Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
1
TIỂU LUẬN Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro
o 0 o

nghiệm (in vivo).
Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có
thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các
phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này
không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là
hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung
cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa,
khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp.
*Cơ sở khoa học
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô
tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản
phân hoá.
- Tính toàn năng của tế bào:
Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một
cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa
một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền
của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều
có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
3
năng của tế bào. Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô)
thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có
đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản
phân hoá.
- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào
+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế
bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau. Trong cơ thể thực

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có
được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
4
tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất
cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Ứng dụng:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo
giống.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại
cây trống khác nhau.
+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt
+ Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây
rau, cây hoa các loại cây trồng khác.
+ Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus
+ Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong
điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn.
Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền,
cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà
phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa
sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất.
*Các bước trong nhân giống in vitro
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho
nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai
đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp
với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm
tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các

Bước 3: nhân nhanh
Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số
lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con
đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung
chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là
phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao
nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27
0
C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh
sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá
chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ
nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân
phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng
chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường
nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường
nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là
thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển
từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết
sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có
chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi
phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây…)

/năm, như vậy
không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh
của thời vụ.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
7
- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong
thời gian dài ở điều kiện in vitro
* Nhược điểm
- Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra cí kích thước nhỏ và đôi
khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn
- Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả năng tự
tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi
dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên đọ ẩm không khí thường bão hoà.
Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bi mất cân bằng nước, gây hiện
tượng cây bị héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều
kiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện
bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh.
- Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.
- Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống
+ Tính bất định về mặt di truyền
+ Sự nhiễm mẫu
+ Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy
+ Hiện tượng thuỷ tinh hoá
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
8
Chuyên đề 4:
Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo ra cây sạch virus?
Các bước và điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh?
o 0 o

thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới.
Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây
đã nhiễm bệnh.
Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy
phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus
phụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể
sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây
(trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm).
Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở
khẳng định mô phân sinh đỉnh không có virus. Theo các ông có thể do các lý do sau:
- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong mô
phân sinh đỉnh.
- Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các
thông tin di truyền của virus.
- Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác
trong cây.
- Nồng độ auxin cao ở mô phân sinh đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chép
virus.

* Kỹ thuật làm sạch virus in vitro:
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh: tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước
<0,3mm, nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây
nguyên vẹn. Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương pháp khác
nhau để thu nhận cây sạch bệnh.
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao: ở nhiệt độ cao 36-37
0
C
thì một số loài virus không còn khả năng nhân lên. Lợi dụng đặc tính này có thể kết
hợp phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh với xử lý nhiệt để tẩy sạch virus khỏi
mẫu. Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5-

gồm MS và 12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml.
+ Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ
20-22
0
C.
+ Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in
vitrro. Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus.

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
11

Cây sau khi nuôi cấy Cây khi hình thành củ

 Nhân giống in vitro hoa đồng tiền: Các bước thực hiện như sau:
+ Bước 1: Khử trùng mẫu. Mẫu lấy là các nụ hoa bình thường. Nụ hoa được lấy
về sau đó khử trùng bằng HgCl
2
nồng độ 0,1% trong 7 phút.
+ Bước 2: Cắt nụ hoa thành các lát mỏng. Dùng các lát mỏng này để tạo thể tiền
chồi bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppmBA, 0,2ppm Ki,
0,2pp IAA).
+ Bước 3: Nhân nhanh chồi mầm. Tách thể tiền chồi và nuôi cấy trong môi
trường nhân tạo (MS, 1ppm Ki).
+ Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh. Sau nhân nhanh tách cây và nuôi trong môi
trường nhân tạo (MS, 0,1ppm α-NAA).
+ Bước 5: Sau tạo cây hoàn chỉnh thì đưa cây con ra vườn thích nghi. Cây con
được trồng trong giá thể (1 trấu hun + 1 mùn) và đảm bảo những điều kiện tốt nhất
cho cây con phát triển. Sau đó cây con được đưa ra vườn sản xuất. Tiến hành chăm
sóc bình thường.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp

+ Việc xuất hiện các triệu chứng đặc trưng còn phụ thuộc vào điều kiện thí
nghiệm như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, v.v.
+ Phương pháp lây nhiễm cho cây chỉ thị khá phức tạp, có loại phải truyền qua
côn trùng truyền bệnh (các vecto truyền bệnh) rất phức tạp.
+ Tốn khá nhiều công để trồng trọt, chăm sóc cây chỉ thị, nuôi dưỡng côn trùng
truyền bệnh. Cần có nhà nuôi cấy cách ly. Kinh phí đầu tư lớn.
+ Việc chuẩn đoán bệnh cuốn lá bằng phương pháp này khó tiến hành.
+ Phương pháp này chỉ sử dụng khi số lượng cá thể ít.
Ví dụ như bệnh hoa lá dưa leo (Cucumic Mosaic Virus) sử dụng cây chỉ thị là cây
Chenopodium quinoa.
- Phương pháp huyết thanh: Phương pháp này được đánh giá là nhanh và hiệu quả.
Có thể cho kết quả sau 48 giờ. Do đó chi phí cho xét nghiệm là ít. Muốn xem phản
ứng huyết thanh người ta trộng lẫn huyết thanh đặc hiệu cho mỗi loại virus với dịch
cây cần chuẩn đoán bệnh. Kết quả thu được kết tủa ở dạng bông hay dạng mây mờ
(phản ứng kháng nguyên + kháng thể). Phương pháp này đã có nhiều cải tiến như
làm sạch protein virus trước khi tiêm vào thỏ; tạo ra kháng thể đơn dòng có tính đặc
hiệu rất cao đã nâng cao chất lượng của huyết thanh.
- Phương pháp chuẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử: Kính hiển vi điện tử có độ
phóng đại từ một đến hàng chục vạn lần, có thẻ quan sát được các sợi, thể hạt của
virus. Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế do:
+ Chi phí cho thiết bị khá lớn.
+ Số lượng mẫu hạn chế, phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu khá phức tạp.
+ Không phát hiện được virus cầu do chúng khá giống cơ quan tử của tế bào.
- Phương pháp chuẩn đoán bằng test ELISA (enzym linked immunosorbent assay):
Test ELISA là một tiến bộ trong lĩnh vực chuẩn đoán bệnh virus hại cây trồng.
Phương pháp có độ đặc hiệu cao. Chính xác, nhậy, nhanh, dễ tiến hành nên nhanh
chóng trở thành phương pháp thông dụng.
Test ELISA được Enguall và Permann (1971;1972) đề cập đầu tiên trong lĩnh vực
nhân y. Từ năm 1986 nó được sử dụng như một test có độ nhạy rất cao để chuẩn
đoán virus ở thực vật (Clark, Adams và Barbara 1976). Với khả năng phát hiện

Phương pháp này được coi là vũ khí vô cùng lợi hại của con người. Phương pháp
này có thể phát hiện virus ở nồng độ rất thấp với độ chính xác rất cao. Chính vì vậy,
phương pháp này đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất các giống
sạch bệnh virrus hiện nay.

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
15
Chuyên đề 5:
Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công
tác giống cây trồng?
o 0 o
* Khái niệm về cây đơn bội:
Các cây trồng khác nhau thường có mức bội thể khác nhau. Có thể là đơn bội (n),
lưỡng bội (2n), tứ bội (4n), v.v. Tuy nhiên phổ biến trong tự nhiên là lưỡng bội (2n)
và tứ bội (4n). Như vậy, với các loại cây trồng này kiểu hình thể hiện ra ngoài là sự
tác động tổng hợp của nhiều kiểu gen, phụ thuộc và tính trạng là lặn hay trội. Trong
công tác chọn giống người chú ý nhiều tới thể đơn bội (n), bởi lẽ cây trồng ở dạng
đơn bội thường rất khó tồn tại trong tự nhiên. Nó chỉ sống được trong điều kiện nhân
tạo của con người. Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người
ta phải tiến hành đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra alen hoàn toàn giống nhau.
Những biểu hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó
đang có, kể cả các gen lặn. Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong
công tác chọn giống.
* Các đường hướng tạo cây đơn bội:
Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào
đơn bội. Nếu như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n).
Tuy nhiên trong tự nhiên rất hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học đã

1
, F
2
)

Chọn giống ưu thế lai
dòng đồng hợp tử tuyệt đối

Nhị bội hóa số lượng NST
(Tự phát, xử lý, colchicine) Cá thể đơn bội

Lai với các thể đơn bội khác
bằng dung hợp tế bào trần Nuôi cây tế bào trần
(lai Soma) của các thể đơn bội Gây đột biến, chọn lọc in vitro Tái sinh cây Nguyên liệu khởi đầu
cho chọn giống

