Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Thái Nguyên – 8/2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Mậu
đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành
công trình nghiên cứu này.
Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Tâm, TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
và các anh chị Nguyễn Thị Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào),
CN Hoàng Văn Mạnh (Viện khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên) đã giúp
đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm –
Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp
và các thầy cô giáo, cán bộ của khoa.
Tôi xin cảm ơn Bộ môn hệ thống canh tác – Viện Ngô Trung ương
đã cung cấp các giống đậu xanh làm vật liệu nghiên cứu trong luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè trong suốt
thời gian học tập và hoàn thành luận văn.
Bảng 2.1. Đặc điểm nông học và năng suất của hai giống đậu xanh nghiên cứu 17
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RADP được sử dụng trong nghiên
cứu
24
Bảng 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi sử lý bằng thổi khô (%
khối lượng tươi).
26
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần nuôi
phục hồi.
28
Bảng 3.3. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý
bằng thổi khô
30
Bảng 3.4 Mức biến động di truyền quần thể R
0
, R
1
của giống đậu xanh
VC1973A
33
Bảng 3.5. Thời gian sinh trưởng và phát dục của cây (ngày)
34
Bảng 3.6. Các dòng chọn lọc từ R
.
30
Hình 3.4. Ảnh mô sẹo khi xử lý thổi khô (Giống VC1973A)
35
Hình 3. 5. Một số hình ảnh cây tái sinh sau khi xử lý thổi khô (Giống VC1973A)
35
Hình 3.6. Một số hình ảnh quần thể R
0
, R
1
ngoài đồng ruộng
38
Hình 3.7. Một số hình ảnh các dòng cây tái sinh và Quần thể cây VC1973A đối
chứng
38
Hình 3.8. Kết quả điện di ADN tổng số tách từ 6 mẫu đậu xanh
40
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M1
44
Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M2
45
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M3
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1 Đặc điểm sinh học cây đậu xanh, tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và
Việt Nam
4
1.1.1 Đặc điểm sinh học cây đậu xanh
4
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam
6
1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật
8
1.2.1. Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật
8
1.2.1.1. Tính chịu hạn của thực vật
8
1.2.1.2. Nguyên nhân gây hạn và tác động của hạn đến thực vật
9
1.2.2. Cơ sở sinh lý, hoá sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn
23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
23
2.2.1. Hóa chất
23
2.2.2. Thiết bị
23
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
23
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
24
2.3.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
24
2.3.1.1. Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh
24
2.3.1.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo
26
2.3.1.2.1. Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô
31
3.1. THĂM DÕ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CÂY
31
3.2. ĐỘ MẤT NƢỚC VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẤT NƢỚC CỦA MÔ SẸO PHÔI
CÁC GIỐNG ĐẬU XANH
31
3.2.1. Mức độ mất nƣớc của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô
32
3.2.2. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo
33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3.2.3. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sống sót sau khi xử lý thổi khô
34
3.2.4. Nhận xét về khả năng chịu mất nƣớc bằng xử lý thổi khô của các giống đậu
xanh nghiên cứu
38
3.3. PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIẾN ĐỘNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
NÔNG HỌC QUẦN THỂ R
0
, R
1
38
3.4. ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN GENOME CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây đậu xanh (Mungbean, Green bean) có tên khoa học là
Vigna radiata (L.) Wilczek đóng vai trò quan trọng thứ ba sau cây đậu tương
và lạc (2 loại cây công nghiệp ngắn ngày). Theo Trung tâm Nghiên cứu và
Phát triển rau quả châu Á (AVRDC), trong phần ăn được của hạt đậu xanh
chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ, 64,12%
hydratcacbon (trong đó có 51,8% tinh bột), các loại vitamin A, B
1
, B
2
, C và
một số nguyên tố khoáng như K, Na, Mg, P, Fe, Ca….[9]. Vì thế hạt đậu xanh
có thể được sử dụng làm bột dinh dưỡng cho người hoặc thức ăn bổ sung cho
gia súc. Ngoài ra, hạt đậu xanh được dùng rộng rãi trong nhân dân để làm
thực phẩm như các loại bánh (bánh tét, bánh đậu xanh, bánh chưng ), chè,
xôi, cháo Đặc biệt hạt đậu xanh dùng để ủ giá được sử dụng nhiều nhất trong
nhân dân. Không chỉ được coi như nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh còn được
xem như một thứ dược liệu có tác dụng giải độc, thanh nhiệt, bớt sưng phù,
điều hòa ngũ tạng. Giá đỗ thường được dùng cho người bị viêm thanh quản
mất tiếng, vận động thể thao bị mỏi cơ, người béo phì, đái tháo đường, bệnh
tim mạch, cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, cholesterol máu cao, hiếm muộn, dễ
xảy thai. … chữa bệnh cho con người. Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây được
dùng làm thức ăn cho gia súc. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng chống xói
mòn và cải tạo đất. Chất lượng protein trong hạt đậu xanh được đánh giá dựa
trên chỉ tiêu quan trọng là thành phần axit amin trong protein, cũng như các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khảo sát môi trường tạo mô sẹo, môi trường tái sinh cây từ phôi
đậu xanh.
