Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
11

Nụ hoa Tạo thể tiền chồi Nhân nhanh Vườn ươm Cây giống Vườn sản xuất

* Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus: Sau khi đã nuôi cấy thành công cây
sạch bệnh thì việc nhân nhanh và duy trì nguồn giống sạch bệnh là vô cùng quan
trọng. Chính vì vậy, ở giai đoạn này việc chuẩn đoán bệnh virus tái nhiễm là không
việc không thể thiếu, để từ đó phát hiện ra các cá thể nhiễm bệnh và loại ra khỏi
nguồn giống. Có một số phương pháp chuẩn đoán bệnh virus như sau:
- Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt (thông qua triệu chứng bệnh): Đây là
phương pháp đơn giản nhất cho phép có thể xác định bệnh virus thông qua biểu hiện
của cây trồng. Phương pháp này đòi hỏi phải có kinh nghiệm quan sát và so sánh do
có thể nhầm lẫn với một số loại bệnh không phải virus gây ra. Phương pháp này
cũng không thể cho phép xác định chính xác loại bệnh virus đang nhiễm.

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
12
- Phương pháp chuẩn đoán bằng cây chỉ thị: Vào những năm 1940, phương pháp
này được coi là phương pháp nhạy và chính xác nhất để xác định bệnh virus. Nhờ
phương pháp này đã xác định được 2 virus phổ biến là X và A (Leviel 1986).
Phương pháp này dựa trên những biểu hiện đặc trưng của cây chỉ thị khi nhiễm
bệnh. Người ta đã tìm ra khoảng 200 cây chỉ thị chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae),
họ rau dền (Amaranthaceae), họ rau muối (Chenopodaceae), họ đậu (Fabaceae), họ
cúc (Asteraceae), trong đó họ cà chiếm ưu thế. Tuy nhiên phương pháp này vẫn bộc
lộ một số nhược điểm như:
+ Thời gian chuẩn đoán kéo dài do phải qua một quá trình ủ bệnh mới xuất hiện
triệu chứng.

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
13
nhạy, mọi virus nhất là virus cuốn lá hại khoai tây (nồng độ thấp), phương pháp này
là tốt nhất, dễ sử dụng (Casper 1977).
Nguyên lý của phương pháp vẫn dựa vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể,
nhưng kháng thể được liên kết với một enzym (enzym linked). Phức enzym – kháng
thể- kháng nguyên sẽ dễ nhận biết do một phản ứng màu nhờ hính sự có mặt của
emzym xúc tác. Phản ứng màu thường là sử dụng các phản ứng phân giải 4-
nitrophenolphosphat bởi photphataza. Khi tách phosphat, α-nitrophenol sẽ có màu
vàng. Mỗi enzym có thể xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu màu
được khuếch đại rất rõ. Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thử
plastic, nên có tên gọi là immunosorbent. Như vậy, trên bản thử lỗ nào có màu vàng,
nơi ấy có mặt phức kháng nguyên – kháng thể - enzym, tức là có virus. Cho đến nay
có thể nói test ELISA là công cụ chính trong việc chuẩn đoán bệnh virus. Bằng
phương pháp ELISA có thể chuẩn đoán chính xác cả mặt định tính và định lượng.
- Chuẩn đoán bằng kỹ thuật phân tích ADN:
Phương pháp này cho kết quả nhanh và chính xác. Phương pháp thông dụng gọi là
phương pháp PCR.
Nguyên lý chung của phương pháp là xác định trực tiếp sự có mặt của phần lõi axit
nucleic của virus. Phần lõi này có trình tự rất đặc hiệu tùy theo mỗi loại virus. Từ đó
mà có thể là phát hiện trực tiếp qua bảng phản ứng PCR. Sử dụng các cặp mồi là các
đoạn nucleotid (dài từ 10-30 nu) có trình tự bổ sung với hai đầu (phía 3’) của hai sợi
đoạn ADN cần nhân. Sau thời gian cho phản ứng trên máy PCR khoảng 3 giờ có thể
lấy mẫu và đánh giá kết quả. Nếu mẫu sạch virus tức là không có khuôn ADN của
virus thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình nhân ADN không xảy ra. Còn ở mẫu
bệnh, sự nhân ADN diễn ra mạnh mẽ (sau 30 chu kỳ có thể nhân hàng trăn triệu
đoạn ADN). Có thể nhận biết ADN qua phương pháp điện di. Từ đây cso thể kết
luận mẫu có nhiễm bệnh hay không. Tuy nhiên, một số virus có cấu tạo phần axit
nucleic là ARN, trong trường hợp này cần phải chuyển ARN virus sang dạng ADN
(cADN) sau đó phát hiện ADN này bằng phương pháp PCR.