* Kỹ thuật tạo cây đơn bội:
- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn:

khác nhau. Chẳng hạn, với họ hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt 2,4 D ở nồng độ
cao để khởi động sự phân chia đầu tiên (lúc mì 10
-5
mol 2,4 D trong 12 ngày); Cây
họ cà cần ít hơn, khoảng 10
-6
mol. Về hàm lượng đường cũng khác nhau, ở ngô là 60-
120g saccarose/l, lúa 50-60 g saccarose/l, cây họ cà 20-40g saccarose/l, v.v. Ngoài ra
một số hỗn hợp tự nhiên như dịch chiết khoai tây, nước dừa tỏ ra có tác dụng tốt
trong nuôi cấy bao phấn. Còn các nguyên tố đa lượng và vi lượng ít ảnh hưởng
trong nuôi cấy bao phấn.
Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội. Không phải tất cả các cây tái sinh khi nuôi cấy bao
phấn đều là cây đơn bội, vì vậy để xác định cây đơn bội có thể sử dụng một số
phương pháp như đếm số lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của tế bào, trồng
cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng.
+ Kỹ thuật nuôi cây cấy hạt phấn: Các bước nuôi cấy hạt phấn tương tự như nuôi
cấy bao phấn, tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi nuôi. Các hạt
phấn này thước được nuôi cấy trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi
cấy trong môi trường bán lỏng.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
18
Sơ đồ tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn:

Cây đơn bội
Phôi hóa
Tạo callus


Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
20

Chuyên đề 6. Kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast)
o 0
a. Khái niệm tế bào trần
Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần
nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt
bên trong và bên ngoài tế bào trần.
b. Phương pháp tách tế bào trần
* Nguyên tắc:
- Sử dụng hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza để phân giải
thành tế bào và giải phóng các tế bào trần.
- Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải được
phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào
không bào, gây vỡ tế bào chất bằng việc bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu như
saccarose, manitol, sorbitol, Ca
2+
…
- Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợp
với từng loại cây trồng.
Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g lá
tươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần.
* Các bước tiến hành
- Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo,
tế bào huyền phù.
- Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl
2
, đường monitol …0,5÷0,7M)
- Xử lý hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza


c. Quá trình tái sinh của tế bào trần và các yếu tố ảnh hưởng
* Quá trình tái sinh:
- Nuôi cấy protoplast: thường chia 2 giai đoạn
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
22
+ Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào và phân chia
tạo thành cụm nhỏ tế bào (4÷10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánh
sáng yếu, trong môi trường lỏng có lắc hoặc bán lỏng. Môi trương cần giàu dinh
dưỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp. Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ
dưỡng.
+ Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sạo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi
cấy trong điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trường đặc.
Cần chú ý tới tỷ lệ và hàm lượng Auxin và xytokinin để tái được cây từ callus.
- Có hai con đường phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnh
đối với các tế bào có nguồn gốc protoplast:
+ Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), ví dụ tế bào
protoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá.
+ Thông qua con đường phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis), ví dụ
các tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù
một số loài cây thuộc họ hoà thảo.
Nếu đảm bảo được môi trường nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽ
hình thành sau khoảng 3÷5 tuần. Nhưng nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, các
biến đổi di truyền có thể xảy ra. Ví dụ, trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast
từ cây khoai tây, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, con lai là cây 4n.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
23

è
i m
«

Ph
¸
t sinh ch
å
i / rÔ

H×nh
th
µ
nh cÊu tr
ó
c ph
«
i

C
©
y ho
µ
n ch
Ø
nh

Organogenesi
Embryogenes
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp

.
+ Năm 1974, Melchers phát hiện ra môi trường dung hợp tế bào trần gồm
50mM Ca
2+
, 0,4M manitol, pH 10,5 tỏ ra thích hợp cho dung hợp tế bào trần nhiều
loài cây trồng khác nhau.
+ Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG (polyethylenglycol) có tác dụng làm tăng
hiệu quả dung hợp của protoplast. Khi được ngâm vào dung dịch PEG (20÷40%
w/v), các protoplast kết dính lại với nhau. Sau đó, PEG được rửa bằng dung dịch
Ca
2+
có độ pH cao, màng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra và các protoplast
sẽ dung hợp với nhau. Do PEG độc với tế bào, nồng độ PEG thường được giảm đi
và bổ sung thêm vào đó DMSO (dimethyl sulfuside).
- Dung hợp bằng xung điện: đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần vào một điện
trường, các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi giữa hai bản cực. Khi có một
xung điện cao (750÷1000V) trong một thời gian rất ngắn (1÷200 mili giây) vùng tiếp
xúc giữa hai màng tế bào sẽ bị vỡ, hai tế bào trần hoà nhập vào nhau - qua trình
dung hợp sẽ xảy ra.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
25d. Ứng dụng của protoplast
* Dung hợp protoplast
- Khi các tế bào trần dung hợp với nhau và tạo thành một tế bào lai mang trong
mình vật chất di truyền tất cả các bố mẹ. Các tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào
soma nên gọi là lai soma.
- Chọn lọc các thể lai soma
+ Do lai ngẫu nhiên nên có thể