GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
Đề tài: Tìm và phân loại các ncRNA
có trong vi khuẩn Bacillus Subtilis.
SVTH: Trang 1
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
Lý do chọn đề tài
Từ những năm 60, khái niệm ncRNA (non coding RNA) đã lần đầu tiên được biết
đến. Trong những năm năm gần đây, với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học,
việc nghiên cứu ncRNA đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Hơn thế nữa, sự ra đời của
tin sinh học đã trở thành công cụ đắc lực để hỗ trợ. Tuy nhiên, lĩnh vực này còn khá mới
mẻ, cần được đầu tư nghiên cứu. Do đó tôi chọn đề tài:” Tìm và phân loại các ncRNA có
trong vi khuẩn Bacillus Subtilis”.
SVTH: Trang 2
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
Mục lục
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NON-CODING RNA CÓ
TRONG VI KHUẨN
1.1 . Khái niệm về non-coding RNA có trong vi khuẩn:
1.1.1. Khái niệm:
Non-coding RNA (ncRNA) là phân tử RNA chức năng, mà nó không mã hóa protein.
Nó còn được gọi là RNA không mã hóa protein ( non-protein-coding RNA, npcRNA),
non-messenger RNA(nmRNA), RNA chức năng (fucntional- RNA, fRNA). Giới hạn
small RNA(sRNAs) thường được sử dụng cho ncRNA ngắn của vi khuẩn. Trình tự DNA
mà từ đó một ncRNA được phiên mã thường được gọi là một gen RNA.
- Non-coding RNA bao gồm những RNA có tính phổ biến cao và rất quan trọng, như
là RNA thông tin (tRNA), RNA ribosome (rRNA), cũng như snoRNA, miRNA, siRNA,
piRNA và long ncRNA, bao gồm ví dụ như là gen Xist( X- inactive specific transcript)-
gen X bất hoạt phiên mã đặc biệt và Hotair. Số ncRNA mã hóa trong hệ gen của người là
chưa được biết rõ. Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây trong lĩnh vực transcriptomic và
tin sinh học đã cho thấy sự tồn tại của hàng ngàn ncRNA. Kể từ khi nhiều ncRNA mới
được phát hiện tuy nhiên vẫn chưa được kiểm chứng về chức năng, và cũng có thể không
trong tế bào.
+ Ribosome bao gồm hơn 60% là rRNA. Trong sinh vật nhân sơ chúng được tạo
thành từ 3 ncRNA còn trong sinh vật nhân thực là 4 ncRNA. Các rRNA đóng vai
trò là chất xúc tác cho quá trình dịch mã.
+ Một tập hợp khác của ncRNA, tRNA từ các phân tử trung gian giữa mRNA và
protein. snoRNA hộp H/ACA và hộp C/D là các ncRNA được tìm thấy ở trong vi
khuẩn cổ và sinh vật nhân thực.
SVTH: Trang 4
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
+ Enzyme Rnase MPN(là enzyme hoạt hóa ribonucleoprotein với 2 vai trò khác
nhau ở sinh vật nhân thực) bị hạn chế trong sinh vật nhân thực. Cả 2 nhóm của
ncRNA đều liên quan đến sự phát triển của rRNA.
+ Ở vi khuẩn, RNA-vận chuyển-thông tin (transfer-messenger-RNA,tmRNA) là
một RNP có liên quan đến giải cứu ribosome bị trì trệ (rescuing stalled
ribosomes)
ncRNA trong việc cắt intron và nối exon (RNA splicing): hầu như chỉ xảy ra ở sinh
vật nhân thực.
ncRNA trong việc điều hòa gen: Sự biểu hiện của hàng ngàn gen được điều hòa bởi
ncRNAs. Sự điều hòa này có thể xảy ra ở trong (cis) hoặc ở ngoài (trans):
+ Tác động ngoại sinh (trans-acting):
• Ở sinh vật nhân thực: mức độ điều hòa biểu hiện gen cao hơn. Một microRNA
có thể làm giảm mức độ biểu hiện của hàng trăm gen. Cơ chế mà các phân tử
miRNA trưởng thành hoạt động là thông qua một phần bổ sung cho một hoặc
nhiều phân tử mRNA. Chức năng chính của miRNA là giảm điều hòa biểu
hiện gen. ncRNA Rnase P cũng đã được chứng minh là ảnh hưởng đến sự biểu
hiện gen.
