i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
  



Thái Nguyên, Năm 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Thái Nguyên, Năm 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
i

LỜI CẢM ƠN Qua một thời gian làm việc và học tập tại Phòng thí nghiệm Bộ
mô
n
Công nghệ Sinh học – Vi sinh tôi đã hoàn thành công trình: “Nghiên
c
ứu quy trình công nghệ sản suất chế phẩmMultienzym từ nấm mốc và
đánh giá độ an toàn của chúng dùng
cho chăn nuôi”
Để hoàn thành được công trình này, tôi đã nhận được nhiều sự giúp
đ
ỡ
, chỉ bảo và đóng góp ý kiến quý báu từ các thầy cô, gia đình và các
b
ạn

Hà Nội, tháng 09 năm 2010 Tống Thị Mơ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU i
1. Lý do chọn đề tài 1
2.Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2
4. Nội dung của đề tài: 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1. Vai trò của enzyme trong chăn nuôi 4
1.1 Các enzyme tiêu hóa chủ yếu sử dụng trong chăn nuôi 4
1.1.1 a-Amylase 5
1.1.1.1. Đặc tính của enzym α-amylase 5
1.1.1.2. Cơ chế tác dộng của enzym α-amylase 7
1.1.2 Cellulase 9
1.1.2.1 Hệ enzyme phân giải cellulose 10
1.1.2.2. Endoglucanase (EC.3.2.1.4,b-Dglucan-glucanolhydrolase hay
carboxymethylcellulase viết tắt là CMCase) 10
1.1.2.3. Exoglucanase (EC.3.2.1.91. 1,4 b - glucan – celobiohydrolase 11
1.1.2.4. b-1,4 glucosidase (EC.3.2.1.21 b-1,4 glucosidase hay cellobiase): 11

2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 29
2.1.3. Hoá chất 29
2.1.4. Thiết bị 30
2.2. Phương pháp nghiên c
ứu
30
2.2.1. Phương pháp vi si
nh
30
2.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn tinh bột đến khả năng sinh
amylase trên cơ chất bã sắn của chủng A. oryzae NM1 31
2.2.1.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase 31
2.2.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ KNO
3
và KH
2
PO
4
lên khả năng sinh
amylase 32
2.2.1.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 32
2.2.1.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của amylase 32
2.2.1.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của amylase 33
2.2.1.7 Ảnh hưởng của lượng giống (bào tử/g) ban đầu đến khả năng sinh
amylase 33
2.3. Xác định ảnh hưởng của H
2
O
2
đến hoạt động của amylase 33

A. oryzae NM1 60
3.4. Đánh giá độ an toàn của chế phẩm enzyme multienzyme trên động vật 62
3.4.1.Đánh giá cấp độ độc cấp tính 62
a. Dị ứng da 62
b. Dị ứng mắt 63
c. Dị ứng đường thở 63
3.4.2 Đánh giá độc tính cấp chậm 14 ngày 64
3.4.3. Đánh giá độc tính 90 ngày 64
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
v

3.4.4. Kết quả kiểm tra mẫu máu: Kiểm tra tại Khoa huyết học của Bệnh
viện Bạch Mai Hà Nội (Bảng 3.4.4) 65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68
I. KẾT LUẬN 68
II. KIẾN NGHỊ 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69


Công thức máu
RNM Rừng ngập mặn
VSV Vi sinh vật
RBC Hồng cầu
WBC Bạch cầu
PLT Tiểu cầu
TN Thí nghiệm
MT Môi trường
MTCS Môi trường cơ sở
DANH MỤC HÌNH

Hình Tên hình Trang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
vii

Hình 1
Cấu trúc hoá học của cellulose

9
Hình 2 Cấu trúc của xylan với các chuỗi
bê
n
14
Hình 3 Sơ đồ tác động của các loại enzyme thủy phân xylan trình bày tóm tắt 15
Hình 4 Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein 16
Hình 2.4
Đồ thị tinh bột chuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang
Bảng 2.4
Kết quả thực nghiệm khi đo OD ở bước sóng 560nm
35
Bảng 3.1.1

Ảnh hưởng của nguồn tinh bột đến khả năng sinh amylase 47
Bảng 3.1.2

Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase
48
Bảng 3.1.3

Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 50

Bảng 3.4.2
Trọng lượng của các lô trước và sau thí nghiệm (14 ngày) 64
Bảng 3.4.3

