Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
NGUYỄN PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ
CHỊU HẠN KHÁC NHAU
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
chung do nhiều gen quyết định, trong đó có gen cystatin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống ngô theo hƣớng
nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Đánh
giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin ở một số giống ngô chịu
hạn khác nhau”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xác định đƣợc mức độ chịu hạn của một số giống ngô ở giai đoạn cây non.
-Xác định đƣợc mối liên quan giữa hoạt tính của enzyme α – amylase,
protease, chiều dài rễ với khả năng chịu hạn của một số giống ngô.
- Phân lập và xác định đƣợc trình tự gen cystatin ở một số giống ngô có khả
năng chịu hạn khác nhau.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá khả năng chịu hạn bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo ở giai đoạn
3, 5, 7, 9 ngày gây hạn.
- Xác định hoạt tính của α – amylase, protease trong hạt của 10 giống ngô
nghiên cứu.
- Xác định chiều dài rễ 5 ngày tuổi ở giai đoạn cây non.
- Tách chiết DNA tổng số của 10 giống ngô nghiên cứu.
- Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen cystatin ở một số giống ngô.
- Tách dòng gen cystatin ở 2 giống ngô: một giống chịu hạn tốt và một giống
chịu hạn kém.
- Xác định trình tự gen cystatin ở giống ngô có khả năng chịu hạn kém.
cây hút nƣớc và các chất dinh dƣỡng suốt đời sống của cây. Rễ chân kiềng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
mọc quanh các đốt thấp sát mặt đất. Rễ này giúp cây chống đỡ và bám chặt
vào đất, chúng cũng tham gia hút nƣớc và thức ăn. Số lƣợng rễ, số lông rễ và
độ dài rễ khác nhau ở mỗi giống. Đây là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá
khả năng chịu hạn của cây.
Thân ngô đặc, đƣờng kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m. Thân ngô
trƣởng thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ.
Thân ngô ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận
chuyển chất hữu cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất
hữu cơ.
Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Các bộ phận
của lá bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa lá. Theo hình thái và vị trí trên thân, lá
ngô đƣợc chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá bẹ, lá bi. Số lá, độ lớn của
lá phụ thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số lá
ngô thƣờng biến động từ 15 - 20 lá. Đặc điểm nổi bật là lá ngô có rất nhiều
khí khổng. Trung bình một lá ngô có từ 2 - 6 triệu khí khổng, trên 1mm
2
lá có
từ 500 - 900 khí khổng. Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ
tới điều kiện hạn hán. Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời
làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng…
Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Cơ quan sinh sản đực (bông
cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau.
Hoa đực nằm ở đỉnh cây. Hoa cái phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm
nách nhiều nhƣng chỉ có từ 1 - 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Số
bắp trên cây phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ và phân bón.
Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi,
Ngô là cây lƣơng thực nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất
cả các nƣớc trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Nếu nhƣ ở
châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; châu Á là cơm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
(gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt.
Ngoài ra, bắp ngô bao tử còn đƣợc sử dụng làm rau cao cấp, lấy hạt làm
nguyên liệu chế biến các mặt hàng có giá trị dinh dƣỡng cao nhƣ sữa ngô, ngô
ngọt đóng hộp, đóng lọ…
Ngô là thức ăn giàu năng lƣợng, là thành phần quan trọng trong thức ăn
hỗn hợp cho gia súc và gia cầm. Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng trong thức ăn
tổng hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tƣởng cho đại
gia súc, đặc biệt là bò sữa.
Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp. Ngƣời ta đã sản xuất
khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lƣơng thực - thực
phẩm, công nghiệp dƣợc và công nghiệp nhẹ.
Ngoài ra ngô còn là nguồn hàng hóa xuất khẩu có giá trị cao. Trên thế
giới hàng năm lƣợng ngô xuất nhập khẩu khoảng 70 triệu tấn đem lại nguồn
lợi nhuận kinh tế lớn [9].
Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là
cây màu quan trọng nhất đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau. Cây
ngô không chỉ cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà còn là cây trồng
xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn [4].
1.1.4. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô
Thành phần hydratcacbon ở ngô chủ yếu là tinh bột (60 - 70%), lipid
chủ yếu là acid béo, protein ở dạng zein chiếm đa số, hàm lƣợng đƣờng
khoảng 3,5%, lƣợng tro khoảng 1 - 2,4%, chất khoáng chiếm trên 60% khối
lƣợng của phôi [8].
Tinh bột ngô hình tròn, hình đa diện, góc cạnh rõ rệt, kích thƣớc
B, từ độ cao 1 - 2 m đến 400 m so với mực nƣớc biển [9].
Do đó ngô đƣợc trồng ở hầu hết các nơi trên thế giới nhƣ Châu Mỹ, Châu Âu,
Châu Úc, Châu Phi và Châu Á. Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô giữa các
châu lục có sự chênh lệch nhau tƣơng đối lớn đƣợc thể hiện ở bảng 1.1 [58].
Diện tích trồng ngô giữa các châu lục có sự chênh lệch nhau,
trong đó Châu Mỹ là khu vực có diện tích trồng ngô lớn nhất, năm 2008 là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
60,4 triệu ha đến năm 2010 là 63,1 triệu ha, chiếm gần 40% diện tích ngô trên
toàn thế giới. Đứng thứ hai là Châu Á chiếm 33,2%. Châu Âu có diện tích
trồng ngô thấp, chiếm khoảng 8,7% diện tích trồng ngô thế giới. Châu Mỹ là
khu vực có năng suất cao nhất đạt 71,0 tạ/ha, đứng thứ hai là khu vực Châu
Âu: 60,6 tạ/ha, thấp nhất là Châu Á: 45,8 tạ/ha (năm 2010). Sở dĩ Châu Á có
năng suất thấp nhƣ vậy là do khu vực này có điều kiện bất thuận nhƣ; hạn
hán, lũ lụt, đất canh tác chƣa thuận lợi.
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn
2008 - 2010
Khu vực
Diện tích
(Triệu ha)
Năng suất
(Tạ/ha)
Sản lượng
(Triệu tấn)
2008
2009
2010
2008
71,9
71,0
439,5
441,5
447,9
Thế giới
161,2
158,8
161,9
51,3
51,6
52,1
827,5
819,7
844,4
(Nguồn FAOSTAT, 2011)
Giai đoạn 2008 - 2009, Châu Mỹ có năng suất tăng mạnh, tăng 3,3 tạ/ha;
Châu Âu tăng nhẹ: 0,2 tạ/ha; khu vực Châu Á có năng suất giảm (giảm 1,7
tạ/ha) do các điều kiện bất thuận. Về sản lƣợng, Châu Mỹ là khu vực dẫn đầu
sản lƣợng ngô trên toàn thế giới, năm 2008 đạt 439,5 triệu tấn chiếm 53,1%
tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế giới. Đứng thứ hai là khu vực Châu Á đạt
238,4 triệu tấn, chiếm 28,8% tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế giới. Năm 2010
Châu Mỹ đạt 447,9 triệu tấn, chiếm 53,0% tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế
giới, khu vực Châu Á đạt 246,1 triệu tấn, chiếm 29,1% tổng sản lƣợng ngô
trên toàn thế giới.
Nhƣ vậy, trong giai đoạn từ năm 2008 đến năm 2010 diện tích trồng
ngô trên toàn thế giới tăng không đáng kể, nhƣng do áp dụng các thành tựu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
177,54
Ấn Độ
7,18
19,60
14,10
(Nguồn FAOSTAT, 2011)
Trên thế giới, Mỹ là nƣớc có diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô lớn
nhất đạt 32,96 triệu ha, với tổng sản lƣợng đạt 316,17 triệu tấn, năng suất bình
quân đạt 95,92 tạ/ha. Kết quả trên có đƣợc, trƣớc hết là nhờ sự đầu tƣ cho
nghành nông nghiệp, không ngừng cải thiện các kỹ thuật canh tác, đồng thời
ứng dụng công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống đã góp phần đƣa năng
suất và sản lƣợng ngô của nƣớc này cao hơn các nƣớc khác. Các giống cây
trồng chuyển gen đƣợc tạo ra nhờ công nghệ sinh học đã đƣợc trồng phổ biến,
đem lại lợi nhuận nông nghiệp cao, trong đó nƣớc Mỹ tập trung vào các cây
mũi nhọn là bông, đậu tƣơng và ngô.
