COOH
COOH
OH
O
C
CH
2
CH
2
H
2
N-CH
NH
2
COOH
HC-OH
H
2
N-CH
NH
2
COOH
COOH
CHCl
2
HC-OH
NH
2
O=C
HN CH
CH

Sinh Viên: Vũ Minh Triết 60902903
Bùi Thiên Duy 60900368
Trần Tấn Lộc 60901467
Trương Đờ Kháng 60901168
1
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
TP. HCM 12/2011
2
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Mục lục
Mục lục hình ảnh
Hình 1.1: Penicillin G
Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn
Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone
Hình 1.4 Cân bằng Acid Base của nhóm Acidic Quinolone
Hình 1.5 Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin
Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin
Hình 1.8 Công thức phân tử chung của họ chloramphenicol
Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp chloramphenicol từ acid shikimic
Hình 1.10 Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum
Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS
Hình 2.4: Máy xay sinh tố
Hình 2.5: Máy ly tâm
Hình 2.6: Bình định mức các loại
Hình 2.7: Pipet các loại
Hình 2.8: Phễu chiết cỡ 250 ml
Hình 2.9: Quy trình thực hiện
Hình 2.10: Âm tính: Hai vạch
3

nuôi, trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản,.... có tác dụng rất lớn là giúp cho vật nuôi trồng chống
lại bệnh tật từ vi sinh vật. Tuy vậy, chất kháng sinh như một con dao hai lưỡi. Một mặt giúp sinh
vật chông lại bệnh tật, mặt khác, có thể làm cho sinh vật xuất hiện phản ứng phụ, và đặc biệt là
4
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
lượng chất kháng sinh tồn dư sinh vật có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm, nhất là sức
khỏe người tiêu dùng.
Với một lượng thực phẩm khổng lồ từ động vật đang được tiêu thụ trên thị trường, song
ít ai nghĩ đến việc mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đang phải tích lũy… dần dần dư lượng chất
kích thích tăng trọng và thuốc kháng sinh trong từng miếng thịt động vật của các loại sản phẩm
này. Bởi trong chăn nuôi gia súc, gia cầm hiện nay, người dân sử dụng rất tùy tiện các loại thức
ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn.
Hậu quả là dư lượng chất kích thích và thuốc kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm vượt ngưỡng
cho phép gấp nhiều lần, tuy không gây ngộ độc cấp tính tức thời, nhưng sẽ gây nguy hại về lâu
dài cho sức khỏe của người tiêu dùng.
I Tổng quan về chất kháng sinh
1.1 Định nghĩa
1.2 Khái niệm về chất kháng sinh [1]
Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay
kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp
độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát
triển của vi khuẩn.
Từ "antibiotics" (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ "antibiosis" . "anti" có nghĩa là
"chống lại" và "biosis" có nghĩa là "cuộc sống". Chất kháng sinh tác động, chống lại một số loại
vi khuẩn. Thật vậy, chất kháng sinh là chất hoá học lấy từ cơ thể các vi sinh vật như vi khuẩn,
nấm mốc, hoặc một vài thực vật.
3.1.Tác dụng của chất kháng sinh
Thuốc kháng sinh là những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn vi
khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn
chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa

Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn
7
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Ví dụ về cơ chế của việc ức chế sự tổng hợp protein Aminoglycosides : Streptomycin
• GĐ 1: Thuốc gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S
• GĐ 2 : Phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên trong quá trình thành lập chuỗi
peptid
• GĐ 3 : Thông tin mRNA bị đọc sai à 1 acid amine không phù hợp
• GĐ 4 : Làm vỡ các polysomes thành monosomes à không có chức năng tổng hợp
protein
Tetracyclines
• Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 30S / Ribo thể à ngăn chặn các amino acid mới gắn vào
chuỗi peptid mới được thành lập
• Chloramphenicol
• Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 50S / Ribo thể à ức chế peptidyltransferase à ngăn các
amino acid mới gắn vào chuỗi peptid mới thành lập
Các khoa học gia thật sự đã không biết toàn bộ cách thức mà chất kháng sinh giết được
các vi khuẩn mầm bệnh. Một vài khoa học gia cho rằng chất kháng sinh ngăn chặn oxy không
tới được các vi khuẩn mầm bệnh nên các vi khuẩn này chết vì thiếu oxy. Một vài khoa học gia
khác cho rằng, chất kháng sinh ngăn chặn các vi khuẩn không lấy được thức ăn. Dù cho cách
thức tác động của chất kháng sinh có như thế nào đi nữa, nó vẫn là loại thuốc hữu ích cho con
người.
Kháng sinh chống lại vi khuẩn bằng cách làm hư hại thành phần cấu tạo của chúng như
lớp vỏ bảo vệ, màng trao đổi chất v.v... Tuy nhiên, trong phương diện điều trị, người ta quan tâm
đến hai loại tác dụng: tác dụng diệt khuẩn và tác dụng kìm khuẩn (kìm khuẩn có khi còn được
gọi là hãm khuẩn, trụ khuẩn, tĩnh khuẩn). Kháng sinh diệt khuẩn có tác dụng giết chết vi khuẩn,
còn kháng sinh kìm khuẩn chỉ làm cho vi khuẩn ngưng phát triển, không sinh sản chứ không bị
tiêu diệt. Kháng sinh kìm khuẩn được dùng khi cơ thể người bệnh còn sức đề kháng, hệ thống
miễn dịch còn đủ mạnh để tiêu diệt vi khuẩn đã bị thuốc làm cho yếu đi. Nếu cơ thể người bệnh
quá yếu, bắt buộc phải dùng các loại kháng sinh diệt khuẩn.

Với nhiều tác dụng có ý nghĩa thực tiễn như thế vậy phải chăng việc sử dụng càng nhiều
thuốc kháng sinh sẽ càng đem lại nhiều tác dụng tích cực?
Cơ thể người thường bị dư thuốc kháng sinh khi sử dụng không đúng thuốc hoặc do
lượng kháng sinh còn tồn dư trong thực phẩm. Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi
trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở
khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá
nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách. Lạm dụng hoặc chưa
hợp lý, dẫn đến những hậu quả khôn lường. Không những chi phí tiền thuốc tăng do sử dụng
nhiều loại kháng sinh đắt tiền mà còn làm nhiều loại kháng sinh mới dần dần bị vô hiệu hóa.
Chất kháng sinh cũng có những phản ứng phụ, tạo ra phản ứng của cơ thể đối với chất
kháng sinh chẳng hạn như chứng ban đỏ và các triệu chứng khác có thể gây ra những căn bệnh
khác. Phản ứng trầm trọng nhất là dẫn tới tử vong. Đôi khi, chất kháng sinh không có hữu hiệu
đối với một số vi khuẩn mầm bệnh.
Phó khoa Vệ sinh Trung tâm Y tế dự phòng TPHCM, khẳng định kháng sinh thuộc dạng
hóa chất nên phần lớn không phân hủy được trong môi trường nhiệt độ như nấu nướng
Theo một tài liệu của Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Đại Học Bách Khoa TP HCM,
lượng kháng sinh tồn dư trong gia súc, gia cầm cao sẽ chuyển hóa protein thành các histamins
gây chứng nhức đầu cho người sử dụng. Người thường xuyên sử dụng gia súc, gia cầm nhiễm
kháng sinh sẽ rất dễ bị “nhờn” thuốc, khi bị bệnh khó chữa trị do lượng kháng sinh này sẽ tích tụ
trong cơ thể gây nên hiện tượng vi khuẩn thích ứng với kháng sinh
Các loại kháng sinh này thường không bị phân huỷ và tồn lưu trong môi trường nuôi
trồng thuỷ sản trong thời gian dài, khiến các loại vi khuẩn thích nghi với môi trường có kháng
sinh. Kết quả là các loại vi khuẩn gây bệnh trong thuỷ sản lại có khả năng kháng thuốc kháng
sinhNếu kháng sinh được trộn lẫn vào thức ăn nuôi thuỷ sản, có thể tìm thấy dư lượng kháng
sinh trong thịt thuỷ sản và các sản phẩm chế biến. Những người ăn thuỷ sản chứa dư lượng
kháng sinh sẽ vô tình hấp thụ kháng sinh vào cơ thể, dẫn đến những thay đổi trong môi trường vi
khuẩn bình thường, khiến họ trở nên dễ bị nhiễm khuẩn hơn
9
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Đặc biệt việc lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây lờn thuốc, dẫn đên sự phát triển của các