Trọng lượng của các lô trước và sau thí nghiệm (90 ngày) 65
Bảng 3.4.4 Sự thay đổi của hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu dưới tác động E sau 90 ngày 66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
loại bỏ hết Ca
2+
thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-
amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan
đến hàm lượng Ca
2+
trong phân tử và nồng độ Mg
2+
. Tất cả các amylase đều
bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
. Một số kim loại như
:Li
+

phẩm amylase từ A. oryzae trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova
1991 thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0. Độ bền đối
với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của A. oryzae bền
vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bacillus subtilis.
Ở pH= 3,6 và 0
o
C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút;
α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase
của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ).
Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0-5,5; α-amylase
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose maltotriose
và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose
chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin
cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở
chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì
sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose)
còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%[28].
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông
thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử
thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao
của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại
amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Việc phát hiện ra Amylase và sản xuất ở quy mô công nghiệp đã góp
phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Amylase có
thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, động vật và VSV. Hiện
nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà

acetylxylanesterase và các endo-xylanase. Sự có mặt của một lượng nhỏ các axit
feruloyl và pcoumaroyl liên kết với các vòng α-L- arabinose trong cấu trúc của
xylan cũng đã được thông báo trong một vài nghiên cứu. Các axit
hydrocinnamic này liên kết với C
5
của vòng arabinose.
Sự có mặt của các liên kết đồng hoá trị giữa lignin và cellulose thông qua
mối liên kết với các nhóm thế của xylan trong nhiều trường hợp đã được
chứng minh. Những bằng chứng về liên kết ete giữa arabinose và lignin hay
giữa axit glucuronic với lignin cũng đã được công bố. Các nhóm feruloyl
cũng có thể hình thành liên kết ngang giữa xylan và lignin. Các chuỗi bề mặt
(nhóm thế) quyết định khả năng hoà tan, cấu trúc vật lý và khả năng phản ứng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
- α- Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thuỷ phân các đầu chứa
nhóm không khử α – L - arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan
và arabinogalactan của các nhóm bên.
- a-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thuỷ phân các liên kết α-1,2-
glycosidic giữa xylose và axit D- glucuronic, kể cả các liên kết với 4-O-
methyl của các nhóm bên.
- Các acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6) bẻ gãy liên kết giữa xylose và
axit axetic của các nhóm bên.
Sơ đồ tác động của các loại enzyme thủy phân xylan trình bày tóm tắt ở
hình3

Hình
.3

a/ Các vùng tác động của các enzyme thuỷ phân xylan (Ac - Nhóm
acetyl; α-araf -

dưỡng (ANF-anti nutrient factor) do tạo độ nhớt trong ruột, ngăn cản sự
hấp thu các chất, tạo điều kiện cho VSV có hại phát triển. Xylanase,
phytase, a-galactosidae là những enzyme chính khắc phục được nhược điểm
này. Bổ sung xylanase vào thức ăn vật nuôi có tác dụng nhiều mặt. Như
các enzyme tiêu hoá, xylanase cắt cơ chất phức tạp thành các phân tử nhỏ dễ
tiêu nên tăng giá trị hữu dụng của thức ăn. Đặc biệt xylanase làm giảm độ
nhớt của ruột do đó kéo theo những tác dụng tích cực khác. Sự hấp thụ các
chất dinh dưỡng bị ngăn cản bởi hợp chất NSP được tăng cường khi có
xylanase, ví dụ tiêu hoá của a m i n o acid tăng 1,7-7,9%. Nó giúp cải
thiện hệ VSV đường ruột theo hướng có lợi như giảm Salmonella do vậy
giảm rối loạn tiêu hoá. Đối với môi trường, xylanase làm giảm lượng phân
thải ra, chất lượng phân khô hơn, góp phần giảm ô nhiễm môi trường [8].
Bổ sung xylanase làm tăng khả năng tiêu hoá NSP tổng số ở lợn có
chế độ ăn chính là ngũ cốc bổ sung đậu tương. Bổ sung chỉ xylanase hoặc
hỗn hợp xylanase, α-galactosidase, protease làm tăng sự tiêu hoá
carbohydrate, protein và chất béo. Khi nghiên cứu ở lợn cai sữa giai đoạn
sớm cũng thấy bổ sung xylanase cùng với β-glucanase và amylase làm tăng
khả năng tiêu hoá tinh bột, protein và phân giải chất khô[7].
Phytase phân giải phytate có trong thức ăn, giải phóng P
vc
, inulin, các
muối khoáng (Mg, Ca, Fe, Cu…). Việc bổ sung phytase vào thức ăn chăn
nuôi động vật không những mang lại hiệu quả to lớn về mặt dinh dưỡng và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Đó chính là nhờ hoạt động của
phytase làm giảm mức độ kháng dinh dưỡng của axit phytic, tăng hiệu quả
hấp thu chất dinh dưỡng của vật nuôi, giảm chi phí khẩu phần ăn vì không
cần thiết bổ sung phốt pho vô cơ vào trong thức ăn, đồng thời làm giảm ô
nhiễm môi trường do giảm lượng phytate dư thừa thải qua phân mà sau đó bị

