ĐẠI HỌC THÁI
NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ
PHẠM
BẾ BÍCH
ĐÀO
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ
SO SÁNH GEN DREB5 CỦA MỘT SỐ
GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN -
2011
ĐẠI HỌC THÁI
NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ
PHẠM
BẾ BÍCH
ĐÀO
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ
SO SÁNH GEN DREB5 CỦA MỘT SỐ
GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG
Chuyên ngành: DI TRUYỀN
HỌC
Mã số:
60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HOÀNG
MẬU
THÁI NGUYÊN -
2011
MỞ ĐẦU

[11]. Trước thực trạng đó, công tác chọn, tạo và nhân giống các giống đậu
tương có kiểu gen chống chịu ngày càng được quan tâm, trong đó tính chịu
hạn được đặc biệt quan tâm trong điều kiện biến đổi khí hậu hiện nay.
Các protein DREB là nhân tố tham gia vào quá trình phiên mã của
nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương. Protein DREB là
nhân tố kích thích các gen cùng hoạt động và không phụ thuộc vào ABA.
Hiện nay đã có những nghiên cứu trong các đối tượng như: lúa, khoai tây,
cúc, lạc…, còn ở đậu tương nghiên cứu về DREB mới chỉ là bước đầu. Ở đậu
tương và thấy rằng phân họ DREB gồm GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc,
GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7.
Mặc dù DREB không trực tiếp tham gia vào quá trình chống chịu hạn nhưng
nó là nhân tố kích hoạt đồng thời sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính
chịu hạn. Như vậy, có thể nói nghiên cứu DREB là cơ sở để cải thiện tính chịu
hạn của cây đậu tương thông qua việc chuyển gen.
Với mục đích xác định chỉ thị phân tử liên quan đến tính chịu hạn của
cây đậu tương trên cơ sở phân lập, so sánh gen DREB5 chúng tôi đã tiến hành
đề tài: “Đánh giá khả năng chịu hạn và so sánh gen DREB5 của một số
giống đậu tương địa phương”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được mức độ chịu hạn và sự sai khác về trình tự gen DREB5
của một số giống đậu tương địa phương.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích hình thái kích thước hạt, khối lượng 1000 hạt và xác định
hàm lượng protein, lipid trong hạt của một số giống đậu tương địa phương;
- Đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương
trong điều kiện gây hạn nhân tạo.
- Khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 của một số
giống đậu tương địa phương.
- So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid của protein DREB5
giữa các giống đậu tương khác nhau về khả năng chịu hạn.

lớp vỏ mỏng bao quanh phôi và 2 lá mầm. Hạt có hình tròn, ovan, tròn dài,
tròn dẹt, vỏ hạt đậu tương có màu nâu, đen, vàng, xanh.
Căn cứ vào thời gian sinh trưởng của cây đậu tương người ta
ch
ia làm
3 loại: giống chín sớm (75-85) ngày, giống chín trung bình (80-100) ngày,
giống chín muộn (110-120) ngày. Thời gian sinh trưởng là một yếu tố quan
trọng để lựa chọn cây trồng luân canh tăng vụ [13].
1.1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tương
Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, là loại cây trồng có tác
dụng nhiều mặt và hiệu quả kinh tế cao. Về thực phẩm, hạt đậu tương có
thành phần dinh dưỡng cao [2]. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt
nhất trong các protein của thực vật, có đầy đủ và cân
đ
ối các loại amino
acid cần thiết. Protein của đậu tương lại dễ tiêu hóa và không có các
t
hành
phần tạo cholesterol. Lipid của đậu tương chứa tỷ lệ lớn các axit béo chưa
no, có hệ thống đồng hóa lớn (98%), chỉ số iot cao
(121
- 137) có tác dụng
phòng chống bệnh bướu cổ cho người, đặc biệt đối với vùng trung du và
miền núi. Hạt đậu tương còn chứa nhiều loại muối khoáng và có khả năng
cung cấp năng lượng khá lớn (4.710 kcal/ kg), cho nên người ta đã chế biến
hạt đậu tương thành hơn 600 sản phẩm khác nhau.
M
ặt khác, sử dụng
protein và lipid đậu tương còn có tác dụng phòng chống bệnh đái tháo
đường, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não,… Ngày nay người ta mới biết

t
ƣ
ơng
trên thế giới những năm gần đây
Năm
Diện tích
(triệu ha)
Sản lƣợng
(triệu tấn)
Năng
suất
(tạ/h
2003
83,6
6
227,8
9
27,2
4
2004
91,6
0
224,3
7
24,4
9
2005
92,5
1
231,6

các châu lục. Đậu tương là nguồn cung cấp dầu và protein quan trọng, trên thế
giới, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là: Mỹ, Brazil, Achentina và
Trung Quốc.
Bảng 1.2. Tình hình sản xuất đậu
t
ƣ
ơng
của các
n
ƣ
ớc
đứng đầu thế giới
Quốc gia
Năm
2008
Năm
2009
Diện
tích
(triệu
Sản
l
ƣ
ợng
(triệu
Năng
suất
(tạ/h
Diện
tích

Tên
nƣ
ớc
Sản
lƣợng
(triệu tấn)
Mỹ
90,0
8
Braxin
65,0
0
Achentina
50,0
0
Trung Quốc
14,6
0
Ấn Độ
8,8
0
Paragoay
6,5
0
Các nước khác
11,3
0
(Theo Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA)
1.1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam
Việt Nam có lịch sử trồng đậu tương lâu đời, một số tài liệu cho rằng

165,
6
219,
7
13
,2
6
2004
183,
8
245,
9
13
,3
7
2005
204,
1
292,
7
14
,3
4
2006
185,
6
258,
1
13
,9

của đậu tương.
1.1.2. Thành phần hóa sinh hạt đậu tƣơng
1.1.2.1. Protein dự trữ và thành phần amino acid trong hạt đậu tương
Hàm lượng protein trong hạt chiếm từ 12% - 55%, thực tế cho thấy tuy
kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhưng
chúng vẫn cao hơn hàm lượng protein của các loài thực vật khác. Protein
được dự trữ trong một loại bào quan và có chức năng duy nhất là cung cấp
nguồn amino acid và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt, protein dự trữ chủ
yếu ở hạt đậu tương là albumin và globulin. Dựa vào hệ số lắng (11s, 7s, 2s)
người ta chia protein của hạt đậu tương thành 3 loại: legumin (11s), vicilin
(7s), albumin (2s) và chất ức chế enzyme có bản chất protein. Trong hạt đậu
tương protein dự trữ chiếm 70% tổng số protein, ngoài ra là các enzyme, các
chất ức chế protease và lectin. Thành phần của protein gồm có albumin (9,5%),
globulin tan trong nước (75,8%), globumin tan trong NaCl là 3%, glutelin-
protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [11].
Protein của hạt cây họ đậu nói chung và của cây đậu tương nói riêng
được coi là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật, chúng
chưa tât ca cac amino acid cơ ban : isoleucine, leucine, lysine, methyonine,
phenylalanine, tryptophan, valine cân thiêt cho cơ thê . Ngoài
ra
, đâu tương
đươc coi la môt nguôn cung câp cân thiêt cho cơ thê . Một điều đáng quan tâm
là hàm lượng lysine ở đậu tương rất cao so với protein của các loại ngũ cốc
khác. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy hàm lượng các amino acid chứa nguồn
gốc SH như methyonine, cystein còn thấp. [2], [12]
1.1.2.2. Lipid, vitamin và một số chất khác
Lipid là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hòa
tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như
ete, benzen, toluen, ete dầu hỏa… Lipid còn là thành phần quan trọng của
màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể. Hạt đậu tương rất

(2) Hạn do tác động của môi trường chịu sự tác động của bên ngoai rất
lớn gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể dẫn đến hủy hoại cây cối và
mất mùa, hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu
nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước
vào tế bào. Những yếu tố bất lợi này chính là các thành phần như thổ
nhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết và khí hậu. Có hai loại hạn do môi
trường tác động là hạn đất và hạn không khí [1], [13]. Hạn đất thường xảy ra
ở những vùng có khí hậu hay thổ nhưỡng đặc thù, hạn tác động mạnh lên bộ
rễ của cây. Sự tác động này được biểu hiện qua sự điều tiết các hoocmon
giúp cho cây chống chịu được điều kiện cực đoan. Hạn nhiệt độ không khí
thường xảy ra ở những vùng gió, nóng, nhiệt độ cao. Hạn không khí thường
tác động chủ yếu lên các bộ phận bên trên mặt đất như lá, hoa. Hạn do tác
động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất nước trong cây ở các bộ phận
mô, tế bào khác nhau.
Hạn tác động lên cây trồng theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây
và gây mất nước trong cây. Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, vừa là
sản phẩm khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng của các quá trình
chuyển hóa hóa sinh học. Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây
trồng là mục tiêu quan tâm. Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì càng ảnh
hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ
sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ là biến đổi hệ keo
nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt
nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và
chết. Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, hạn ảnh hưởng tới hai
quá trình sinh trưởng phát triển của cây đó là giai đoạn cây non và giai đoạn
ra hoa [1], [11]. Như vậy, ảnh hưởng cực đoan của nóng, của hạn bất cứ ở giai
đoạn sinh trưởng nào của cây trồng cũng ảnh hưởng đến các yếu tố cấu thành
năng suất làm giảm năng suất của cây trồng.
Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu

nghiên cứu về vai trò của bộ rễ trong việc nâng cao khả năng chịu hạn của
đậu tương. Lee và đtg (2003) đã nghiên cứu biểu hiện của gen Expansin
(EXP1) từ mRNA của cây đậu tương có kích thước 1089 bp [23]. Năm 2011
Lee và đtg đã nghiên cứu biểu hiện của gen liên quan đến việc kéo dài rễ của
cây đậu tương, gen liên quan đến việc kéo dài rễ là expansin (EXP). Expansin
là một họ protein xúc tác lâu dài trong việc mở rộng của thành tế bào và được
coi là một protein chủ yếu ảnh hưởng đến sự mở rộng của tế bào thực vật.
Mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất cao trong thời gian nảy mầm từ 1 đến
5 ngày, giai đoạn kéo dài rễ diễn ra nhanh. Biểu hiện của GmEXP1 làm tăng
sự phát triển rễ của hạt cây thuốc lá chuyển gen và ít bị tác động từ bên ngoài.
Các kết quả này cho thấy gen GmEXP1 đóng một vai trò quan trọng trong
việc phát triển rễ của cây đậu tương, đặc biệt là trong quá trình kéo dài của rễ
chính và rễ thứ cấp [24].
Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương
Các gen chức năng
Các gen chức năng có liên qua n đên kha năng chiu han bao gôm : HSP,
chaperons, LEA, LTP, P5CS…
HSP (Heat Shock Protein) và môi giới phân tử (chaperons): HSP co
măt hâu hêt ơ cac loai thưc vât như : lúa
mì
, lúa
mạch
, ngô, đâu, hành, tỏi
chiêm khoang 1% protein tông sô trong la va co hâu hêt ơ cac loai thưc vât .
Sư xuât hiên cua HSP co chưc năng ngăn can hoăc sưa chưa sư pha huy do
stress nong va mơ rông gia tri ngương nhiêt đô vơi sư chông chiu nhiêt đô
cao. Trong
ca
c tê bao thưc vât HSP tê bao chât tâp trung thanh cac hat sôc
nhiêt (HSG - Heat Skock

chính của các MGPT là : (1) Giư ôn đinh chuôi polypeptid khi đang tông hơp
và tạo cấu tr úc không gian đúng cho chúng ; (2) Tạo lại cấu trúc không gian
của protein sau khi vận chuyển qua màng tế bào ; (3) Lăp rap cac ch uôi
polypeptide vào phức để tạo cấu trúc bậc 4; (4) MGPT đươc tăng cương nhơ
quá trình tổng hợp trong điều kiện cực đoan do nhu cầu cấp thiết của tế b ào,
nhât la sôc nhiêt [20].
Nghiên cứu của Trần Thị Phương Liên (1999) đã phân lập, xác định
trình tự gen Chaperonin tế bào chất CCTδ từ giống đậu tương đột biến M103
với kích thước 1602 bp mã hóa cho 533 amino acid. Trình tự gen này có sự
thay đổi amino acid ở vị trí 99 (ser- Thr), 280 (ser- Gly), và 380 (ser- Ala), sự
thay đổi này tuân theo quy luật tăng khả năng chịu nhiệt. Tác giả khẳng định
sự thay đổi này là căn cứ lý giải khả năng chịu nóng của giống đột biến M103.
Trần Thị Phương Liên và đtg (2003), đã phân lập được gen chaperonin
CCTδ từ giống đậu tương Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotide mã hóa
cho
533 amino acid. Hoàng Thị Thu Yến và đtg (2004) khi nghiên cứu đánh giá
trình tự nucleotide của dòng đậu tương đột biến ML61 đến việc tạo cấu trúc
không gian của chaperonin đã xem xét đến 3 vùng chức năng quan trọng của
chaperonin. Vùng hoạt tính ATPase và vùng gắn với ATP, đây là hai vùng bảo
thủ của gen.
LEA (Late embryogenesis abundant protein - protein tich luy vơi
sô
lƣợng
lớn để hình thành phôi)
LEA là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn
cuối của quá trình hình thành phôi, nó là một trong những nhóm protein quan
trọng liên quan đến điều kiện mất nước của tế bào. Protein LEA giàu amino
acid ưa nước không chứa cystein và triptophan, có vùng xoắn α và có khả
năng chịu nhiệt [32]; chúng thay thế vị trí nước trong tế bào và thực hiện chức
năng khác nhau như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein

Proline là một trong những loại amino acid được quan tâm do ở nhiều
loài thực vật khac nhau hàm lượng Proline tăng lên rất cao khi các loại cây
này gặp các điều kiện bất lợi như hạn, mặn, lạnh, nóng, thiếu dinh dưỡng và
bị chiếu tia tử ngoại (Siripornadulsi và đtg, 2002). Mức độ tích lũy proline ở
các loài thực vật khác nhau là khác nhau và có thể cao hơn 100 lần so với cây
sống trong điều kiện bình thường. Chính vì vậy sự tích lũy proline được tin là
có vai trò rất quan trọng trong các cơ chế chống chịu với các điều kiện bất lợi
của các loại cây trồng. Proline được cho là phản ứng như một loại chất trao
đổi thích ứng và là chất để cây dự trữ carbon và nitơ (N) (Hare và Cress,
1997). Ở cây Arabidopsis quá trình sinh tổng hợp proline xảy ra ở tế bào chất
và được điều khiển bởi gen mã hóa enzym P5CS (Szekely và đtg, 2008).
Proline được xem là một chất thẩm thấu có tác dụng bảo vệ các cấu trúc
nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về ASTT.
Proline có vai trò như là một chất định hình phân tử trong việc bảo vệ các cấu
trúc protein và nâng cao hoạt tính của enzym M4 lactate dehydrogenase khi
có các tác động bất lợi về nhiệt độ xảy ra; bảo vệ enzyme nitrate redutase khi