• Trong cơ thể người, Rnase P là cần thiết cho sự sao chép bình thường và hiệu
quả ncRNAs khác nhau bởi RNA polymeraseIII. Chúng bao gồm gen tRNA,
rRNA 5S , RNA SRP , và U6 snRNA.
• ncRNAs ở vi khuẩn, RNA 6S liên kết đặc biệt với RNA polymerase
khuẩn cổ. Sự lặp đi lặp lại được ngăn cách bởi các miếng đệm (spacers) có chiều dài
tương tự. Nó đã được chứng minh rằng những miếng đệm này có thể được bắt nguồn từ
thể thực khuẩn và sau đó giúp bảo vệ các tế bào khỏi bị nhiễm trùng.
1.2 . Một số loại non-coding RNA điển hình và chức năng sinh học:
1.2.1. Long non-coding RNA (long ncRNA):
1.2.1.1. Khái niệm:
SVTH: Trang 6
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
Long non-coding RNA là nhóm rộng lớn bao gồm các RNA không mã hóa protein có
kích thước lớn hơn 200nucleotide.
Chức năng của long non-coding RNA như là phân tử scaffold điều hòa sửa đổi
histone và ảnh hưởng đến các chương trình ngoại di truyền (epigenetic) trong sản phẩm
của quá trình phiên mã (transcriptome). Biểu hiện rối loạn điều hòa (dysregulated) của
long non-coding RNA đã cho thấy là có liên quan đến một loạt các khuyết tật (defect)
trong sự phát triển và các bệnh (diseases).
Nghiên cứu các mô hình biểu hiện của long non-coding RNA sẽ là một phương pháp
rất quan trọng trong sự hiểu biết những vai trò của chúng trong nhiều nhiều hệ thống mô
hình. (Epigenetic được hiểu là những thay đổi có tính hợp tác và có thể di truyền được về
mặt kiểu hình do các quá trình không liên quan đến thay đổi trình tự DNA.)
1.2.1.2. Chức năng:
Chưa có thông tin cụ thể (trong vi khuẩn).
Sự điều hòa sao mã trên S. cerevisiae, vi khuẩn và thực vật cũng được thực hiện bởi
lnc RNA antisense. Như thế, nấm men, vi khuẩn, thực vật và con người cùng chung một
cơ chế điều khiển sao mã bởi các lncRNA không phụ thuộc siRNA.
Ngày nay, nhiều chức năng của long non-coding RNA đã được tìm thấy như là truyền
tín hiệu(signaling), phục vụ như mồi nhử phân tử (molecullar decoys), hoặc dẫn hướng
(guiding) phức hợp ribonucleoproein đến vùng nhiễm sắc đặc biệt và cũng tham gia như
là scaffolds trong việc tái tạo (formation) phức hợp.
Truyền tín hiệu: sự phiên mã của một vài lnRNA nhất định rất nhanh và trong một
khoảng thời gian cụ thể. Sự biểu hiện của chúng có thể có trong phản ứng với các kích
trong tế bào để nghiên cứu vai trò của protein trong việc đáp ứng phá hủy DNA và điều
khiển chu kỳ tế bào, sự chuyển hóa chu kỳ tế bào cơ bản, tín hiệu và sự sắp xếp của
chúng trong suốt quá trình phân bào, vận chuyển qua màng, sao mã và sự methyl hóa
DNA. Những phân tử này có thể dùng để phân biệt gen chủ với những gen khác. Trong
các tế bào của cơ thể người, sự kích hoạt gen được thấy đầu tiên là các siRNA kích hoạt
các promoter của E-cadhehin, yếu tố tăng trưởng mạch nội mô (VEFG) và p21 làm tăng
mức độ mRNA và protein của các gen này.Trong cơ thể, con đường siRNA đóng vai trò
quan trọng trong việc hạn chế lây nhiễm virus vì nó làm bất ổn các RNA được tạo ra
trong chu kỳ sống.
Ở vi khuẩn: Chưa rõ
SVTH: Trang 8
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
1.2.2.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của siRNA:
siRNA có một cấu trúc được xác định rõ ràng, bao gồm một RNA mạch kép ngắn
(có khoảng 19-21 nucleotic) với đầu 5’-P và 3’-OH và có 2 nucleotide nhô ra.