nuôi, enzyme làm tăng tỉ lệ tiêu hoá, làm giảm chi phí thức ăn. Tuy nhiên, tất
cả các chế phẩm enzyme được dùng ở nước ta hiện nay đều là enzyme nhập
ngoại do đó giá thành còn cao, vì vậy việc nghiên cứu sản xuất các enzyme
cho chăn nuôi trong nước là vấn đề cấp bách.
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu thử nghiệm về sự ảnh hưởng của
enzyme thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease,
xylanase, cellulase ) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn
của lợn con cai sữa [1]. Kết quả thử nghiệm cho thấy khi trong thức ăn có bổ
sung chế phẩm phytase và tổ hợp enzyme thì tăng trọng hơn so với đối chứng
tương ứng là 13.3% và 32% . Nếu sử dụng phối hợp cả 2 chế phẩm này thì tăng
trọng hơn so với đối chứng là 50% [Trần Quốc Việt và Cs, 2005]
M.T.Hằng và CS, 2008 đã thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm Enzyme từ
các chủng Aspergillus phân lập từ Việt nam trên gà giò cho kết quả tăng trong từ
15-27% lượng thức ăn tiêu thụ/ kg tăng khối lượng cơ thể gà giảm tương ứng
11,2-112,7% . Chế phẩm trên cũng đã được thử nghiệm trên lợn từ 8-72kg với
hiệu quả tăng trọng cao (12%) và giảm lượng thức ăn /kg tăng trọng cơ thể 9-
16% (đặc biệt là đối với lợn 8-20 kg) tăng gần tương đương với chế phẩm SSF
của Mỹ, đồng thời làm giảm đáng kể chi phí thức ăn cho vật nuôi [2]
Trần Quốc Việt và Ninh Thị Len (Viện Chăn nuôi) đã nghiên cứu sử
dụng chế phẩm phytase thương mại (Natuphos, BASF) đến năng suất và hiệu
quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt. Theo các tác giả, sử
dụng phytase giúp lợn tăng trọng 16,4% và giúp giảm chi phí thức ăn được
8% so với lô đối chứng. Tương tự như vậy, Nguyễn Thị Hoài Trâm và CS
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
Đối với α- amylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > lactozơ > sacaroszơ
> galactozơ > manozơ > arabinozơ.
Đối với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > sacaroszơ >
gluctozơ > lactozơ > arabinozơ > galactozơ > manozơ .
Nộng độ nguồn cacbon trong môi trường cũng ảnh hưởng lớn đến sự

pho mát. Vì vậy, chủng A. niger có khả năng sản xuất enzym đặc biệt này đã
được tuyển chọn.
Các sản phẩm từ A. niger đã được sử dụng từ nhiều thập kỷ trước,
nhưng không có bằng chứng rằng chủng công nghiệp được sử dụng có thể gây
độc. Các tiền enzyme không độc của A. niger đã được kiểm tra trong rất nhiều
thử nghiệm độc tính, tương tự các thử nghiệm độc tính với các sản phẩm cuối
khác. Những nghiên cứu độc tính xác định trên nhiều tiền enzyme khác nhau
từ A. niger cung cấp cơ sở cho sự đánh giá an toàn của các chuyên gia Uỷ ban
hỗn hợp trên Phụ gia thực phẩm (JECFA) của FAO / WHO (FAO / WHO,
1975, 1987 và 1990). Mặc dù các kết quả của nghiên cứu gây độc không
chính thức, JECFA lần đầu tiên phân bổ 1 số ADI tới tiền enzyme của
A.niger, dựa trên những lo sợ rằng một số chủng có thể sản xuất các độc tính
chưa rõ (FAO / WHO, 1987). Tuy nhiên, 1 thời gian dài sử dụng A. niger như
1 nguồn enzyme thực phẩm, đã có số lượng đáng kể các nghiên cứu về an
toàn, giống như các báo cáo khoa học tại JECFA cho thấy, sản phẩm có độc
rất hiếm gặp. Vì vậy, JECFA đã xem xét lại quyết định của mình vào năm
1990 và thay đổi ADI cho tách tiền enzym từ A. niger thành `` không
độc''(FAO /WHO, 1990). Ngoài một đánh giá tích cực của JECFA, hầu hết
các nước quy định việc sử dụng enzym, như Mỹ, Pháp, Đan Mạch, Úc và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
28
Canada, đã chấp nhận việc sử dụng enzym từ A. niger trong một số thực
phẩm.
Để đánh giá được độ an toàn của chế phẩm Multienzyme trước hết
chúng ta phải biết được các thành phần có trong enzyme. Sau đó chúng ta mới
thử các độc tính của enzyme với đối tượng là chuột và thỏ. Trên thế giới
người ta cũng dựa vào các tiêu chuẩn để đánh giá độ an toàn của chế phẩm
enzyme như tiêu chuẩn của FAO [45]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
35

6
8
10
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
OD(560nm)
Tinh bét(mg/ml)

Hình 2.4. Đồ thị tinh bột chuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
36
Phương trình hồi quy tuyến tính giữa tinh bột và độ hấp thụ ở 560nm
là: y=16.94x-0.2655, trong đó x là độ hấp phụ của dung dịch tinh bột ở bước
sóng (560nm), y là hàm lượng tinh bột (mg/ml).
*Cách tiến hành thí nghiệm xác định hàm lượng tinh bột bị phân
giải.
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch 1% NaCl, 1ml dung dịch 1% tinh
bột, 2ml dung dịch đệm phù hợp 0.05M Na-acetate, pH 5,5 ,3ml nước cất.
Lắc đều và giữ ở nhiệt độ 30
0
C trong 10 phút, sau đó cho vào hỗn hợp này
1ml enzyme ở độ pha loãng thích hợp đã giữ ở 30
o
C. Lắc đều, tiếp tục giữ ở
30
o
C trong 30 phút. Thêm ngay 2ml dung dịch 15% axit trichloroacetic để
làm ngừng phản ứng, giữ vài phút sau đó li tâm 4000v/phút loại bỏ cặn.
Song song với mẫu thí nghiệm ta làm mẫu đối chứng cũng tương tự
như trên nhưng cho dung dịch axit trichloacetic vào trước rồi mới cho dung
dịch enzyme.

O, 10g DNS,
khuấy đều cho các hoá chất tan hoàn toàn. Bổ sung thêm nước cất để đạt
1000ml.
+ Dựng đường chuẩn D-glucose: Pha dung dịch mẹ 10µmol/ml D-
glucose trong đệm 50 mM Na-axetat. Từ đó pha loãng thành các nồng độ
0; 2; 4; 6; 8; 10 (µmol/ml). Lấy 50 µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên +
450µl dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750µl dịch thuốc thử DNS.
Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ
540nm
. Đường
chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây
dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (Hình 2.5)

Hình 2.5 . Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng D-glucose bằng DNS
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-glucose và
giá trị OD
540nm
thu được là là y = 15,759x+0,5181.
Trong đó: y là hàm lượng D- glucose trong 1ml dịch; x là giá trị
OD
540nm
tương ứng. Hệ số tương quan R
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
38
= 0,9912 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
♦ Đặt thí nghiệm xác định hoạt tính của CMC-ase và amylase.
- Thí nghiệm: 450 µl dung dịch 1% tinh bột ngô (hoặc 0,5% CMC ) +
50 µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở điều kiện 50

:

- Dịch cơ chất 1% oat spelts xylan (OSX): Cân 1 gam OSX pha trong đệm
50mM Na-axetat, pH 5,5.
- Thuốc thử DNS: Hoà tan 2g phenol và 10g NaOH trong 300ml nước
cất, sau đó thêm tiếp 0,5g Na
2
SO
3
, 200g KNaC
4
H
4
O
6
.4H
2
O, 10g DNS,
khuấy đều cho các hoá chất tan hoàn toàn. Bổ sung thêm nước cất để đạt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên