Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
NGUYỄN THỊ CÚC

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I
BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA
TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2012 NGUYỄN THỊ CÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2012

25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, hướng
dẫn tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ chân thành của các đồng nghiệp.
Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới TS.
Đỗ Thị Thảo - Phó trưởng Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ
sinh học, đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng
như trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học của Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban giám hiệu
Trường Đại học Thái nguyên và Phòng Thử nghiệm sinh học đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm các anh, chị đồng nghiệp phòng Thử
nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn ủng hộ và
giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012
Học viên
Nguyễn Thị Cúc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



2.2.5.1. Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư 10
2.2.5.2. Ứng dụng RNAi trong việc tạo Hoa Hồng Xanh 10
2.2.5.3. Ứng dụng RNAi trong việc trừ sâu bệnh 11
2.2.5.4.Các ứng dụng khác ca RNAi 11
2.2.6. Ý nghĩa của RNAi 11
2.2.7. Khái niệm về knock-down gene 11
2.3. Những hiểu biết về Enzyme sialyltransferase (ST) 12
2.3.1. Enzyme sialyltransferase đối với sự di căn của tế bào ung thư 12
2.3.2. Khái niệm về Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I 16
2.3.3. Phân loại các Enzyme sialyltransferase 17
2.3.4. Mô hình tác động của hệ Enzyme sialyltransferase 18
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc thuộc lĩnh vực đề tài . 19
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 20
3.1.1. Vật liệu 20
3.1.2. Hoá chất 20
3.1.3. Thiết bị 21
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 21
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 21
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 21
3.3.2. Phương pháp knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA nhờ
lipofectamin 22
3.3.3. Phân tích và so sánh hình thái tế bào sau khi bị knock-down 23
3.3.4. Xác định khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển nhiễm 23
3.3.5. Thu nhận RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen 23
3.3.6. Kiểm tra hiệu quả knock-down gene bằng RT-PCR theo bộ kit của
Applied Biosystem 23
3.3.7. Thu nhận Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 24



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Giới thiệu một số dạng liên kết giữa phân tử amino acid với phân
tử đường trong tự nhiên 13
Bảng 4.1 .Giá trị OD trung bình ở bước sóng 570 nm 29
Bảng 4.2. Hàm lượng RNA tổng số của các mẫu 30
Bảng 4.3. Hiệu quả knock-down gene ST3Gal-I sau khi chuyển nhiễm
siRNA 32
Bảng 4.4. Hàm lượng Glycoprotein thu được từ tế bào chuyển nhiễm
siRNA 37
Bảng 4.5 Kết quả phân tích khối phổ protein 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Vị trí của gene ST3Gal-I 16
Hình 2.2. Mô hình tác động của hệ enzyme ST trong đó có ST3Gal-I 18
Hình 4.1. Hình ảnh tế bào MCF7 sau 3 ngày chuyển nhiễm ở độ phóng đại
20 X gồm: (A) tế bào đối chứng (không chuyển nhiễm siRNA); (B) tế bào
chuyển nhiễm siRNA 28
Hình 4.2. Sự sống sót và phát triển của các tế bào MCF7 sau khi chuyển
nhiễm siRNA 30
Hình 4.3. Định lượng RNA tổng số của các mẫu thu được bằng hệ thống
NanoDrop của Thermo Scientific 31

EDTA
FBS
Gal Nac
Hela S3
HT-29
NFkB-p65
MCF7
MDA-MB-231
miR 21
miRNA
mRNA
Neu5Ac
PI3K
RIPA
rpm
RISC
RNA
RNAi
Protein Kinase B
ankyrin repeat domain 46
Base pair
Complementary Deoxyribonucleic acid
Deoxyribonucleic acid
Môi trường nuôi cấy tế bào
RNA sợi đôi
Ethylenediamintetraacetic acid
Phosphate bufer saline (huyết thanh phôi bò)
N-acetylgalactosamin
Dòng tế bào ung thư vú
Dòng tế bào ung thư ruột người

Single strand RNA
2,3 Sialyltransferase galatose
Dòng tế bào ung thư ruột kết người
Tế bào ung thư
Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

