BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

TRẦN THÁI THÀNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM
CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ
MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 60420201
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

TRẦN THÁI THÀNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM
CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ
MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

II- Nhiệm vụ và nội dung:
+ Nghiên cứu phương pháp sàng lọc mẫu.
+ Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lượng Tinopal CBS-X
trong nền mẫu.
+ Nghiên cứu điều kiện định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS.
III- Ngày giao nhiệm vụ: 05/10/2019
IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 04/05/2020
V- Cán bộ hướng dẫn: Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)



1

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện Luận văn
(Ký và ghi rõ họ tên)


2

xuyên suốt đề tài.
Kết quả nghiên cứu ở những mẫu thực phẩm bị làm trắng bởi Tinopal CBS-X
gồm mẫu chứa tinh bột và mẫu giàu chất xơ như củ kiệu, măng thì với phương pháp
định tính bằng máy soi UV bước sóng 365 nm được xây dựng với LOD: 25,0 µg/kg.
Đối với phương pháp định lượng độ thu hồi đạt 81 % – 108 %, dung môi thích hợp
được sử dụng là acetonitril có mặt 4 % H 3PO4. Các thông số điều kiện tối ưu trên hệ
thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UV-VIS để phân tích Tinopal CBS-X gồm: Cột
sắc ký lỏng pha đảo Eclipse C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và cột bảo vệ hay tương
đương; bước sóng: 347 nm; pha động gồm ACN và đệm ammonium formate pH 5
(gradient); tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 10 µl; giới hạn phát hiện và định
lượng tính trên nền mầu thử lần lượt là 0,4 mg/kg và 2,0 mg/kg. Từ đó nghiên cứu
thêm ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình chế biến cho thấy Tinopal CBS-X dễ bị
phân hủy ở nhiệt độ cao với độ thu hồi giảm đi 50 % so với mẫu chuẩn.
Đề tài sẽ tiếp tục nghiên cứu để mở rộng phạm vi áp dụng cho các nền thực
phẩm cần độ trắng cảm quan khác trong những đề tài tiếp theo, tiếp tục đánh giá các
phương pháp, quy trình và kết quả thu được; ứng dụng nhiều trong thực tiễn để phát
triển phương pháp có độ thu hồi cao và giới hạn phát hiện thấp hơn trong việc xác định
nồng độ Tinopal CBS-X trong thực phẩm.


4

ABSTRACT
Tinopal CBS-X is fluorescent whitening agent, which is banned from food use,
and often used to bleach starch products. The objective of the study is to determine the
optimal method of quantifying Tinopal CBS-X in food product. The quantitative
conditions include two factors, which are experimentally examined, such as extraction
solvent and system parameters. The HPLC UV-VIS probe method is used for examination
throughout the topic.
Research results on samples of food whitened by Tinopal CBS-X include samples

Các chất làm trắng quang học có thể được phân loại dựa trên cấu trúc và thuộc tính, vào
khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc khác nhau, hàng trăm hợp chất, và
hàng ngàn công thức khác nhau. Tất cả OBs đa vòng hydrocarbon thơm, cấu trúc có chứa
nhiều liên kết đôi có thể được kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím. Hàng ngàn công thức OBs
đã được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất làm trắng, nhưng tương đối ít đáp ứng
được yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất làm trắng làm trắng huỳnh quang (FWAs) đã
được nghiên cứu sử dụng...........................................................................................................19

1.3 Tinopal CBS-X................................................................................................21
1.3.1 Khái niệm..........................................................................................................................21
Theo Enzyclopediaof Industrial Chemistry, sản xuất distyrylbiphenylsulfonate bắt đầu với
biphenyl, được sản xuất cùng với các hợp chất thơm khác trong tinh chế dầu thô. Nó phản ứng
nhanh với hydrogen chloride và formaldehyde và tạo thành 4, 4’–bis(chloromethyl)biphenyl,
sau đó phản ứng với trimethylphosphite cho ra 4,4’-bis(dimethoxyphosphonomethyl)biphenyl.
Biphenylphosphonate đối xứng này được phản ứng với hai phân tử benzaldehyde-2-sulphonic
acid, được sản xuất từ một hợp chất là 2- chlorbenzaldehyde và natri sunfit. Thành phần sản
phẩm hoạt chất sinh ra là xấp xỉ 90 %, các tạp chất khác < 1,2 % bao gồm các sản phẩm và số
dư là natri clorua và nước[8].....................................................................................................22
1.3.2 Cơ chế làm trắng...............................................................................................................22
1.3.3 Ứng dụng của Tinopal CBS-X..........................................................................................23


6

Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trong công nghiệp
sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làm chất làm trắng trong
gia dụng để làm trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng[13], [14], [22]..........................23

1.4 Một số kết nghiên cứu và phương pháp xác định............................................23
1.4.1 Phương pháp soi bằng đèn cực tím...................................................................................25

7

2.2 Nội dung nghiên cứu.......................................................................................50
2.2.1 Phương pháp chiết tách chất phân tích.............................................................................50
2.2.2 Khảo sát chương trình gradient.........................................................................................52
2.2.3 Nghiên cứu phương pháp định tính Tinopal CBS-X bằng đèn UV 365 nm.....................53
2.2.3.1 Chuẩn bị.........................................................................................................53
2.2.3.2 Tiến hành........................................................................................................54
2.2.3.3 Giới hạn phát hiện..........................................................................................54
2.2.3.4 Độ chính xác..................................................................................................55
2.2.4 Kiểm tra phương pháp phân tích......................................................................................55
2.2.4.1 Tính đặc hiệu..................................................................................................55
2.2.4.2 Tính tuyến tính...............................................................................................56
2.2.4.3 Độ chụm và độ thu hồi của phương pháp......................................................56
2.2.4.4 Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp......................................57
2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp làm giảm nồng độ Tinopal............................58
CBS-X........................................................................................................................................58
2.2.6 Khảo sát độ nhạy, độ chính xác của phương pháp định lượng Tinopal CBS-X đo quang
phổ và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao........................................................................59
Chương 3....................................................................................................................................60
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN......................................................................60

3.1 Phương pháp chiết tách chất phân tích............................................................60
3.2 Khảo sát chương trình gradient........................................................................61
3.3 Nghiên cứu phương pháp định tính Tinopal CBS-X bằng đèn UV 365 nm.....65
3.3.1 Giới hạn phát hiện phương pháp.......................................................................................65
3.3.2 Độ lặp lại...........................................................................................................................71

3.4 Kiểm tra phương pháp phân tích.....................................................................73
3.4.1 Tính đặc hiệu....................................................................................................................73

- LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện.


9

- LOQ (Limit of Quantification): Giới hạn định lượng.
- Obs (Optical Brighteners): Chất làm trắng quang học.
- RSD (Relative Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tương đối (%).
- ACN (Acetonitrile): Acetonitril
- MeOH (Methanol): Methanol

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Chương trình theo tỷ lệ Gradient dung môi...................................................27
Bảng 1.2 : Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn......................34
Bảng 1.3: Sự khác nhau giữa độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ tái lập.....................41
Bảng 1.4: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau..................................44
Bảng 1.5 : Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau............................................47
Bảng 2.1: Bảng tỷ lệ H3PO4 cần khảo sát trong MeOH và ACN....................................52
Bảng 2.2: Chương trình gradient pha động 1.................................................................53
Bảng 2.3: Chương trình gradient pha động 2 ................................................................53
Bảng 3.1: Chương tình theo tỷ lệ gradient dung môi.....................................................65
Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bánh canh tại nồng độ
2,5 mg/kg....................................................................................................................... 71
Bảng 3.3: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bánh phở tại nồng độ 2,5
mg/kg............................................................................................................................. 72


10

Bảng 3.4: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bún tại nồng độ 2,5

Hình 1.6: Sơ đồ nguyên tắc và hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC).......................................................................................................................... 30
Hình 1.7: Cách xác định khoảng tuyến tính...................................................................36
Hình 1.8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính......................................40


12

Hình 2.1: Máy sắc ký lỏng Shimadzu, đầu dò UV-VIS đặt tại phòng kiểm nghiệm Thực
phẩm.............................................................................................................................. 49
Hình 2.2: Sơ đồ phương pháp tách chiết chất phân tích.................................................51
Hình 2.3: Sơ đồ phương pháp sàng lọc mẫu...................................................................54
Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng làm giản nồng độ Tinopal CBS-X........................59
Hình 3.1 Đồ thị biểu thị độ thu hồi chiết Tinopal CBS-X bằng MeOH .........................61
Hình 3.2: Đồ thị biểu thị độ thu hồi chiết Tinopal CBS-X bằng ACN...........................62
Hình 3.3 Dãy chuẩn Tinopal CBS-X trên hệ dung môi Đệm-Acetonnitril.....................63
Hình 3.4 Dãy chuẩn Tinopal CBS-X trên hệ dung môi Đệm- MeOH ...........................64
Hình 3.5: Đồ thị thể hiện tỷ lệ ACN: đệm theo chương trình gradient...........................65
Hình 3.6: Dãy chuẩn Tinopal CBS-X dưới đèn soi UV ở bước sóng 365 nm có nồng độ
từ 0,5 mg/l đến 5,0 mg/l.................................................................................................66
Hình 3.7: Dãy chuẩn Tinopal CBS-X dưới đèn soi UV ở bước sóng 365 nm có nồng độ
từ 0,25 mg/l đến 2,5 µg/l................................................................................................67
Hình 3.8: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 µg/l............................68
Hình 3.9: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 10,0 µg/l..........................69
Hình 3.10: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 25,0 µg/l........................70
Hình 3.11: Đường chuẩn khảo sát khoảng nồng độ 0,5 – 5,0 mg/l................................76
Hình 3.12: Đường chuẩn khảo sát khoảng nồng độ 0,5 – 5,0 mg/l ngày 2....................77
Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu thử sau khi xử lý so với mẫu chuẩn...............................83
Hình 3.14: Đồ thị so sánh kết qua đo mẫu giữa hai máy UV-VIS và quang phổ UV.....84
Hình 3.15: Sơ đồ quy trình định lượng Tinopal CBS-X.................................................85

Tinopal CBS-X là một chất làm trắng quang học có tên khoa học là 4,4- bis(2sulfostyryl) biphenyl, công thức phân tử C 28H2ONa2O6S2[16]. Tinopal CBS-X là chất làm
trắng huỳnh quang có khả năng phát huỳnh quang (fluorescence) và gây ra hiệu ứng
tán xạ trên bề mặt sản phẩm mà chúng bám vào làm cho sản phẩm có cảm giác trắng
hơn.
Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trong
công nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làm
chất làm trắng trong gia dụng để làm trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng,…
nhưng không được phép sử dụng trong thực phẩm[3].
Để kiểm soát Tinopal CBS-X trong thực phẩm, ngày 16 tháng 8 năm 2013, Cục
An toàn thực phẩm – Bộ Y Tế đã có công văn số 1731/ATTP-KN về việc áp dụng quy
trình kiểm nghiệm Tinopal CBS-X trong thực phẩm[1].
Hiện nay, đã có nhiều phương pháp phân tích hàm lượng Tinopal CBS-X trong
các đối tượng phân tích với nhiều kỹ thuật khác nhau. Phương pháp kiểm tra sàng lọc
Tinopal CBS-X bằng cách soi duới ánh sáng đèn tử ngoại UV 365 nm trong buồng
tối[18]. Với thiết bị phân tích Tinopal CBS-X là máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
để định lượng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi thiết bị mà phương pháp có độ nhạy và độ
chọn lọc khác nhau nhưng đầu dò tử ngoại- khả kiến được xem là đầu dò có độ chọn


15

lọc, độ nhạy tốt, thời gian trả kết quả nhanh và chính xác. Nghiên cứu này mở rộng
thêm phạm vi nền mẫu ở các mẫu thường cần độ trắng cảm quan như măng, củ kiệu với
độ thu hồi đạt được 81 – 108 % tin cậy. Tuy nhiên, khi áp dụng quy trình kiểm tra
Tinopal CBS-X trên đối tuợng là các loại thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột thì thấy
rất ít công trình nghiên cứu, do đó cần phải xây dựng, đánh giá và kiểm định phương
pháp thích hợp trên mỗi thiết bị khác nhau.
Để kiểm soát triệt để việc sử dụng Tinopal CBS-X trong sản xuất, kinh doanh
thực phẩm, Cục An toàn thực phẩm đã có Công văn gửi các Sở Y Tế các tỉnh thành phố
trực thuộc Trung ương về việc phối hợp truy nguyên nguồn gốc nguyên liệu, kiểm soát



17

Nhiệt độ hồ hóa phản ánh độ bền của hạt tinh bột tới sự tác động của các loại thuốc thử
khác nhau. Những sự khác biệt về nhiệt độ hồ hóa phản ánh rõ tới thời gian nấu gạo.
Nấu gạo có nhiệt độ hồ hóa cao sẽ kéo dài thời gian vài phút so với gạo có nhiệt
độ hồ hóa thấp. Gạo có nhiệt độ hồ hóa thấp khi nấu sẽ bắt đầu hút nước và trương nở
ở nhiệt độ thấp hơn so với gạo có nhiệt độ hồ hóa cao. Nhiệt độ hồ hóa cũng có thể
phản ánh độ rỗng tương đối của nội nhũ.
Tỷ lệ amylose: Amilopectin xác định các tính chất của cơm. Hàm lượng
amylose càng cao, các hạt tinh bột hút nước càng mạnh, thể tích các hạt tinh bột tăng
nhưng cấu trúc không bị phá hủy nhờ khả năng của amylose tạo thành các liên kết
nước ở mức cao. Độ chắc của cơm và độ bóng bề mặt của nó được quyết định bởi tỷ số
amylose: amilopecin trong tinh bột[6].
Cách tách tinh bột gạo: Hạt tinh bột gạo có kích thước nhỏ (3 – 8 µm) được bao
bởi một lớp vỏ protein cứng, chặt và không hoà tan trong nước, nên để tách được tinh
bột cần phải xử lý hoá học để tách protein ra khỏi tinh bột.
Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch kiềm loãng (0,25 % - 0,35 %) trong một
thời gian dài để làm mềm hạt. Tách hết kiềm, rửa bằng nước, sau đó gạo được nghiền
để phá vỡ tế bào và giải phóng các hạt tinh bột. Tiếp đó khối nghiền được khuấy đều
với một lượng dư dung dịch kiềm loãng. Phần lớn protein sẽ bị hoà tan và chuyển vào
lớp trên của dung dịch kiềm nên có thể tách ra bằng cách gạn.
Khuếch tán khối tinh bột vào nước để tạo ra dịch sữa tinh bột rồi cho qua rây có
kích thước nhất định để loại bỏ các tạp chất. Tinh bột được rửa và lắng gạn, lặp đi lặp
lại nhiều lần sẽ thu được tinh bột tinh sạch.
Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch SO 2 ở nhiệt độ và thời gian nhất định
(50oC, 72h) để làm cho khung protein bị trương lên và bị khuếch tán vào dung dịch dễ
dàng. Tiếp đó, gạo được nghiền trong cối nghiền. Khối nghiền cho qua sàng quay và
sàng rung để tách vỏ và xơ. Sau đó khuấy đều với dung dịch NaOH để tạo ra huyền

bình, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, mát gan, chỉ khát tiêu đờm, làm se, nhuận táo,
chống co thắt.


19

Bởi bản chất màu trắng của mình nhưng lại rất khó giữ được độ trắng trong quá
trình bảo quản nhất là đối với các cơ sở buôn bán trong thời gian dài, nên việc sử dụng
Tinopal CBS-X để làm trắng cho các sản phẩm củ kiệu, măng gây nên ảnh hưởng sức
khỏe của người sử dụng.
1.2 Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang.
1.2.1 Giới thiệu.
Chất làm trắng quang học (OBs) được dùng trong ngành công nghiệp hóa chất,
hoặc các chất làm trắng huỳnh quang (FWAs) được dùng trong ngành công nghiệp chất
làm trắng, là những hợp chất có thể hấp thụ ở bước sóng 350 - 365 nm của ánh sáng
UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở bước sóng 400 - 440 nm [8]. Electron
trong phân tử huỳnh quang được kích thích lên một trạng thái năng lượng cao hơn bằng
cách hấp thụ photon ánh sáng thích hợp sau đó phân tử chuyển một lượng nhỏ năng
lượng thành nhiệt huỳnh quang, phần còn lại phát xạ thành photon của bức xạ huỳnh
quang khi các electron quay trở lại trạng thái cơ bản của nó. Nhiệt huỳnh quang được
tạo ra từ trạng thái kích thích thứ nhất có thể được đo được bằng thiết bị nhưng rất
phức tạp và tốn kém. Bức xạ huỳnh quang trong trạng thái kích thích thứ hai được đo
bằng thiết bị gọi là fluorometers [13],[14],[22].
1.2.2 Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học .
Các chất làm trắng quang học có thể được phân loại dựa trên cấu trúc và thuộc
tính, vào khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc khác nhau, hàng trăm
hợp chất, và hàng ngàn công thức khác nhau. Tất cả OBs đa vòng hydrocarbon thơm,
cấu trúc có chứa nhiều liên kết đôi có thể được kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím.
Hàng ngàn công thức OBs đã được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất làm
trắng, nhưng tương đối ít đáp ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất làm

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2,2’- ([1,1’-biphenyl] - 4,4’ - diyldi - 2,1 - ethenediyl)
bis, dạng muối đinatri[8].
1.3 Tinopal CBS-X.
1.3.1 Khái niệm.
Tên thường được gọi là DSBP (Distyrylbiphenylsulfonate).
Tên hóa học: 2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’–diyldi-2,1-ethenediyl)bis, dạng muối đinatri..
Công thức phân tử: C28H20Na2O6S2
Công thức cấu tạo hóa học: xem hình 1.2
Tính chất
+ Khối lượng phân tử: 562,58 g/mol.
+ Màu sắc: màu vàng.
+ Điểm nóng chảy: > 300°C.
+ Điểm sôi: N/A.
+ Áp suất hơi ở 25 °C: < 7E-16 ở 25°C.
+ Hệ số phân số octanol - nước [log10]: - 2,32 ở pH 6,8; 25°C.
+ Độ tan trong nước [mg/l]: 17’600 ở 2°C.
+ Hằng số Henry: < 1E-15 ở 25°C.
+ Hằng số KOC: 125 L/kg.