Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
1

Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro
o 0 o

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một
lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Bao gồm:
+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)
+ Nuôi cấy tế bào đơn
+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi
đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần
Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm
nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
(in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống
nghiệm (in vivo).
Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có
thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các
phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này
không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là
hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung
cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa,

Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được
biểu diễn theo sơ đồ sau:

Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một
thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và
một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã
hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế
bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất
định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các
gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào.
*Các ứng dụng
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to
lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử
dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế
bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô
nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có
được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
3
tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất
cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Ứng dụng:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo
giống.

Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)
Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng
để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
4
tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút,
NaOCl hoặc Ca(OCl)
2
5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H
2
O
2
, dung dịch Br…
Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)
Chất hữu cơ: đường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin
(GA3)
Bước 3: nhân nhanh
Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số
lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con
đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung
chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là
phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao
nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27
* Các phương pháp nhân giống in vitro
Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau:
* Ưu điểm
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây
giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong
khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải
sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị
nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch
virus
- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của
cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo
ý muốn
- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian
ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 3
6
-10
12
/năm, như vậy
không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh
của thời vụ.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
6
- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong
thời gian dài ở điều kiện in vitro
* Nhược điểm

của virus người ta đã tạo ra các loại vacxin và thuốc kháng sinh nhằm tăng cường
sức đề kháng cho cơ thể.
Phổ tác động của virus là rất lớn. Nó không những tác động đến con người, động
thực vật, thậm chí cả những loài vi sinh vật khác. Trong nông học, chúng ta quan
tâm chủ yếu đến thực vật vì đây là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp.
Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến,
trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là
một loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các
mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.),
qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.).
Tác hại của virus là vô cùng lớn. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩm
chất của nông sản. Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus
truyền bệnh
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
8
* Cơ sở lý luận của phương pháp:
Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống. Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950),
Morel & Martin (1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá bao
thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới.
Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây
đã nhiễm bệnh.
Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy
phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus
phụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể
sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây
(trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm).
Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở

0
C trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus
sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao.
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh
đỉnh có kích thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh. Các chất kháng virus như 2-thiouracil,
ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản
của virus.
- Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh
trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với
cây thân gỗ, đặc biệt họ cam chanh.
Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus:
 Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất
khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính. Vì vậy cần tạo ra
các giống khoai tây sạch bệnh virus. Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhân
giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến. Để nhân giống in vitro khoai tây cần
thực hiện các bước sau đây:
+ Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn. Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiều
cao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập. Thông thường nuôi
cấy 8-10 cây trong bình 250ml.
+ Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn. Môi trường tạo củ
gồm MS và 12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml.
+ Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ
20-22
0
C.
+ Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in
vitrro. Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus.

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp