Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro
---------- o 0 o ----------
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một
lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Bao gồm:
+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)
+ Nuôi cấy tế bào đơn
+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi
đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần
Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm
nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
(in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống
nghiệm (in vivo).
Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có
thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các
phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này
không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là
hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung
cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa,
khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp.
*Cơ sở khoa học
biểu diễn theo sơ đồ sau:
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một
thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và
một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã
hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế
bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất
định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các
gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào.
*Các ứng dụng
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to
lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử
dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế
bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô
nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có
được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối
2
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất
cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Ứng dụng:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo
giống.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại
cây trống khác nhau.
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng
để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được
3
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút,
NaOCl hoặc Ca(OCl)
2
5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H
2
O
2
, dung dịch Br…
Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)
Chất hữu cơ: đường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin
(GA3)
Bước 3: nhân nhanh
Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số
lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con
đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung
chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là
phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao
nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27
0
Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau:
* Ưu điểm
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây
giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong
khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải
sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị
nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch
virus
- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của
cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo
ý muốn
- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian
ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 3
6
-10
12
/năm, như vậy
không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh
của thời vụ.
5
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong
thời gian dài ở điều kiện in vitro
* Nhược điểm
- Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra cí kích thước nhỏ và đôi
khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn
Phổ tác động của virus là rất lớn. Nó không những tác động đến con người, động
thực vật, thậm chí cả những loài vi sinh vật khác. Trong nông học, chúng ta quan
tâm chủ yếu đến thực vật vì đây là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp.
Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến,
trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là
một loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các
mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.),
qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.).
Tác hại của virus là vô cùng lớn. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩm
chất của nông sản.
Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus
truyền bệnh
7
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
* Cơ sở lý luận của phương pháp:
Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống. Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950),
Morel & Martin (1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá bao
thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới.
Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây
đã nhiễm bệnh.
Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy
phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus
phụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể
sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây
(trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm).
Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở
khẳng định mô phân sinh đỉnh không có virus. Theo các ông có thể do các lý do sau:
- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong mô
sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao.
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh
đỉnh có kích thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh. Các chất kháng virus như 2-thiouracil,
ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản
của virus.
- Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh
trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với
cây thân gỗ, đặc biệt họ cam chanh.
Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus:
Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất
khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính. Vì vậy cần tạo ra
các giống khoai tây sạch bệnh virus. Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhân
giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến. Để nhân giống in vitro khoai tây cần
thực hiện các bước sau đây:
+ Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn. Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiều
cao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập. Thông thường nuôi
cấy 8-10 cây trong bình 250ml.
+ Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn. Môi trường tạo củ
gồm MS và 12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml.
+ Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ
20-22
0
C.
+ Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in
vitrro. Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus.
9
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
sạch bệnh thì việc nhân nhanh và duy trì nguồn giống sạch bệnh là vô cùng quan
trọng. Chính vì vậy, ở giai đoạn này việc chuẩn đoán bệnh virus tái nhiễm là không
việc không thể thiếu, để từ đó phát hiện ra các cá thể nhiễm bệnh và loại ra khỏi
nguồn giống. Có một số phương pháp chuẩn đoán bệnh virus như sau:
- Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt (thông qua triệu chứng bệnh): Đây là phương
pháp đơn giản nhất cho phép có thể xác định bệnh virus thông qua biểu hiện của cây
trồng. Phương pháp này đòi hỏi phải có kinh nghiệm quan sát và so sánh do có thể
nhầm lẫn với một số loại bệnh không phải virus gây ra. Phương pháp này cũng
không thể cho phép xác định chính xác loại bệnh virus đang nhiễm.
11
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
- Phương pháp chuẩn đoán bằng cây chỉ thị: Vào những năm 1940, phương pháp
này được coi là phương pháp nhạy và chính xác nhất để xác định bệnh virus. Nhờ
phương pháp này đã xác định được 2 virus phổ biến là X và A (Leviel 1986).
Phương pháp này dựa trên những biểu hiện đặc trưng của cây chỉ thị khi nhiễm
bệnh. Người ta đã tìm ra khoảng 200 cây chỉ thị chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae),
họ rau dền (Amaranthaceae), họ rau muối (Chenopodaceae), họ đậu (Fabaceae), họ
cúc (Asteraceae), trong đó họ cà chiếm ưu thế. Tuy nhiên phương pháp này vẫn bộc
lộ một số nhược điểm như:
+ Thời gian chuẩn đoán kéo dài do phải qua một quá trình ủ bệnh mới xuất hiện
triệu chứng.
+ Việc xuất hiện các triệu chứng đặc trưng còn phụ thuộc vào điều kiện thí
nghiệm như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, v.v.
+ Phương pháp lây nhiễm cho cây chỉ thị khá phức tạp, có loại phải truyền qua
côn trùng truyền bệnh (các vecto truyền bệnh) rất phức tạp.
+ Tốn khá nhiều công để trồng trọt, chăm sóc cây chỉ thị, nuôi dưỡng côn trùng
truyền bệnh. Cần có nhà nuôi cấy cách ly. Kinh phí đầu tư lớn.
+ Việc chuẩn đoán bệnh cuốn lá bằng phương pháp này khó tiến hành.