Có thể nói Mỹ và Trung Quốc là hai nƣớc có diện tích trồng ngô lớn
nhất và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác. Mỹ và Trung Quốc, cùng
với Ấn Độ là những nƣớc xuất khẩu ngô lớn, các nƣớc nhập khẩu ngô chính
là Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malaysia, Mexico, châu Phi…[9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
1.1.5.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Trƣớc đây, sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ và phân tán, chủ yếu là
tự cung tự cấp theo nhu cầu của hộ nông dân. Ngành sản xuất ngô nƣớc ta
thực sự có những bƣớc tiến vọt do áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật,
đặc biệt là việc sử dụng các giống ngô lai và mở rộng diện tích trồng ngô lai
vào sản xuất, kết hợp các biện pháp kỹ thuật canh tác theo yêu cầu của giống
mới.
Bảng 1.3. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô của Việt Nam từ
bƣớc nhảy vọt cao nhất từ trƣớc tới nay. Tốc độ tăng trƣởng diện tích, năng
suất và sản lƣợng ngô của Việt Nam cao hơn nhiều lần, lợi nhuận trồng ngô
lai cao hơn hẳn các loại cây trồng khác. Năm 2006, diện tích trồng ngô của cả
nƣớc (trong đó diện tích trồng ngô lai chiếm ƣu thế) đạt 1.033.100 ha, tổng
sản lƣợng trên 3.730.000 tấn. Năm 2008, diện tích trồng ngô tăng lên
1.440.200 ha, tổng sản lƣợng lên tới hơn 4.573.100 tấn. Đến năm 2009, do
quá trình công nghiệp hóa diễn ra mạnh, diện tích đất dành cho các ngành
công nghiệp và du lịch đƣợc mở rộng, diện tích đất nông nghiệp bị giảm nên
diện tích trồng ngô ở nƣớc ta giảm còn 1.089.200 ha và sản lƣợng cũng giảm
xuống còn 4.371.700 tấn (giảm 4,4% so với năm 2008). Nhờ việc đƣa các
giống ngô lai chịu hạn, năng suất cao nhƣ C919, LVN10,…và các giống ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
lai do Viện nghiên cứu ngô cung cấp vào sản xuất đã đƣa năng suất ngô trong
nƣớc tăng lên dù diện tích và sản lƣợng đều giảm. Năm 2010 diện tích trồng
ngô đạt 1.126.390 ha, tăng 3,3% so với năm 2009, sản lƣợng đạt trên
4.606.800 tấn, cao nhất từ trƣớc tới nay [58].
Tuy nhiên, sản lƣợng ngô của Việt Nam vẫn thấp hơn so với sản lƣợng
ngô thế giới. Có nhiều nguyên nhân khiến sản lƣợng ngô của nƣớc ta chƣa
cao nhƣ: do chƣa tập trung sản xuất ngô, do điều kiện khí hậu, tập quán canh
tác,…Ngoài ra, tại một số vùng miền núi khó khăn về sản xuất lúa nƣớc nên
nông dân phải trồng ngô làm lƣơng thực thay thế gạo, làm thức ăn chăn nuôi.
Các giống ngô đƣợc trồng đều là các giống truyền thống của địa phƣơng,
giống cũ nên năng suất rất thấp. Do đó, sản lƣợng ngô trong nƣớc không đủ
phục vụ cho con ngƣời cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi. Hàng năm
Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một lƣợng lớn ngô, đậu tƣơng làm thức ăn cho
gia súc. Chính vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu để có biện pháp cải tạo giống
ngô theo hƣớng tăng năng suất và chất lƣợng là rất cần thiết.
1.2. ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ
cây, giảm năng suất sinh học.
Hạn tác động lên cây theo hai hƣớng chính là làm tăng nhiệt độ cây và
gây mất nƣớc trong cây [12]. Mức độ thiếu hụt nƣớc càng lớn thì càng ảnh
hƣởng xấu đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây, nếu thiếu nƣớc nhẹ
sẽ làm giảm tốc độ sinh trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo
nguyên sinh chất làm tăng cƣờng quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt
nƣớc, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thƣơng và
chết.