Hình Cấu trúc siRNA
Cơ chế: Chưa có cơ chế cụ thể ở vi khuẩn.
1.2.2.3. Chức năng:
siRNA có nhiều chức năng như:
- Chức năng vận chuyển thông tin di truyền.
- Chức năng tham gia tổng hợp và vận chuyển Protein.
- Chức năng hoàn thiện các phân tử RNA.
- Ngoài ra RNA còn có các chức năng quan trọng khác.
- Một chức năng mới được phát hiện đó là khả năng điều hoà biểu hiện gen của RNA.
1.2.3. Small ncRNA:
1.2.3.1 . Khái niệm:
Small RNA là dạng phân tử RNA nhỏ (chứa từ 50-250 nucleotide) không mã hóa.
Chúng có cấu trúc bậc cao và chứa một vài thân vòng. Việc xác định các sRNA có thể
dựa trên hai phương pháp phân tích trên máy tính lẫn kết quả thực nghiệm. sRNA có thể
gắn với protein đích hoặc chỉnh sửa chức năng của protein liên kết, hoặc gắn với mRNA
+ Sự điều hòa Protein ngoài màng: Màng ngoài của vi khuẩn gram âm hoạt động
như một rào cản để ngăn chặn sự xâm nhập của các độc tố vào tế bào vi khuẩn, và
đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại của tế bào vi khuẩn trong môi trường
đa dạng. các protein màng bên ngoài (OMPs) bao gồm Porins và adhesins. Nhiều
SVTH: Trang 10
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
sRNAs điều hoà biểu hiện của OMPs. OmpC Porins và OmpF là chịu trách nhiệm
cho việc vận chuyển các chất chuyển hóa và các chất độc. Các biểu hiện của
OmpC và OmpF được điều hòa bởi MicC sRNAs và MicF để đáp ứng với điều
kiện căng thẳng. Protein màng ngoài OmpA neo màng ngoài lớp murein của
không gian periplasmic. Biểu hiện của nó là điều hòa ức chế(downregulated)
trong giai đoạn tĩnh của các tế bào tăng trưởng. Trong E. coli Srna mica làm cạn
kiệt OmpA, Srna Vibrio cholerae VrrA kìm hãm tổng hợp của OmpA trong phản
ứng với stress.
Điều hòa các gen độc lực(Virulence): Ở Salmonella InvR RNA kìm hãm tổng hợp
protein OmpD lớn bên ngoài màng, và Srna SgrS điều hòa sự biểu hiện của protein phản
ứng tiết SopD. Ở Staphylococcus aureus, RNAIII điều chỉnh một số gen tham gia vào
việc sản xuất độc tố và enzyme và các protein bề mặt tế bào. Các sRNAs FasX và Pel ở
Streptococcus pyogenes được mã hóa trong các locus liên quan đến độc tính. Pel RNA
kích hoạt tổng hợp các protein bề mặt liên kết và tiết protein.
Dò tìm mật độ tới hạn (Quorum sensing):
+ Quorum Sensing là cơ chế vi khuẩn điều khiển gene liên quan đến mật độ quần
thể bằng cách tạo ra (Producing), phóng thích (Releasing) và dò tìm (Detecting)
các phân tử tín hiệu; là tiến trình các tế bào vi khuẩn thông tin liên lạc với nhau
bằng các phân tử tín hiệu. Nhờ Quorum Sensing, vi khuẩn có thể kích hoạt sự
hoạt động của các gen mã hóa các tiến trình như: tạo màng sinh học, tạo bào tử,
phát sáng, sản xuất kháng sinh, tiết ra các độc tố v.v…
+ Ở các loài vi khuẩn Vibrio, sRNAs Qrr và protein chaperone Hfq có liên quan đến
các quy định của quorum sensing. sRNAs Qrr điều chỉnh sự biểu hiện của mRNA
quorum sensing tổng thể điều chỉnh(master regulators) LuxR và HapR.
&url=http%3A%2F%2Fwww.cs.washington.edu%2Feducation%2Fcourses
%2Fcse586%2F10au
%2Fsmall_RNA_review.pdf&ei=xVeRUKCUDY2TiAeLkIHACQ&usg=A
FQjCNEUp6xQDzxzlZ_rcKcmcP0ghGZ3mw
11. http://www.google.com.vn/url?
sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=18&ved=0CFkQFjAHOAo&url
SVTH: Trang 13
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
=http%3A%2F%2Fgenesdev.cshlp.org%2Fcontent
%2F21%2F23%2F3123.full.pdf&ei=jVmRUPy3GqeviQeZxoCwDQ&usg=
AFQjCNEYuA0PKBlBlluMMpIflOBP5JdOIQ
12.http://vbs.ac.vn/print.php?post=64
13.http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm
14.http://en.wikipedia.org/wiki/6S_/_SsrS_RNA
15.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2422843/
16.http://en.wikipedia.org/wiki/Category:Non-coding_RNA
17.http://www.biocat.com/cgibin/page/sub1.pl?
main_group=genomics&sub1=long_non-coding_rna_%28lncrna%29
CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI, CHỨC NĂNG SINH HỌC
CỦA CÁC ncRNA CÓ TRONG VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS
SVTH: Trang 14
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus Subtilis:
2.1.1. Lịch sử phát triển:
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 -1957, khi Henrry và các cộng sự tách
được ch subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
di động (+), hiếu khí (+).
Dung huyết: một số dòng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do tác
động của hemolysine.
SVTH: Trang 16
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
Bảng 2.1. Kết quả các phản ứng sinh hóa của B.Subtilis.
2.1.6. Vai trò của vi khuẩn B.Subtilis
B.Subtilis I đã được chứng minh là có tuân theo các kĩ thuật di truyền, và nó đã trở
nên được chấp nhận rộng rãi như một sinh vật mô hình cho các nghiên cứu ở phòng thí
nghiệm, đặc biệt là hình thành bào tử - là một ví dụ đơn giản về sự khác biệt của tế bào.
Nó cũng có rất nhiều roi, cái mà giúp cho B.Subtilis di chuyển nhanh được trong chất
lỏng. B.Suubtilis được biết đến như một “mô hình” (model) trong phòng thí nghiệm. Nó
thường được sử dụng thường xuyên như vi khuẩn Gram dương Escherichia coli, một loại
vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu rộng rãi.
Các chủng của B.Subtilis được phân lập từ thiên nhiên hoang dại (wild-type) thường
khó khăn để làm việc so với các chủng phòng thí nghiệm đã trải qua quá trình đột biến và
chọn lựa. Những chủng này thường đã được cải thiện khả năng chuyển đổi ( hấp thu
SVTH: Trang 17
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
(uptake) và tích hợp (integration) DNA của môi trường), tăng trưởng, và mất khả năng
cần thiết trong tự nhiên (loss of abilities needed in the wild).
Như một sinh vật mô hình, B.Subtilis thường được sử dụng trong các nghiên cứu
phòng thí nghiệm hướng vào phát hiện các tính chất cơ bản và đặc điểm của vi khuẩn
Gram dương hình thành bào tử. Trong đó, các nguyên tắc và cơ chế cơ bản hình thành
endospore bền (durable endospore) đã được suy luận từ các nghiên cứu hình thành bào tử
trong B.Subtilis.
Tính ổn định cao của B.Subtilis trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường làm cho
nó trở thành một trong những đại diện hoàn hảo cho các ứng dụng chế phẩm sinh học,
trong thực phẩm, đồ uống, khử trùng:
+ B.Subtilis có khả năng sinh nhiều enzyme, trong đó, quan trọng nhất là amylase
sinh các ribosome bị
kẹt lại tại đầu 3’ do
các mRNA bị lỗi
Western blot,
2D-page
RNA tế bào
chất
scr
Giúp đỡ trong việc
nhận và ràng buộc
một ribosome vào
lưới nội chất để sản
xuất protein bài tiết
Chưa rõ
RNA điều
hòa
FsrA, RatA,
sr1
Điều hòa các phản
ứng.
Northern blot, tin
sinh học, 2D-
page, RT-PCR,
overexpression,
western
blot,EMSA.
ncRNA chưa
biết chức
năng
bsrC, bsrD,
SVTH: Trang 20
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
nét chấm đứt là hai ORFs tương đương với một phần của gen AspS và yrvM. Trình tự của
promoter có thể (-35 và -10) ở phía trước của RNA BS190 được đi kèm theo hộp.
