Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VŨ LÊ LỢI

TÍNH TOÁN TẦN SUẤT HAPLOTYPE HỆ 17 Y-STR
PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH TẠI
VIỆN KHOA HỌC HÌNH SỰ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Hà Hà Nội, tháng 11-2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết
ơn sâu sắc tới:
PGS.TS Thượng tá Nguyễn Văn Hà, Phó giám đốc Trung tâm giám định
Sinh học pháp lý, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an.
là người đã quan tâm hướng dẫn tận tình và luôn tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian làm luận án.
Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo, tập thể cán bộ
Trung tâm giám định sinh học pháp lý, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an
đã giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Hà Nội, tháng 11 năm 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

KẾT LUẬN 33
KIẾN NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

- STR Short Tandem Repeat
- Y‐STR Y‐ chromosome Short Tandem Repeat
- DNA Deoxyribonucleic Acid
- PCR Polymerase Chain Reaction
- AMPS Ammonium Persulfate
- dNTPs Deoxy Nucleotide Tri Phosphates
- EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Di‐Sodium Salt
- FDL Forensic DNA Laboratory
- DC Discrimination Capacity
- HD Haplotype Diversity
- GD Gene Diversity
- bp base pairs
- PCR Polymerase Chain Reaction
- YHRD Y‐Chromosome Haplotype Reference Database
- SWGDAM Scientific Working Group on DNA Analysis Methods
- NRY Non‐recombining Y‐chromosome
- SNP Single Nucleotide Polymorphism
- mtDNA Mitochondrial DNA
- PAR Pseudo‐Autosomal Region


6
Hình 1.5: Hình ảnh pic khi phân tích Y-STR và STR trên NST thường
trong mẫu lẫn thành phần nam/nữ
Hình 1.6: Hình ảnh cây phả hệ
Hình 3.1: Hình ảnh pic 17 locus Y-STR sau điện di huỳnh quang
Hình 3.2: Đồ thị mô tả chỉ số đa dạng locus gen hệ 17 Y-STR

Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
1
MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, tại Viện Khoa học hình sự, phòng thí nghiệm ADN đã
được triển khai từ năm 1999 với trang thiết bị hiện đại và đội ngũ giám định
viên được đào tạo chuyên sâu [9]. Lĩnh vực giám định gen được triển khai với
3 mảng lớn là: Giám định ADN trên nhiễm sắc thể thường; giám định gen
trên nhiễm sắc thể giới tính và giám định ADN ti thể. Phân tích ADN trên
nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là trên nhiễm sắc thể Y đã đóng góp được
những thành tích nhất định như: bổ sung vào bảng locus gen cùng với các
locus gen trong phân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường, phân tích quan hệ
huyết thống cha con, phân tích phả hệ theo dòng bố và đặc biệt hữu ích trong
các vụ án dấu vết ít, khó phát hiện như các vụ án hiếp dâm (lẫn thành phần
thấp tế bào nam trong thành phần cao tế bào nữ hoặc nhiều đối tượng tham
gia vụ án), các vụ án dấu vết bị nhiễm, bị lẫn.
Giám định ADN trên nhiễm sắc thể Y là phân tích và so sánh các chỉ
thị di truyền là các đoạn lặp ngắn STR (Short Tandem Repeat) trên nhiễm sắc
thể Y giữa mẫu cần giám định và mẫu so sánh. Những người có giới tính nam
trong cùng một phả hệ theo dòng bố sẽ có cùng một kiểu gen đơn bội trên
nhiễm sắc thể Y (gọi là Haplotype), kiểu gen này rất ổn định ngoại trừ đột


Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
3
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về chủng tộc ngƣời Việt (Kinh)
Người Việt hay người Kinh là một dân tộc hình thành tại khu vực địa lý
mà ngày nay là miền Bắc Việt Nam và miền namTrung Quốc. Đây là dân tộc
chính, chiếm khoảng 86,2% dân số Việt Nam và được gọi chính thức là dân
tộc Kinh để phân biệt với những dân tộc thiểu số tại Việt Nam. Ngôn ngữ
chính sử dụng là tiếng Việt theo nhóm Việt-Mường. Người Kinh sinh sống
trên khắp toàn thể nước Việt Nam và một số nước khác nhưng đông nhất vẫn
là các vùng đồng bằng và thành thị trong nước. Còn nếu tính theo kiều bào ở
ngoài nước thì người Việt định cư ở Hoa Kỳ là đông nhất.
Theo Tổng điều tra dân số và nhà ở năm 2009, người Kinh ở Việt Nam
có dân số 73.594.427 người, chiếm 85,7% dân số cả nước, cư trú tại tất cả
63 tỉnh, thành phố. Các tỉnh, thành phố có số lượng người Kinh lớn nhất là:
Thành phố Hồ Chí Minh (6.699.124 người), Hà Nội (6.370.244 người), Thanh
Hóa (2.801.321 người), Nghệ An (2.489.952 người), Đồng Nai (2.311.315
người), An Giang (2.029.888 người).
Người Kinh là dân tộc đa số tại Việt Nam, tuy nhiên tại một số
tỉnh miền núi phía Bắc, người Kinh lại là dân tộc thiểu số: Lào Cai (212.528

này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu sinh học, tiến hóa và trong khoa học
hình sự.

Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc 2 nhiễm sắc thể giới tính X và Y
Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
5
1.3. Các chỉ thị di truyền trong phân tích nhiễm sắc thể Y
Từ năm 1990 đến nay các nhà Khoa học hình sự sử dụng kỹ thuật phân
tích gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat –STR hay Microsatellite)
vì chúng khá bền vững, có khả năng phân tích đồng thời nhiều gen, ít phụ
thuộc vào các thao tác kỹ thuật người giám định. Các cấu trúc VNTR hay
STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính
đặc trưng cho cá thể. Đó là nền tảng khoa học cho giám định gen. Các gen
này thường có tính đa hình cao, ít đột biến, tương đối bền vững và cho phép
đồng thời thực hiện được các phản ứng nhân gen của nhiều gen khác nhau.
STR (Short Tandem Repeat) là các trình tự ADN ngắn lặp đi lặp lại,
khoảng 2-6 base pair (bp). Trình tự đoạn lặp này có thể được khuếch đại bằng
cách sử dụng các mồi chuyên biệt. Các phòng thí nghiệm hình sự trên thế giới
thường sử dụng các đoạn lặp 4 nucleotide, đảm bảo tính đa hình và thuận lợi
cho phản ứng khuếch đại và phân tích nhiều chỉ thị di truyền cùng một lúc
[21]. Phân tích STR rất phù hợp trong các trường hợp dấu vết hình sự, bởi lẽ
các dấu vết sinh học tại hiện trường chịu nhiều tác động của điều kiện ngoại
cảnh nên ADN dễ bị đứt gẫy. Hơn nữa STR dễ thực hiện phản ứng khuếch đại
và có thể khuếch đại nhiều vị trí cùng lúc.
Kể từ cuối những năm 90, khoa học đã giải mã được bộ gen người, nên
việc sử dụng các chỉ thị di truyền Y-STR (Short Tandem Repeat) đã phổ biến
ở các phòng thí nghiệm Khoa học hình sự trên toàn thế giới. Trong những
năm 90 chỉ một số ít chỉ thị di truyền Y-STR được sử dụng. Vào đầu năm

TCTA
DYS 389 II
24-34
(TCTG) (TCTA)
DYS 458
14-20
GAAA
DYS 19
10-19
TAGA
DYS 385a/b
7-25
GAAA
DYS 393
8-16
AGAT
DYS 391
7-13
TCTA
DYS 439
8-15
AGAT
DYS 635
20-26
TSTA
DYS 392
7-18
TAT
Y GATA H4
8-13

Hình 1.3: Hình ảnh khuếch đại ở locus DYS389I/II
Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
8
1.4. Các bộ kít thƣơng mại phân tích nhiễm sắc thể Y
Các nhà khoa học hình sự chủ yếu dựa vào các bộ kít thương mại để
giám định ADN. Bộ đầu tiên được sử dụng là Y-PLEX
TM
6 của hãng ReliaGene
Technologies (NewOrleans LA), đồng khuếch đại DYS19, DYS389II,
DYS390, DYS391, DYS393 và DYS385a/b. ReliaGene Technologies bán bộ
kít Y-PLEX12, trong đó có bổ sung các locus mà SWGDAM đã nghiên cứu
cộng với chỉ thị di truyền Amelogenin. Một lợi thế lớn trong việc sử dụng kit
Y-STR thương mại là sẵn có các thang alen chung.
Các kit thương mại có được mô tả trong bảng dưới đây. Các nhóm
locus gen được thiết kế mồi gắn huỳnh quang với các màu khác nhau để phát
hiện sản phẩm điện di. B là màu xanh, G là màu xanh lá cây, Y là màu vàng,
R là màu đỏ.

Hình 1.4: Kết quả điện di của kit Y-PLEX
TM
6
Đặc điểm các locus gen được mô tả (bảng1.1). Một lợi thế của các kit
thương mại là phân tích cùng một lúc nhiều locus gen và có một thang alen
tiêu chuẩn. Các thang alen chuẩn giúp đánh giá quá trình phân tích ADN được
chính xác.
Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý

haplotype Y-STR phục vụ trong giám định gen hình sự.
Tính đến ngày 30 tháng 12 năm 2010, cơ sở dữ liệu YHRD đã xây
dựng được 91601 haplotyep và đã lấy mẫu từ 710 quần thể trên thế giới, và
đưa vào trực tuyến khi truy cập vào trang web hoặc
.
Bảng 1.3: Các cơ sở dữ liệu gen Y-STR trên thế giới

Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
11
1.6. Ý nghĩa thống kê của phân tích nhiễm sắc thể Y trong hình sự
Thực tế chỉ ra rằng, nhiễm sắc thể Y được di truyền nguyên vẹn từ cha
sang con trai (ngoại trừ đột biến). Nên việc phân tích hệ Y-STR không có ý
nghĩa trong truy nguyên hình sự. Vì một Y-STR haplotype tìm được trong
dấu vết hiện trường thì sẽ trùng với tất cả những người đàn ông có quan hệ
theo dòng bố của đối tượng, chính vì vậy phân tích này chỉ có ý nghĩa truy
nguyên nhóm. Tuy vậy điều này cũng rất ý nghĩa với cơ quan điều tra khi
phân vùng được đối tượng. Khi một kiểu gen đơn bội hệ Y-STR phân tích
được từ dấu vết hiện trường trùng với kiểu gen của đối tượng, thì ta không
loại trừ đối tượng cũng như người thân theo dòng bố với đối tượng đã tham
gia hoạt động phạm tội. Do vậy, vấn đề đặt ra là phải có một con số thống kê
có ý nghĩa với kết luận không loại trừ này. Budowle và các cộng sự đã sử
dụng phương pháp đếm để tính toán thống kê tần suất Y-STR haplotype.
Phương pháp này khá đơn giản, và có thể chấp nhận một khoảng tin cậy để
phản ánh sai số trong quá trình chọn mẫu đại diện để nghiên cứu. Đặc biệt có
nhiều haplotype hiếm sẽ không quan sát được khi nghiên cứu vài trăm cho
đến hàng nghìn cá thể.
Các locus Y-STR nằm trên phần không tái tổ hợp của nhiễm sắc thể Y.
Do đó tần suất của một haplotype sẽ có ý nghĩa thống kê hơn là tần suất của

thu được mẫu so sánh với các dấu vết tìm được. Khi ấy, để kịp tiến độ điều
tra, người ta có thể thu mẫu của các người thân có quan hệ theo dòng bố với
đối tượng để có thể khoanh vùng đối tượng.
Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
13

Hình 1.5: Hình ảnh pic khi phân tích Y-STR và STR trên NST thường
trong mẫu lẫn thành phần nam/nữ
Hoặc trong các vụ việc giám định huyết thống cha con, mà người cha
đã chết thì có thể tiến hành thu mẫu của anh, em ruột người cha đó để so sánh
với người con trai đó để có thể đưa ra kết luận giám định. Như trong hình
minh họa (1.4), với một bảng phả hệ như trên thì khi người cha đã mất thì có
thể so sánh người con với chú hoặc các anh em trai họ theo sơ đồ phả hệ đó.
Tuy nhiên phân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường sẽ cho kết luận cuối
cùng tốt hơn, vì không phải lúc nào xác minh theo phả hệ cũng luôn đúng.

Hình 1.6: Hình ảnh cây phả hệ

Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
14
Ứng dụng trong một số trƣờng hợp khác
Bảng 1.4: Các ứng dụng và thuận lợi khi phân tích Y-STR trong
hình sự

Ứng dụng
Ý nghĩa

học hình sự trên thế giới. Ban đầu nó được sử dụng phổ biến ở châu Âu hơn là
Mỹ. Tại Mỹ, cuối những năm 90 thế kỷ trước, viện nghiên cứu New York
City Office of the Chief Medical Examiner (OCME) đã sớm sử dụng. Sau đó
ReliaGene Technologies, Inc (New Orleans, LA) đã phát triển bộ kít đầu tiên
Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
15
vào năm 2000. OCME đã sử dụng phân tích Y-STR cho 4 mục đích sau: (1)
Dấu vết thử định hướng dương tính với tinh dịch nhưng không phát hiện
ADN lạ ngoài nạn nhân hoặc là ADN đối tượng thấp, dưới ngưỡng phát hiện
khi phân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường. (2) Xem xét tỉ lệ thành phần
ADN nam và nữ trong dấu vết có kết quả thử định hướng dương tính với tinh
dịch. (3) Kiểm tra trên số lượng lớn các dấu vết tinh dịch. (4) Xác định số
lượng đối tượng để lại dấu vết tinh dịch đó.
Trong một báo cáo của OCME đưa ra năm 2001, khi họ có thể phát
hiện tỉ lệ male/female là 1:4000. Năm 2002, Sibille et al đưa ra nghiên cứu
cho thấy, vẫn có thể phân tích Y-STR từ các dấu vết tinh dịch của vụ án hiếp
dâm sau khi đã xảy ra khoảng 48 giờ, với 104 mẫu dịch âm đạo thu từ các vụ
án thì họ đã phân tích được khoảng 29% các mẫu này.
Tại Viện Khoa học hình sự, phân tích ADN hệ Y-STR chưa có điều
kiện nghiên cứu sâu vì những lý do: (1) Kinh phí cho nghiên cứu là khá lớn,
(2) Các vụ việc còn khiêm tốn, khi cơ quan điều tra chủ yếu là khai thác rõ về
truy nguyên cá thể Hiện nay tại Viện, phân tích Y-STR chủ yếu phục vụ
giám định huyết thống theo dòng bố, và bổ sung vào bảng locus gen cùng với
phân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường để đưa ra kết luận rõ ràng nhất
(trong các vụ thiên tai khi phân không phân tích được đầy đủ kiểu gen trên
nhiễm sắc thể thường).
chỉnh pH 7,4 với HCl, thêm
nước tới 1 lít
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) (Sigma – Mỹ).
Proteinase K (Sigma – Mỹ).
Ethanol (Trung Quốc).
Chelex® 100 Resin (Bio-rad/Mỹ).
- b. Hóa chất dùng cho PCR
AmpFℓSTR® Yfiler® PCR Amplification Kit (P/N 4322288)
Taq polymerase 5U/µl
Nước cất khử ion và khử trùng
- c. Hóa chất dùng cho điện di
AmpFℓSTR® Yfiler® PCR Amplification Kit (P/N 4322288)
GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (P/N 4322682)
POP-4™ Polymer (P/N 4352755)
Hi-Di
TM
Formamide (P/N 4311320)
Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh)

Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý
17
2.1.3 Thiết bị máy móc và dụng cụ
Thiết bị
Máy ly tâm (Mikro 200 – Hittich/Đức)
Máy PCR 9700 (ABI – Mỹ)
Máy PCR iCycler (Biorad – Mỹ)
Lò vi sóng
Tủ hút
Buồng thao tác PCR
Block gia nhiệt