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu ở
mức độ mô sẹo.
- Chọn dòng biến dị soma ở giai đoạn mô sẹo thông qua các ngưỡng
xử lí thổi khô.
- Sử dụng kỹ thuật RAPD với các mồi ngẫu nhiên để khuếch đại các
phân đoạn ADN của các dòng chọn lọc và giống gốc.
- Xác định hệ số sai khác và khoảng cách di truyền của các dòng chọn
lọc so với giống gốc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU XANH, TÌNH HÌNH SẢN
XUẤT ĐẬU XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu xanh
Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) thuộc ngành
Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ đậu (Fabaceae), chi
Vigna. Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ đậu, bao gồm 7 chi
phụ: Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotropic, Lasionspron,
Sigmoidotrotopis. Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loài thuộc
tím hoặc màu vàng nhạt. Hoa đậu xanh thường nở rải rác nên người ta chia
hoa đậu xanh thành 3 nhóm chính:
- Nhóm ra hoa không tập trung: hoa nở liên tiếp trên 30 ngày
- Nhóm ra hoa tập trung: hoa nở kéo dài trong khoảng 16 ngày trở lại.
- Nhóm ra hoa trung gian: hoa nở trong khoảng từ 16- 30 ngày
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8
– 10 cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh
quả. Quả chín có màu vàng, nâu hoặc đen. Cũng như các bộ phận khác trên
cây đậu xanh (thân, cành, cuống, lá) trên vỏ quả đậu xanh thường bao phủ
một lớp lông dài khoảng 0,3 – 0,4 mm. Mỗi cây có từ 8-35 quả, mỗi quả có từ
8- 15 hạt [9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, hình trụ hơi
cạnh, ovan, tròn, thoi Màu vỏ hạt có thể là xanh lục, xanh mỡ (xanh sáng),
xanh tối (nâu), vàng rơm Ruột hạt có màu trắng, vàng hay xanh nhạt khối
lượng 1000 hạt có thể dao động từ 25 – 70g.
Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và rễ con, rễ chính sâu
khoảng 20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm. Đặc biệt do rễ đậu xanh có
khả năng sống cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ
nhánh rễ, nhất là sát rễ chính hình thành nhiều nốt sần (30- 40 nốt sần/ 1 cây).
Các nốt sần có khả năng cố định Nitơ, trung bình mỗi vụ 1 ha đậu xanh có thể
để lại cho đất khoảng 58- 107 kg nitơ [9]. Hạn chế của bộ rễ cây đậu xanh là
dễ bị thối khi gặp úng.
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam
Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả Châu Á (AVRDC) đã có
tập đoàn giống đậu xanh lớn nhất thế giới với hơn 5000 mẫu giống, trong đó
có giống cho năng suất 18-25 tạ/ha và thâm canh có thể đạt gần 40 tạ/ha.
Theo kết quả điều tra của AVRDC, hàng năm trên thế giới có trên 20
Năm 2000, thị trường xuất khẩu đậu xanh lớn nhất của Trung Quốc có thể kể
đến là Nhật Bản (40000 tấn/ 88000 tấn), sau đó là Mỹ (8144 tấn), Việt Nam
(7645 tấn), Hàn Quốc (7199 tấn), Đài Loan (4466 tấn), Anh (2479 tấn),
Canada (2495 tấn), Pháp (1289 tấn)…Từ năm 1986 đến năm 2000, giá trị
xuất khẩu đậu xanh hàng năm ở Trung Quốc tăng 5,8% tổng giá trị xuất khẩu
nông nghiệp. Trong đó, năm 1995 giá trị xuất khẩu đậu xanh đạt ở mức 104
triệu USD (72% tổng giá trị xuất khẩu nông nghiệp) và năm 1999 đạt ở mức
rất cao tới 109 triệu USD (93% ) [9].
Ở Srilanka, tình hình sản xuất đậu xanh từ 1997 đến 2001 có xu hướng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
giảm: về diện tích trồng từ 16636 ha (1997) xuống 10976 (2001), sản lượng
từ 15000 tấn (1997) xuống 10072 tấn (2001) và tăng nhập khẩu từ 2091 tấn
(1997) lên 8916 tấn (2001). Mặc dù diện tích gieo trồng và sản lượng đậu xanh
hàng năm ở Srilanka khá lớn song vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ lớn
trong nước. Do đó, lượng đậu xanh nhập khẩu có xu thế tăng nhanh từ năm
2000, 2001. Các giống đậu xanh được gieo trồng phổ biến như Harsha năng suất
trung bình 1200 kg/ha, MI – 5 năng suất trung bình 1500kg / ha, Ari năng suất
trung bình 1700 kg/ha.
Ở Việt Nam, cây đậu xanh được trồng ở nhiều địa phương trong cả
nước, tùy thuộc vào đặc điểm địa hình, điều kiện khí hậu có thể phân chia
các vùng trồng cây đậu xanh như sau:
- Vùng núi phía Bắc bao gồm các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình,
Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Tuyên Quang và Quảng Ninh. Thời vụ
gieo trồng từ tháng 4, 5 thu hoạch tháng 7, 8 là thời điểm có khí hậu nómg ẩm
thuận lợi cho sinh trưởng của cây. Tập quán canh tác đơn giản, ít thâm canh,
năng suất thấp.
- Vùng Đồng bằng, Trung du Bắc bộ bao gồm các tỉnh Hà Tây, Vĩnh
Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải
SOMA BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đang là một kĩ thuật được ứng dụng rộng
rãi trong các nghiên cứu và chọn tạo giống cây trồng theo hướng tăng cường
khả năng chống chịu. Cho đến nay đã có rất nhiều công trình khoa học được
công bố về kết quả nghiên cứu khả năng chịu mặn, chịu nóng, chịu hạn, chịu
muối, chịu nhôm ở các đối tượng cây trồng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
1.2.1. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào
soma
Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được ứng dụng
rộng rãi trong lĩnh vực chọn dòng tế bào, đặc biệt là chọn dòng chống chịu
stress môi trường như chịu hạn, chịu lạnh, chịu muối NaCl, chịu nhôm [1].
Mundy và cs (1988) đã tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa và đã nhận thấy
ABA là chất tăng khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa [33].
Bằng việc bổ sung PEG8000 vào môi trường nuôi cấy mô sẹo giống lúa Khao
Dawk Mali 105, Adkins và cs (1995) đã chọn được dòng lúa chịu hạn có
những tính trạng nông học quan trọng và khả năng chịu hạn được duy trì và
ổn định ở thế hệ R
2
[21]. Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo lúa, Đinh Thị
Phòng và cs (1998, 2001) đã chọn tạo được 3 giống lúa DR1, DR2, DR3 cho
năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc
[14].
Lê Trần Bình và cs (1998) đã chọn được hai dòng có khả năng chịu
muối là C0 và C8. Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù từ mô sẹo
lúa trong môi trường có bổ sung AlCl
3
ở nồng độ từ 0 – 600ppm có pH tương
ĐC3, CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm bầu, CR203, NN8, OM 861-20, OM296
và Tép lai, đã thu được các dòng mô sẹo của giống Pokaly và Cườm có khả
năng chịu được AlCl
3
ở 600ppm và pH là 2,71. Mô sẹo của giống Tép lai,
CR203 chịu được AlCl
3
ở 400ppm và pH là 2,98 [20].