Các phương pháp phát hiện: Northern blot, dự đoán bằng máy tính.
Chức năng: chưa rõ.
2.2.1.2.bsrB:
Các nhà khoa học đã phân lập và mô tả đặc điểm một RNA mới của Bacillus Subtilis.
Họ đó là phân tử RNA BS203, tên gọi này xuất phát từ chiều dài của nó ở thể trưởng
thành là 203nucleotide. Nó nằm tại vùng intergenic yocl-yocJ trên hệ gen Bacillus
Subtilis. Bằng phương pháp Northern blot đã cho thấy rằng nó được phiên mã trong nuôi
cấy tế bào sinh dưỡng (vegetative growing cell) và số lượng BS203 giảm ở giữa giai đoạn
sinh dưỡng. Việc dự đoán cấu trúc thứ cấp của RNA BS203 dưới sự hỗ trợ của máy tính
đã cho thấy đặc điểm của ba cấu trúc stem-loop. Mặc dù biểu hiện hoạt động trong suốt
giai đoạn sinh dưỡng, sự tăng lên của đột biến bất hoạt gen (knockout mutant) không bị
ảnh hưởng bởi sự suy giảm của RNA BS203.
SVTH: Trang 21
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
Hình 2.3: Bản đồ gen BsrB và dự đoán cấu trúc thứ cấp của RNA BS203.
(A) Sơ đồ đại diện các tổ chức của khu vực quanh gen RNA BS203. Hộp màu đen đậm là
gen mã hóa cho RNA BS203, BsrB.
(B) Trình tự promoter của BsrB. Nơi bắt đầu phiên mã được gạch chân.
(C) Cấu trúc bậc hai dự đoán của RNA BS203.
SVTH: Trang 22
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
- Chức năng: chưa rõ.
2.2.2. tmRNA (ssrA):
ssrA là một dạng lai độc đáo giữa tRNA và mRNA và nó được biểu hiện ở tất cả các
loài vi khuẩn. Trong mọi tế bào, protein được tổng hợp nhờ bởi các ribosome theo một cơ
chế giải mã chính xác các thông tin di truuyền. Bình thường quá trình giải mã này sẽ
và nhân tố EF-Tu sẽ được gắn vào nhằm ngăn chặn quá trình deaminoayl hóa.
Tuy nhiên, trước đó tmRNA đã được gắn với SmpB nhân tố này cần thiết cho sự
gắn của tmRNA vào ribosome. Sau đó tmRNA tiếp tục được gắn với protein S1,
một nhân tố khác khác cũng góp phần hỗ trợ sự gắn của tmRNA với ribosome.
+ Alanin-tmRNA sau khi hình thành sẽ chuyển đến gắn vào vị trí A của ribosome bị
trì hoãn và chuỗi polypeptide đang được tổng hợp dang dở sẽ nhận thêm acid
amin alanin. Phân tử mRNA hỏng sẽ được giải phóng và có lẽ sẽ được phân hủy
nhờ Rnase R. Phần tRNA sẽ chuyển sang vị trí P và vùng đọc mở ngắn của nó sẽ
thay thế cho phân tử mRNA mới được giải phóng. Hiện tượng này gọi là trans-
translation (sự chuyển dịch mã). Và quá trình dịch mã sẽ được kết thúc bình
SVTH: Trang 24
GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1
thường do trong khung đọc mở ngắn có codon kết thúc. Như thế, các ribosome bị
trì hoãn có thể được giải thoát và các polypeptide mới sinh ra sẽ được gắn vào
một đuôi giống nhau, mà những cái đuôi này sẽ là tín hiệu nhận diện các
polypeptide này nhanh chóng bị phân hủy bởi các proteasome (vì chúng là các
polypeptide lỗi)
Hình 2.5: Quá trình trans-translation.
a) Sự gắn kết Alanin vào tmRNA bởi sự xúc tác của enzyme alanine tRNA synthase
(AlaRS)
(b,c) Phức hệ EF-Tu, PrsA, SAF, Rnase (cofactor) và các phức hệ tmRNA-ala gắn vào
vị trí P của ribosome bị trì hoãn.
(d) tmRNA thay thế đoạn mẫu cho dịch mã (trans-translation)
SVTH: Trang 25
Copyright: Tài liệu đại học ©