4 Chlorpromazine
5 Colchicine
6 Dapsone
7 Dimetridazole
8 Metronidazole
9 Nitrofuran (bao gồm cả Furazolidone)
10 Ronidazole
11 Green Malachite (Xanh Malachite)
12 Ipronidazole
13 Các Nitroimidazole khác
14 Clenbuterol
15 Diethylstilbestrol (DES)
16 Glycopeptides
17 Trichlorfon (Dipterex)
18 Gentian Violet (Crystal violet)
19 Nhóm Fluoroquinolones (cấm sử dụng trong sản xuất, kinh
doanh thuỷ sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ)
Bảng 1.1: Danh mục chất kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản [11]
10
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
TT Kháng sinh cấm Chỉ tiêu kiểm tra
Giới hạn phát hiện tối thiểu
EU Mỹ Nhật
1. Chloramphenicol Chloramphenicol (CAP) 0.3 ppb 0.3 ppb 0.5 ppb
2. Malachite
green/Leucomalachite
green
Malachite green /
Leucomalachite green
(MG/LMG)

6: có thể gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N
11
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone Acid Nalidixic
Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone
b. Tính chất Acid - Base nhóm quinolone
Quinolone có một nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên đây là một hợp chất có tính
acid. Một số quinolone có chứa thêm nhóm amine khác nên có thêm tính base. Dựa vào
pKa có thể chia nhóm quinolone thành hai loại: Acidic quinolone (AQ) và Piperazinyl
Quinolone (PQ)
Acidic quinolone (AQ): chỉ có một giá trị pKa thuộc khoảng 6.0 đến 6.9. Trong
nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những Quinolone
thuộc thế hệ thứ nhất.

Hình 1.4 Cân bằng Acid Base của nhóm Acidic Quinolone
Piperazinyl quinolone (PQ): có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5.5 – 6.6 và pKa2
khoảng 7.2 – 8.9. Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation,
dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là Danofloxacin, Difloxacin, Norfloxacin,
Ofloxacin, Benofloxacin, Marbofloxacin, Pipemidic acid

Hình 1.5 Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone
12
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
c. Ciprofloxacin
Ciprofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi
khuẩn gram dương và gram âm.
• Tên gọi: 1 – cyclopropyl – 6 – fluoro – 1,4 – dihydro – 4 – oxo – 7 – 1 – piperazinyl 3 –
quinolinecarboxylic acid
• Công thức hóa học: C


