Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
21
+ Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào và phân chia
tạo thành cụm nhỏ tế bào (4÷10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánh
sáng yếu, trong môi trường lỏng có lắc hoặc bán lỏng. Môi trương cần giàu dinh
dưỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp. Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ
dưỡng.
+ Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sạo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi
cấy trong điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trường đặc.
Cần chú ý tới tỷ lệ và hàm lượng Auxin và xytokinin để tái được cây từ callus.
- Có hai con đường phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnh
đối với các tế bào có nguồn gốc protoplast:
+ Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), ví dụ tế bào
protoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá.
+ Thông qua con đường phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis), ví dụ
các tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù
một số loài cây thuộc họ hoà thảo.
Nếu đảm bảo được môi trường nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽ
hình thành sau khoảng 3÷5 tuần. Nhưng nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, các
biến đổi di truyền có thể xảy ra. Ví dụ, trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast
từ cây khoai tây, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, con lai là cây 4n.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
22
ng t
á
i sinh

Protoplast

TÕ b
µ
o

M« / khèi m«
Ph¸t sinh chåi / rÔ

H×nh thµnh cÊu tróc ph«i
C
©
y ho
µ
n ch
Ø
nh

Organogenesi
Embryogenes
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
23 * Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần
- Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu một số thay đổi so với quy trình nuôi cấy

loài cây trồng khác nhau.
+ Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG (polyethylenglycol) có tác dụng làm tăng
hiệu quả dung hợp của protoplast. Khi được ngâm vào dung dịch PEG (20÷40%
w/v), các protoplast kết dính lại với nhau. Sau đó, PEG được rửa bằng dung dịch
Ca
2+
có độ pH cao, màng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra và các protoplast
sẽ dung hợp với nhau. Do PEG độc với tế bào, nồng độ PEG thường được giảm đi
và bổ sung thêm vào đó DMSO (dimethyl sulfuside).
- Dung hợp bằng xung điện: đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần vào một điện
trường, các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi giữa hai bản cực. Khi có một
xung điện cao (750÷1000V) trong một thời gian rất ngắn (1÷200 mili giây) vùng tiếp
xúc giữa hai màng tế bào sẽ bị vỡ, hai tế bào trần hoà nhập vào nhau - qua trình
dung hợp sẽ xảy ra.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
24d. Ứng dụng của protoplast
* Dung hợp protoplast
- Khi các tế bào trần dung hợp với nhau và tạo thành một tế bào lai mang trong
mình vật chất di truyền tất cả các bố mẹ. Các tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào
soma nên gọi là lai soma.
- Chọn lọc các thể lai soma
+ Do lai ngẫu nhiên nên có thể
A+B→AB
A+A→AA
B+B→BB
+ Các cách chọn lọc thể lai vô tính
• Phương pháp tế bào học
Tế bào giống, loài A

Tế bào giống ,loài B

Tế bào lai soma mang đặc của cả hai giống, loài A và B
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
26
Câu 7. Trình bày kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro
o 0 o
a. Mục đích của bảo quản nguồn gen in vitro
Mục đích cơ bản của việc bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú đa
dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung để làm cơ sở
cho việc khai thác và sử dụng chúng một cách hợp lý cho hiện tại và trong tương lai.
b. Các phương pháp bảo quản nguồn gen truyền thống
Có 2 phương thức bảo quản nguồn gen cây trồng
- Bảo quản Insitu là bảo quản tại chỗ, cây được duy trì tại điều kiện sinh thái tự
nhiên của chúng.
- Bảo quản Ex-situ là bảo quản các mẫu trong điều kiện nhân tạo tối ưu. Bảo quản
ex xitu đóng vai trò quan trọng trong xây dựng các ngân hàng gen và được sử dụng
rộng rãi cho bất kì loại cây trồng nào.
Những hình thức bảo quản ex xitu khác nhau
+ Bảo quản cây trong vườn ươm tạo thành field bank.
+ Bảo quản hạt trong kho lạnh tạo thành seed bank.
+ Bảo quản in vitro tạo thành in vitro bank.
+ Bảo quản ADN tạo thành DNA bank.
Trong bốn phương thức trên, phương thức bảo quản in vitro có vai trò quan trọng
vì bảo quản trong một không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ một số lượng lớn cá thể,
điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp có hiệu quả đối với các cây

0
C có thời gian cấy chuyển là 25÷52 tuần. Những loài cay nhiệt đới thường bảo
quản ở nhiệt độ cao hơn. Ví dụ: chuối giữ được 15 tháng ở 15
0
C, cọ dầu bảo quản ở
18
0
C.
Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung vào môi trường nuôi cấy ABA (axit abcisic),
CCC (Clo Cholin Clorit).
Chất gây áp suất thẩm thấu: manitol, sorbitol, saccarose.
Thay đổi điều kiện nuôi cấy: giảm cường độ chiếu sáng, giảm nồng độ ôxi…
Ví dụ: nuôi cấy khoai tây ở 22
0
C và môio trường có 5÷10mg/l ABA thì thời gian
cấy chuyển kéo dài tới 12 tháng; cây sắn nuôi cấy ở 20
0
C trong môi trường có 4%
saccarose có thể kéo dài thời gian cấy chuyển tới 15 tháng.
• Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản, mẫu bảo quản cần được chuyển sang
môi trường mới pha chế và đặt trong điều kiện tối thích một thời gian ngắn để kích
thích sự tái sinh trưởng của mẫu trước khi bắt đầu một chu kỳ bảo quản mới.
Ví dụ: bảo quản sinh trưởng chậm cây khoai tây
Thời gian chuẩn bị mẫu: 8 tuần.
Thời gian bảo quản: 2 năm.
Nhiệt độ: 10
0
C.
Thời gian chiếu sáng:16h.
Cường độ chiếu sáng: 1500lux.

Agrobacterium tumefaciens?
o 0 o

Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens

Trong thập niên của những năm 1880 mở ra kỷ nguyên của cây trồng chuyển
gen khi con người đã phát hiện ra khả năng chuyển gen của vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
A.tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật sống trong đất,
trong lĩnh vực biến nạp gen nó được sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển các
gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra những thực vật mang gen có các đặc tính
mong muốn.
Đây là phương pháp chủ yếu và thành công nhất trong chuyển gen thực vật:
Đậu tương ; cà chua; khoai tây; bông…. Phương pháp này dựa trên cơ chế gây u
vết thương của A.tumefaciens. Khi cây bị thương, vi khuẩn này đã nhập vào chỗ
bị thương và gây u.
Tiến hành phân tích thành phần các chất trong khối u thì thấy có nhiều hợp
chất lạ. Phân tích hoá sinh các hợp chất lạ thì phát hiện ra đó là các phức hợp axit
amin arginin-xetoaxit, những hợp chất đó không có ở thực vật, vi khuẩn đã sử
dụng những hợp chất đó trong quá trình đồng hoá. Như vậy vi khuẩn đã chuyển
vào trong tế bào thực vật tác nhân gây u và những tác nhân đó tổng hợp lên
những hợp chất mới. Nhờ những thành tựu của kỹ thuật ADN tái tổ hợp, những
phương pháp nghiên cứu mới về ADN, người ta đã làm sang tỏ cơ chế gây bệnh
của vi sinh vật đất.

Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ thuật
chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien vẫn được ứng dụng rộng
rãi là nhờ những ưu điểm sau:
1. Không đòi hỏi dụng cụ đặc biệt

2. Đặc diểm cấu trúc của Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid

Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng
bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium gồm các
loài chính sau:
A. tumefaciens

gây b
ệnh u s
ùi thân.

A. rhisogenes
gây b
ệnh tóc rễ.

A. rubi

gây u
ở các loại dâu đất, mâm sôi.