PHẦN I. MỞ ĐẦ U
1.1. Đặt vấn đề
Là căn bệnh nan y, gây ra tỉ lệ tử vong cao cho ngườ i bệ nh và rất khó
chữa trị, ung thư đang là mối nguy hiểm cho con người trên toàn thế giới .
Khoảng 7 triệ u ngườ i mỗ i năm bị tử vong do ung thư và ướ c tính khoả ng 9
triệ u ngườ i chế t và o năm 2015 và 11,4 triệ u ngườ i chế t và o năm 2030 do

quả cao. Vì thế, với việc knock-down gene ST3Gal-I trên mô hình tế bào
ung thư vú MCF7 của người, chúng tôi mong muốn tìm hiểu mối liên quan
giữa gene ST3Gal-I với đặc tính di căn của các tế bào ung thư nói chung và
của tế bào ung thư vú MCF7 nói riêng.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề
tài: ‘‘Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal-I bằng kỹ thuật knock-down
với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7’’
1.2. Mục tiêu nghiên cƣ́ u của đề tài
 Knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA trên mô hình tế bào ung
thư vú MCF7.
 Tìm hiểu mối liên quan của gene ST3Gal-I tới quá trình di căn của tế
bào ung thư.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

PHẦN II. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U
2.1. Ung thƣ
2.1.1. Tình hình bệnh ung thư trên thế giớ i và ở Việ t Nam
Ung thư là một căn bệnh nguy hiểm và khó chữa trị, số lượng người
mắc bệnh ngày càng cao. Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới (WHO),
ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Hiện nay,
số ca mắc ung thư mới vào khoảng 10 triệu người/năm. Ở Việt nam, số

R A (2000) phân chia thành các dạng:
+ Carcinoma: đây là dạng ung thư phổ biến nhất, phát sinh từ những
tế bào có nguồn gốc từ lá phôi trong và lá phôi ngoài, như ung thư phổi,
ung thư vú, ung thư trực tràng
+ Sarcoma: là dạng ung thư í t gặp, phát sinh từ những tế bào có nguồn
gốc lá phôi giữa, những tế bào thuộc hệ thống chống đỡ của cơ thể như
xương, sụn, mỡ, mô liên kết và cơ.
+ Lymphoma: là dạng ung thư phát sinh từ các hạch bạch huyết và các
mô thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể như: ung thư Lymphoma Burkitt.
+ Leukemia: là dạng ung thư nguy hiểm, biểu hiện bệnh rất sớm, xuất
hiện ở trẻ em và người trẻ tuổi, phát sinh từ các mô tạo máu, các tế bào
máu non thuộc tuỷ xương, có xu hướng tích tụ thành số lượng lớn trong
máu như ung thư bạch cầu cấp tính (Human Acute Leukemia).
2.1.4. Tác nhân gây bệ nh ung thư
Có rất nhiều nguyên nhân gây bệnh ung thư , mỗ i nguyên nhân lạ i tác
động theo mộ t cơ chế khác nhau , gồm 2 nhóm tác nhân lớn: tác nhân hóa
học và tác nhân sinh học (Nguyễ n Chấn Hù ng, 1994).

2.1.4.1. Tác nhân hóa học
Tác nhân hoá học gây ung thư gồ m khói thuốc lá , các thành phần hoá
học trong thuốc trừ sâu, các sản phẩm phụ gia dùng cho bảo quản thực
phẩm, chất tạo màu không đạt tiêu chuẩn, khí đốt xăng dầu, động cơ, khí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thải nhà máy công nghiệp cũng được xem là độc hại và là nguyên nhân
gây bệnh ung thư cao cho con người (Đái Duy Ban và cs, 2000; Pezzuto
JM, 1995).
Cơ chế gây ung thư của tác nhân này là tác động vào cơ thể thông qua
việc tạo ra nhiều gốc tự do như: O


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

trong ung thư đại trực tràng, nhưng nhanh hơn và thích ứng nhanh chóng
khi di căn sang các cơ quan nội tạng khác. Nhóm tác giả đã nhận ra cơ chế
"tín hiệu tế bào WNT" là một trong 6 cơ chế được thử nghiệm về tính hoạt
hóa quá mức trong các khối ung thư phổi khi chúng di căn và không di
căn. Các thử nghiệm sâu hơn trên chuột cho thấy tế bào ung thư phổi với
đột biến gây khối u ở gen KRAS và EGFR phụ thuộc vào cơ chế WNT
hoạt hóa quá mức gây di căn. Các nhà khoa học cũng nhận thấy 2 gen
HOXB9 và LEF1 được hoạt hóa bởi WNT và làm tăng khả năng tế bào
ung thư phổi xâm lấn và tăng sinh khối u.
2.1.6. Dòng tế bào ung thư vú MCF7
Dòng tế ung thư vú MCF7 được phân lập đầu tiên vào năm 1970 từ
một bệnh nhân nữ, da trắng, 69 tuổi có tên là Frances Mallon và dòng tế
bào này được Herbert Soule và cộng sự thành lập, được lưu trữ tại Viện
nghiên cứu ung thư Barbara Ann Karmanos. Đây là dòng ung thư vú đầu
tiên có khả năng sống lâu hơn một tháng. Dòng tế bào ung thư vú này
mang đặc điểm giống các dòng tế bào ung thư vú biểu mô khác.
2.2. Giới thiệu về RNAi
2.2.1. Dòng thông tin di truyền trong tế bào
Mã di truyền trên DNA quy định việc hình thành thông tin di truyền
trong DNA và được sao chp thành RNA, sau đó tổng hợp protein. Dòng
thông tin di truyền từ DNA qua mRNA đến protein được gọi là “Học
thuyết trung tâm” của sinh học phân tử. Bộ gene của con người có khoảng
30.000 gene. Tuy nhiên, không phải mọi thông tin di truyền đều được sử
dụng mà chỉ có một phần thông tin di truyền trong hệ gene được sử dụng
trong mỗi loại tế bào. Việc gene nào được biểu hiện là do cơ chế kiểm soát
của bộ máy sao chp DNA sang mRNA trong quá trình phiên mã. Quá
trình phiên mã cũng bị điều khiển bởi nhiều nhân tố khác mà chúng ta còn

hoàn toàn (98%). Tuy nhiên, đến năm 1990 các nhà khoa học mới phát
hiện ra cơ chế gây ra sự ức chế trên là do gene (Napoli et al., 1990; Van

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

der Krol et al., 1990). Đó là nghiên cứu trên loài hoa dạ yến thảo (petunia).
Các nhà khoa học đã cố gắng tạo màu tím trên cánh hoa petunia bằng cách
chuyển gene quy định màu tím Chalcone synthase (CHS) dưới sự điều
khiển của promoter 35S. Gene CHS là gene có liên quan đến chu trình
hình thành chất anthocyanin trong hoa petunia. Tuy nhiên, cánh hoa lại thể
hiện các đốm màu khác nhau và cho ra màu trắng chứ không phải là màu
tím. Năm 1994, Cogoni và các cộng sự đã tiến hành một thí nghiệm nhằm
phát triển màu cam của nấm Neurospora crassa thông qua việc chuyển
một gene có chức năng tạo ra carotenoid. Tuy nhiên, nấm lại không có
màu cam. Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt tên là "quelling".
Năm 1995, Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến
trùng Caenorhabditis elegans, đó là hiện tượng RNA sợi sense và antisen
có hiệu quả ức chế biểu hiện gene như nhau (Guo S and Kemphues KJ,
1995).
Hiện tượng RNAi được khám phá đầu tiên trên giun tròn
Caenorhabditis elegans do việc ức chế biểu hiện gene bởi RNA sợi đôi
(Fire A et al., 1998). Timmons L và Fire A đã dùng antisense RNA để ức
chế biểu hiện gene. Hiệu quả tác động của hỗn hợp sense và antisense
RNA gấp ít nhất 10 lần so với chỉ là dùng sợi sense hay antisense
(Timmons L and Fire A, 1998).
Trong các tế bào người sự kích hoạt gene được tìm thấy đầu tiên do
các siRNA kích hoạt các promoter của E-cadherin và p21, làm tăng mức
độ biểu hiện của mRNA và protein (Morris KV and Vogta PK, 2010).
Trong in vivo, siRNA đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế lây nhiễm
virus vì nó làm bất hoạt RNA được tạo ra trong chu kỳ sống của virus

Cơ chế tắt gene phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa siRNA và
mRNA đích. Nếu sự tương đồng giữa siRNA và mRNA đích là hoàn toàn
thì phân tử mRNA có xu hướng bị cắt và phân giải (do hoạt tính nuclease
của RISC), do vậy không có mRNA mã hoá cho protein đó.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Cơ chế tắt gene bởi siRNA có hiệu quả rất cao, chỉ cần một lượng
nhỏ siRNA được đưa vào tế bào có thể đủ để làm tắt hoàn toàn sự biểu
hiện của một gene nào đó (vốn có rất nhiều bản sao trong cơ thể đa bào).
2.2.5. Ứng dụng của việc nghiên cứu các RNAi
2.2.5.1. Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư
Tế bào ung thư phát sinh từ sự tích lũy các đột biến liên tiếp có lợi
cho sự phân chia và tồn tại của chúng. Những biến đổi vật chất di truyền
(epigenetic) giúp tế bào ung thư vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch cơ
thể và cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) hay các tín hiệu
kìm hãm phân chia (antiproliferative signals). Sự khám phá ra cơ chế can
thiệp RNA chính là công cụ cần thiết để dò tìm các cơ chế phân tử bị thay
đổi trong tế bào ung thư. Do tính đặc hiệu của quá trình can thiệp RNA nên
có thể dễ dàng tiến hành thực nghiệm trên hàng ngàn gene hoặc toàn bộ hệ
genome trong một thí nghiệm. Từ đó, các khía cạnh của bệnh ung thư sẽ
được giải mã và sẽ tìm ra thuốc điều trị ung thư đặc hiệu.
2.2.5.2. Ứng dụng RNAi trong việc tạo Hoa Hồng Xanh
Trong cây trồng phân tử anthocyanin dihydrokaempferol (DHK)
được coi là sắc tố chủ đạo trên hoa, trái cây và các mô tế bào khác. Thông
thường các màu chính của hoa bắt nguồn từ DHK với sự có mặt của một ít
các chất carotenoid. Ngoài ra, DHK lại là một enzyme chi phối cho cả 3
chu trình hình thành sắc tố trên cây trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin
và delphinidin. Gene cyanidin mã hóa enzyme DHK làm biểu hiện các
màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà. Một loại enzyme khác có tên gọi là