• Trọng lượng phân tử: 359.4 g/mol
• Nhiệt độ nóng chảy: 219 – 221
o
C
13
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin
• Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có hai
giá trị pKa: khoảng 5 và 8 – 9
e. Nguồn gốc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin trong thực phẩm
Ciprofloxacin và Enrofloxacin được đưa vào thịt gà, cá…dưới dạng nguyên liệu
thức ăn chăn nuôi, hoặc do người chăn nuôi trộn vào thức ăn gia súc, gia cầm, hoặc cho
vào môi trường sống của các động vật thủy sản. Khi động vật ăn, hoặc sống trong môi
trường đấy hoặc tiêm để chữa bệnh thì kháng sinh sẽ xâm nhập vào cơ thể.
f. Ứng dụng và ảnh hưởng của Ciprofloxacin và Enrofloxacin
Ciprofloxacin và Enrofloxacin được dùng làm kháng sinh cho người và động vật.
Hai loại kháng sinh này được con người sử dụng khi mắc các chứng bệnh về đường hô
hấp, nhiễm trùng huyết xương khớp, viêm nhiễm cơ quan sinh dục… Nhóm
fluoroquinolone nói chung (Ciprofloxacin, Enrofloxacin nói riêng) là nhóm kháng sinh có
độc tính cao, chỉ sử dụng với liều nhất định, được quy định rất chặt chẽ và đều thuộc
nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng đối với trẻ em vì ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng.
Nhóm fluoroquinolone nếu dùng liều cao và kéo dài sẽ làm ảnh hưởng trên sụn đầu
xương và quá trình tăng trưởng của bé chậm lại, bị lùn (Theo bác sĩ Đào Thị Yến Phi-
Trung tâm đào tạo – bồi dưỡng cán bộ y tế Tp. HCM)
Trường hợp tồn dư 5ppb fluoroquinolone, nếu một người ăn trung bình 150 – 200g
thịt/ngày thì lượng fluoroquinolone đưa vào cơ thể khoảng 2µg/ngày. Với lượng này sẽ
không gây độc tính ngay, nhưng nếu tích lũy lâu dài hoặc ăn quá nhiều sẽ bị tác hại.
Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan cho vật nuôi các loại kháng sinh trong danh mục
thuốc dùng cho người hoàn toàn có khả năng dẫn tới kháng thuốc ở vi khuẩn. Như vậy sẽ

b. Tính chất
Chloramphenicol là một kháng sinh phổ biến và trước đây đã được sử dụng để điều trị
có hiệu quả nhiều bệnh Gram âm và Gram dương khác nhau. Nhưng do có một số hiệu ứng phụ
không mông muốn việc ứng dụng chloramphenicol trong điều trị có xu hướng giảm dần. Đồng
thời ,việc sử dụng và kiểm tra phát hiện sư lượng chloramphenicol trong thực phẩm trở thành
vấn đề rất nhạy cảm, được qui định chặt chẽ và tiếng hành giám sát nghiêm ngặt ở nhiều nước,
đặt biệt là nước công nghiệp phát triển.
Chloramphenicol là chất độc màu trắng hoặc có ánh vàng vàng, không mùi, vị rất đắng,
ít tan trong nước, tan nhiều trong cồn và chất béo, dung dịch chloramphenicol bền vững trong
môi trường hơi acid hay trung tính bền vững với nhiệt chịu nhiệt độ đến 100
0
C.
c. Tác hại của cloramphenicol
Khi sử dụng trong chăn nuôi, một phần kháng sinh chưa đào thải sẽ tồn dư sang sản
phẩm thực phẩm gây nguy hại đến cơ thể con người và một lượng đáng kể trong thức ăn thừa sẽ
thoát ra và lắng động vào môi trường, theo thời gian có thể dẫn tới các biến đổi về hệ sinh thái.
Gây ô nhiểm môi trường, làm cho vật nuôi và cả con người kháng lại thuốc khi sử dụng thục
phẫm có nhiễm thuốc, làm cho các vi khuẩn gây bệnh lờn thuốc, và như vậy khi cơ thể người
hay loài vật nuôi bị nhiễm loại vi khuẩn đã lờn thuốc thì sẽ không có thuốc trị
15
Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm
Chloramphenicol khi đi vào cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra “hội chứng xanh tím xám”,
đặc biệt là trẻ sinh non. Trẻ bị xanh tái dần rồi trị tim mạch và tử vong. Chloramphenicol còn
ngộ độc cho tủy xương nếu dùng kéo dài. Ngoài ra chloramphenicol còn có thể gây suy tỷ, thiếu
máu không hồi phục.
Bị nhiễm kháng sinh thuộc nhóm chloramphenicol có thể làm giảm bạch cầu, vàng da.
Chloramphenicol không chỉ tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh đường ruột mà còn diệt luôn vi
khuẩn có lợi cho ruột gây tiêu chảy dẫn đến thiếu nước nghiêm trọng và làm xuất hiện các bệnh
thiếu vitamin.
Phơi nhiễm hóa chất độc hại trong lương thực, các mặt hàng thủy sản nuôi trồng (tôm,