tiến hành nghien cứu bằng các con đường khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội làm
nguồn vật liệu cho công tác chọn giống. Vào năm 1924, Blakeslee và cộng sự đã
chứng minh được rằng có thể thu được các dòng nhị bội thuần đồng hợp bằng cách
nhị bội hóa các thể đơn bội. Đến năm 1964, hai ông Guka & Maheshwari (Ấn Độ)
đã lần đầu tiên tạo thành công cây đơn bội bằng nuôi cây bao phấn cà độc dược.
Tiếp sau đó với các đóng góp của Nitsch và Noieel (1973-1976) đã càng khẳng định
việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy là hoàn toàn có thể thành công. Cho đến
nay, đã có khoảng 170 loài cây trồng được tạo ra bằng con đường đơn bội.
Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau:
- Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối. Đây là một hướng có thể
coi là thủ công và rất mất thời gian. Thường phải mất đến 5-7 thế hệ mới tạo được
dạng đồng hợp tử. Đây cũng là một phương pháp khó thực hiện và tốn kém.
- Tạo cây đơn bội bằng in vitro. Đây là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện
dụng và nhanh chóng của phương pháp này. Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội.
Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển
thành cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kích
thích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội. Đặc biệt với
cây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giống
cây trồng.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
15
* Khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây
trồng:
Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau:
- Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen.
- Tạo đột biến ở mức đơn bội.
- Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng.
Sơ đồ các hướng ứng dụng cây đơn bội:

Dòng thuần ổn định (F

+ Nguyên lý:
Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa
các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích
các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
16
Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực
(androgensis). Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinh
sản đơn tính đực như sau:
 Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược. Khi đó hạt phấn
đơn nhân (tiểu bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n).
 Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu
bào tử) tạo mô sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n.
 Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh sản
đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà
chua.
+ Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn:
Bước 1: Chọn bao phấn. Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định
trong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm
lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.
Bước 2: Xử lý nụ hoa. Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và
trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây
đơn bội. Chế độ xử lý lạnh phụ thuộc vào loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 10
0
C
trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 7
0
C trong 1 tuần; thuốc lá xử ý ở 2-3 ngày.
Bước 3: Chọn môi trường thích hợp. Môi trường nuôi cấy thích hợp là điều vô
cùng quan trọng. Với mỗi loại cây trồng khác nhau thì lại có môi trường thích hợp

Cây đơn bội
Nuôi cây bao phấn
môi trường dinh dưỡng đặc hiệu

- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh:
Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay
trinh nữ sinh (gynogensis).
Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để tạo cây đơn
bội. Tuy nhiên, khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy rằng, nuôi cấy
bằng bao phấn và hạt phấn đã bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ bạch tạng là rất
cao. Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải đường, hướng dương, v.v. đã không
cho kết quả như mong muốn. Trên cơ sở đó, vòa những năm 70 các nhà khoa học đã
tập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và đã
thu được nhiều thành tựu.
Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau. Đối
với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%; ở lúa là 1,5-12%; ở dâu tằm là 3-6%, …
Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do
việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn. Nhằm tăng hiệu quả của quá
trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn
phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, …
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
18
Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn
giản và thu được nhiều thành công hơn cả.

- Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm.
- Kiểm tra khả năng sống (fluorescein diacetate) và tạo huyền phù protoplast có
mật độ phù hợp (10
4
÷10
7
/ml)
Ví dụ về kỹ thuật tách tế bào trần
+ Ở cây thuốc lá
Nguyên liệu thực vật: lá thứ 3 từ trên xuống.
Hỗn hợp enzym: cellulolaza 1%
macerozyme 0,02%
driselaza0,05%
Thời gian ủ: 16h (ngâm qua đêm)

+ Ở cây ngô
Nguyên liệu thực vật: tế bào hạt phấn.
Hỗn hợp enzym: cellulolaza 2%
macerozyme 0,1%
pectolyaza 0,05%
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
20
Thời gian ủ: 4÷12h (ngâm qua đêm)
Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước 50÷80µm,
rồi rửa bằng dung dịchkhông có enzym bằng ly tâm.