Knock-down là thuật ngữ chỉ các quá trình can thiệp làm biến đổi
cấu trúc của một hay nhiều gene đã biết rõ trình tự. Từ đó làm giảm biểu
hiện của một gene đặc thù (Morris KV and Vorgt PK, 2010).
Kỹ thuật knock-down gene (hay còn gọi là kỹ thuật can thiệp RNA
(RNAi) gây bất hoạt gene) là phương pháp sử dụng một đoạn DNA hay

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

RNA có trình tự bổ sung với gene cần tác động hoặc bổ sung với RNA
thông tin (mRNA) của nó. Các đoạn này sẽ kết hợp với các gene cần tác
động hay các mRNA làm giảm biểu hiện của gene. Dựa vào sự thay đổi của
kiểu hình có thể hiểu hơn về chức năng của gene bị tác động. Sử dụng
siRNA là phương pháp được ứng dụng trong knock-down gene (Đỗ Năng
Vịnh, 2007).
Kỹ thuật knock-down gene là một kỹ thuật mới, chỉ cần một vài phân
tử RNA sợi kp (dsRNA) trong một tế bào cũng đủ để phân hủy các mRNA
của một gene đặc thù. Kết quả thực nghiệm cho thấy RNAi có thể gây bất
hoạt gene một cách hiệu quả ở bất kì cơ thể sống nhân thực nào.
2.3. Những hiểu biết về Enzyme sialyltransferase (ST)
2.3.1. Enzyme sialyltransferase đối với sự di căn của tế bào ung thư
Fukuda M (1995), Kannagi R và cộng sự (2004) đã chỉ ra rằng có sự
thay đổi đáng kể đối với quá trình glycosyl hóa của các protein nằm trên bề
mặt tế bào và sự thay đổi này liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự di
căn của tế bào ung thư (Fukuda M, 1995; Kannagi R et al., 2004).
Các phân tử glycan của tế bào như glycoprotein (GP),
glycosphingolipid (GSL) và proteoglycan được gọi chung là glycome đóng
vai trò rất quan trọng đối với các hoạt động sinh học nội và ngoại bào ví dụ
như quá trịnh tự định dạng của tế bào, quá trình gắn kết tế bào, tương tác
giữa các tế bào với nhau và truyền tín hiệu (Haltiwanger RS, Lowe JB,
2004). Trong đó, sự hình thành mối liên kết giữa phân tử đường với các

Đƣờng

Sinh vật
nhân
chuẩn
Sinh
vật cổ
Vi sinh
vật
N-glycosyl
Asn
GlcNAc

+
+
+
Ovalbumin, fetuin, insulin
receptor

Asn
Glc

+
+
–
Laminin, Lớp H. halobium S-

Asn
GalNAc



Ser/Thr
GalNAc

–
+
–
A. thermoaerophilus S-layer

Ser/Thr
GlcNAc

+
–
–
Protein của nguyên sinh chất
và nhân tế bào

Ser/Thr
Gal

+
–
+
Earthworm collagene, B.
cellulosoleum

Ser/Thr
Man


+
C. jejuni flagellins

Ser/Thr
DiActrideoxyhexose
g–
–
+
N. meningitidis pili

Ser
Glc

+
–
–
Coagulation factors

Ser
FucNAc

–
–
+
P. aeruginosa pili

Ser


Thr
GlcNAc

+
–
–
Dictyostelium
h
, T. cruzi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Thr
GlcNAc

+
–
–
Rho proteins (GTPases)

Thr
Glc

+
–
–
Rho proteins (GTPases)



Hyp
Ara

+
–
–
Potato lectin

Hyp
Gal

+
–
–
Wheat endosperm

Hyp
GlcNAc

+
–
–
Dictyostelium proteins

Tyr
Glc

+
–

Phosphoglycosyl
Ser
GlcNAc

+
–
–
Dictyostelium proteinase

Ser
Man

+
–
–
L. mexicana acid phosphatase

Ser
Fuc

+
–
–
Dictyostelium proteins

Ser
Xyl

+
–