Chu Hoàng Mậu và đồng tác giả (2006) tiến hành xử lý bằng thổi khô
mô sẹo các giống lạc MĐ7, L
17
, L
14
, L
18
, ĐBG đã nhận thấy mô sẹo của 5
giống lạc đều bị mất nước nhanh, khả năng chịu mất nước của các giống có sự
khác nhau rõ rệt, cao nhất là ĐBG và thấp nhất là L18 [12] .
Nguyễn Thu Giang (2008), tiến hành xử lý thổi khô mô sẹo của 6
giống lạc L
24
, L
23
, L
08
, L
TB
, L
CB
, L
từ tế bào nuôi cấy huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata) được thực
hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [28] và bằng phương pháp này đã thu tần
số tái sinh cây cao (Prem và cs, 2001) [39]… Đối với cây đậu tương sự tái
sinh cây tạo đa chồi từ mắt lá mầm đã được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương
là đối tượng thực vật rất khó thực hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo
mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây [6]. Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27
giống thuộc loài Vigna có nguồn gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan,
India, Australia, China, Japan Renato và cs (1999, 2001) đã cho thấy kỹ thuật
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
tái sinh cây từ mắt lá mầm của hạt nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh
80% - 100% và tái sinh chồi trực tiếp từ mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen
của loài đậu Vigna châu Á (subgenus Ceratotropis) [34]. Các kết quả nghiên
cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển
gen cũng đã được công bố bởi Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998)
[26], Ignacimuthu và Franklin (1999) [25], Renato và cs (1999, 2001) [34],
Mai Trường và cs (2001) [19], Sita và cs (2006) [36], Kaviraj và cs (2006)
[27]. Sonia và cs (2007) [37] nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein ức chế
enzyme α-amylase vào cây đậu xanh nhờ vi khuẩn Agrobacterium được thực
hiện nhờ tái sinh đa chồi từ mắt lá mầm. Đánh giá hiệu quả chuyển gen ở cây
Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy mô từ mắt lá mầm của
Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định hiệu quả
của phương pháp này [32].
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA)
TRONG PHÂN TÍCH HỆ GEN CỦA CÂY TRỒNG
Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân
đoạn ADN được nhân bản nhờ các mồi ngẫu nhiên có kích thước 10bp, do hai
nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) [43] và Welsh và McClelland
(1991) [42] đồng thời xây dựng. Thành phần và các bước phản ứng RAPD
(dNTP): ATP, TTP, CTP, GTP; Ion Mg
2+
.
Phản ứng RAPD được tiến hành qua 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn biến
tính ADN: ở nhiệt độ 95
0
C trong khoảng 30-60 giây làm cho hai mạch khuôn
ADN tách nhau. (2) Giai đoạn tiếp hợp mồi: khi nhiệt độ hạ xuống 32-40
0
C
mồi tiếp hợp và bám vào sợi ADN khuôn. (3) Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ
được nâng lên 72
0
C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được
kéo dài với sự tham gia của Taq polymerase.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân đoạn ADN khuôn
được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại
được coi là ADN khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo. Vậy sau k chu kỳ
nhân bản sẽ tạo ra 2
k
các đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu. RAPD
có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
Kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực và
đem lại nhiều thành tựu to lớn cho ngành sinh học phân tử. Người ta đã dùng
kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền phân tử [22], [30], [38], [41], nhận
dạng các giống cây trồng, phát hiện quan hệ phát sinh chủng loại đối với
nhiều loại cây trồng, đánh giá sự thay đổi genome của các dòng chọn lọc,
có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các
giống dao động từ 0,41- 0,80 [16], [17]. Tuy vậy, ứng dụng kĩ thuật RAPD
nhằm xác định quan hệ họ hàng, tìm chỉ thị ADN đặc trưng của các giống đậu
xanh có năng suất cao, khả năng chịu hạn tốt còn chưa được nghiên cứu nhiều. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Hai giống đậu xanh VN93-1, VC1973A do bộ môn hệ thống canh tác
của Viện nghiên cứu ngô cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu.
Bảng 2.1. Đặc điểm nông học và năng suất của hai giống đậu xanh nghiên cứu
STT
Tên
giống
Nguồn gốc
Màu sắc
hạt
Hình
dạng
hạt
Khả
năng
chịu hạn
Năng suất
(kg/ha)
Copyright: Tài liệu đại học ©