+ Phương pháp này chỉ sử dụng khi số lượng cá thể ít.
emzym xúc tác. Phản ứng màu thường là sử dụng các phản ứng phân giải 4-
nitrophenolphosphat bởi photphataza. Khi tách phosphat, α-nitrophenol sẽ có màu
vàng. Mỗi enzym có thể xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu màu
được khuếch đại rất rõ. Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thử
plastic, nên có tên gọi là immunosorbent. Như vậy, trên bản thử lỗ nào có màu vàng,
nơi ấy có mặt phức kháng nguyên – kháng thể - enzym, tức là có virus. Cho đến nay
có thể nói test ELISA là công cụ chính trong việc chuẩn đoán bệnh virus. Bằng
phương pháp ELISA có thể chuẩn đoán chính xác cả mặt định tính và định lượng.
- Chuẩn đoán bằng kỹ thuật phân tích ADN:
Phương pháp này cho kết quả nhanh và chính xác. Phương pháp thông dụng gọi là
phương pháp PCR.
Nguyên lý chung của phương pháp là xác định trực tiếp sự có mặt của phần lõi axit
nucleic của virus. Phần lõi này có trình tự rất đặc hiệu tùy theo mỗi loại virus. Từ đó
mà có thể là phát hiện trực tiếp qua bảng phản ứng PCR. Sử dụng các cặp mồi là các
đoạn nucleotid (dài từ 10-30 nu) có trình tự bổ sung với hai đầu (phía 3’) của hai sợi
đoạn ADN cần nhân. Sau thời gian cho phản ứng trên máy PCR khoảng 3 giờ có thể
lấy mẫu và đánh giá kết quả. Nếu mẫu sạch virus tức là không có khuôn ADN của
virus thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình nhân ADN không xảy ra. Còn ở mẫu
bệnh, sự nhân ADN diễn ra mạnh mẽ (sau 30 chu kỳ có thể nhân hàng trăn triệu
đoạn ADN). Có thể nhận biết ADN qua phương pháp điện di. Từ đây cso thể kết
luận mẫu có nhiễm bệnh hay không. Tuy nhiên, một số virus có cấu tạo phần axit
nucleic là ARN, trong trường hợp này cần phải chuyển ARN virus sang dạng ADN
(cADN) sau đó phát hiện ADN này bằng phương pháp PCR.
Phương pháp này được coi là vũ khí vô cùng lợi hại của con người. Phương pháp
này có thể phát hiện virus ở nồng độ rất thấp với độ chính xác rất cao. Chính vì vậy,
phương pháp này đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất các giống
sạch bệnh virrus hiện nay.13
Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau:
- Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối. Đây là một hướng có thể
coi là thủ công và rất mất thời gian. Thường phải mất đến 5-7 thế hệ mới tạo được
dạng đồng hợp tử. Đây cũng là một phương pháp khó thực hiện và tốn kém.
- Tạo cây đơn bội bằng in vitro. Đây là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện
dụng và nhanh chóng của phương pháp này. Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội.
Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển
thành cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kích
thích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội. Đặc biệt với
cây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giống
cây trồng.
14
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
* Khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây
trồng:
Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau:
- Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen.
- Tạo đột biến ở mức đơn bội.
- Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng.
Sơ đồ các hướng ứng dụng cây đơn bội:
Dòng thuần ổn định (F
1
, F
2
)
Chọn giống ưu thế lai
dòng đồng hợp tử tuyệt đối
chua.
+ Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn:
Bước 1: Chọn bao phấn. Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định
trong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm
lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.
Bước 2: Xử lý nụ hoa. Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và
trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây
đơn bội. Chế độ xử lý lạnh phụ thuộc vào loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 10
0
C
trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 7
0
C trong 1 tuần; thuốc lá xử ý ở 2-3 ngày.
Bước 3: Chọn môi trường thích hợp. Môi trường nuôi cấy thích hợp là điều vô
cùng quan trọng. Với mỗi loại cây trồng khác nhau thì lại có môi trường thích hợp
khác nhau. Chẳng hạn, với họ hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt 2,4 D ở nồng độ
cao để khởi động sự phân chia đầu tiên (lúc mì 10
-5
mol 2,4 D trong 12 ngày); Cây
họ cà cần ít hơn, khoảng 10
-6
mol. Về hàm lượng đường cũng khác nhau, ở ngô là 60-
120g saccarose/l, lúa 50-60 g saccarose/l, cây họ cà 20-40g saccarose/l, v.v. Ngoài ra
một số hỗn hợp tự nhiên như dịch chiết khoai tây, nước dừa tỏ ra có tác dụng tốt
trong nuôi cấy bao phấn. Còn các nguyên tố đa lượng và vi lượng ít ảnh hưởng
trong nuôi cấy bao phấn.
Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội. Không phải tất cả các cây tái sinh khi nuôi cấy bao
phấn đều là cây đơn bội, vì vậy để xác định cây đơn bội có thể sử dụng một số
phương pháp như đếm số lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của tế bào, trồng
cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng.
trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn
phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, …
17
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn
giản và thu được nhiều thành công hơn cả.
18
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc
n«ng nghiÖp
Chuyên đề 6. Kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast)
---------- o 0 ----------
a. Khái niệm tế bào trần
Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần
nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt
bên trong và bên ngoài tế bào trần.
b. Phương pháp tách tế bào trần
* Nguyên tắc:
- Sử dụng hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza để phân giải
thành tế bào và giải phóng các tế bào trần.
- Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải được
phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào
không bào, gây vỡ tế bào chất bằng việc bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu như
saccarose, manitol, sorbitol, Ca
2+
…
- Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợp
với từng loại cây trồng.
Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g lá
tươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần.
Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước 50÷80μm,
rồi rửa bằng dung dịchkhông có enzym bằng ly tâm.
c. Quá trình tái sinh của tế bào trần và các yếu tố ảnh hưởng
* Quá trình tái sinh:
- Nuôi cấy protoplast: thường chia 2 giai đoạn
20
Copyright: Tài liệu đại học ©