforatum, có nguồn gốc châu Âu, đƣợc tiến hành trên môi
trƣờng MS lỏng chứa 1,0 mg/L 2,4-D và 0,2 mg/L BA từ các mô sẹo tơi xốp
đƣợc tạo thành trên mơi trƣờng đặc có cùng thành phần. Thông thƣờng các
đoạn thân tạo ra các dạng mô sẹo này, trong khi mô lá và hoa lại tạo ra dạng
mơ sẹo cứng, có màu xanh. Sau khi chuyển mơ sẹo tơi xốp sang mơi trƣờng
lỏng, các bình ni đƣợc đặt trên máy lắc quay và cấy chuyển sang chu kỳ
sinh trƣởng mới sau 20 ngày. Trọng lƣợng tƣơi (≈200 g/L) và khô (≈7-8 g/L)
tối đa thu đƣợc sau 20-25 ngày, kèm theo hàm lƣợng flavonoid tích lũy cũng
đạt cao nhất (≈15-16 mg/g DW). Wang và cs [35] cho thấy việc sử dụng
methyl jasmonate và axit salicylic cũng dẫn đến hàm lƣợng flavonoid trong tế
bào nuôi cấy huyền phù tăng gấp 2,1 và 1,5 lần so với đối chứng.
Nuôi cấy rễ tơ đƣợc tạo ra bởi lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes với các vật liệu ban đầu khác nhau in vitro là nguồn mô quan trọng
để sản xuất các chất thứ cấp với hàm lƣợng thƣờng cao hơn so với ni cấy tế
bào huyền phù ở một số lồi [36]. Sujatha và cs [37] đã sử dụng 4 chủng
Agrobacterium rhizogenes chuyển vào chồi, lá và đoạn thân của cây ngải cứu
Artemisia vulgaris và quan sát thấy rằng chủng A4GUS có hiệu suất vào các
mảnh lá là cao nhất đạt 92,6%. Từ tất cả các dòng rễ tơ chuyển gen thu đƣợc
từ lá , họ đã chọn đƣợc 2 dòng AV1 và AV2 phát triển tốt nhất, với độ tăng
sinh, phân nhánh và tích lũy sinh khối rễ tơ cao hơn các dịng khác. Việc ni
cấy các dịng rễ tơ biến đổi gen này đã tăng tốc độ phát triển của rễ lên gấp 9
lần và có nồng độ tinh dầu cao hơn so với các rễ không chuyển gen. Cảm ứng

trong q trình cấy chuyển cũng giúp chọn ra đƣợc các dòng tế bào có năng
suất cao, mặc dù các dịng này thƣờng khơng ổn định và có xu hƣớng giảm
khả năng sinh tổng hợp

sau nhiều chu trình cấy chuyển [39, 40, 41].

Mannonen và cs [42] đã sử dụng các phƣơng pháp giữ lạnh, các chất bảo vệ
và quá trình làm lạnh và giải lạnh khác nhau. Dầu khoáng đã đƣợc dùng để
23