Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro
---------- o 0 o ----------
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một
lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Bao gồm:
+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ
tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)
+ Nuôi cấy tế bào đơn
+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi
đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần
Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm
nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
(in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống
nghiệm (in vivo).
Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn
có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà
các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp
này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây
là hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung
cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa,
khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp.
*Cơ sở khoa học
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô

Phản phân hoá tế bào
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một
thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và
một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được
mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các
tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện
nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả
các gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào.
*Các ứng dụng
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to
lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc
sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các
tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn.
Mô nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không
có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các
đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân
rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Ứng dụng:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo
giống.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các
loại cây trống khác nhau.
+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt
+ Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây
rau, cây hoa các loại cây trồng khác.
+ Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus
+ Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong
điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn.

5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H
2
O
2
, dung dịch
Br…
Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)
Chất hữu cơ: đường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin
(GA3)
Bước 3: nhân nhanh
Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số
lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các
con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung
chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là
phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả
cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27
0
C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ
ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân
hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế
độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân
phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn
nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi

cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng…
theo ý muốn
- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời
gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 3
6
-10
12
/năm, như vậy
không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao
hơn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh
của thời vụ.
- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong
thời gian dài ở điều kiện in vitro
* Nhược điểm