Đối với thực vật nói chung và cây ngô nói riêng, hạn ảnh hƣởng nhất
tới hai quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây đó là giai đoạn cây non và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
giai đoạn ra hoa. Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng
suất gieo trồng. Nó làm giảm 50% năng suất cây trồng và có khi còn hơn thế
nữa.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây ngô
Ngô là cây trồng không đòi hỏi nhiều nƣớc và có khả năng chịu hạn
cao. Để tổng hợp đƣợc 1 kg chất khô ngô cần 260 - 349 kg nƣớc, trong khi
lúa cần 400 - 500 kg, đậu tƣơng cần 500 - 530 kg. Trong quá trình nảy mầm
thì nhu cầu về nƣớc của ngô chỉ là 30%, còn của đậu tƣơng là 50% [12].
Nhu cầu về nƣớc và khả năng chịu hạn của cây ngô qua từng thời kỳ sinh
trƣởng có khác nhau. Ở thời kỳ đầu cây ngô phát triển chậm, tích lũy ít chất xanh
nên không cần nhiều nƣớc. Ở thời kỳ 7 - 13 lá ngô cần 28 - 35 m
3
nƣớc/ngày/ha.
Thời kỳ xoắn nõn, trổ cờ, phun râu cần 65 - 70 m
3
nƣớc/ngày/ha. Ở giai đoạn cây
non khi gặp hạn cây có thể dễ dàng vƣợt qua, nếu ở những giai đoạn sau nhƣ
amino acid, các ion…), các chất này có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu.
Áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận đƣợc những phân tử
nƣớc ít ỏi còn trong đất. Bằng cơ chế nhƣ vậy thực vật có thể chịu đƣợc sự
mất nƣớc trong thời gian ngắn [16].
1.2.3.2. Cơ sở hóa sinh của tính chịu hạn của cây ngô
Chịu hạn ở thực vật thƣờng là kết quả của nhiều cơ chế đáp ứng stress
hoạt động đồng thời. Một số cơ sở hóa sinh của tính chịu hạn bao gồm: hoạt
độ enzyme
- amylase, protease, acid abscisic (ABA), proline…
Enzyme
- amylase thuộc nhóm hydrolase có trong cơ thể động vật
(nƣớc bọt, tụy tạng), thực vật (hạt hòa thảo nảy mầm), nấm mốc, vi khuẩn. Ở
thực vật, sự tăng hoạt độ của
- amylase sẽ làm tăng hàm lƣợng đƣờng do
tinh bột bị thủy phân, nên làm ảnh hƣởng tới sự điều hòa áp suất thẩm thấu
khi cây gặp hạn. Vì thế, dựa vào sự biến động hàm lƣợng
- amylase cũng có
thể sơ bộ đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu.
Protease đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể thực vật, nhất là trong
thời kỳ nảy mầm của hạt. Nó tham gia vào quá trình phân giải protein dự trữ
trong hạt nhằm cung cấp amino acid cho thời kỳ phát triển đầu tiên của cây.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
giai đoạn biệt hóa mô của thực vật, chúng đƣợc tổng hợp thêm trong điều kiện
cực đoan của môi trƣờng. Dựa vào khối lƣợng phân tử, ngƣời ta phân loại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
HSP ở thực vật ra làm 6 nhóm: HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP20,
HSP8,5 [48].
Trong đó, nhóm HSP70, HSP60 có đại diện của chất môi giới phân tử
(MGPT), MGPT là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau, chúng tham gia
tạo cấu trúc không gian đúng cho phân tử protein mới tổng hợp, chuyển protein
qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự huỷ hoại của
protein chƣa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu sự phân giải protein bị biến tính.
Nhóm HSP 8,5 (Ubiquitin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhƣng không
phải là MGPT, chúng có hoạt tính proteinase và thực hiện chức năng phân
giải protein nhƣng không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn các protein này gây
độc cho tế bào.
Các nhóm HSP100, HSP90 đều có tính bảo thủ cao và có hoạt tính
ATPase. Một số tìm thấy trong tế bào bình thƣờng nhƣng phần lớn chúng
sinh ra khi gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, nóng, lạnh. Chức
năng chính của chúng là ngăn chặn sự co cụm của protein và tái hoạt hoá
protein biến tính [45].
Trong tế bào thực vật, HSP tập trung thành các hạt sốc nhiệt HSG (Heat
Shock Granules). Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử, các hạt HSG gồm các
hạt HSP và mRNA. Các HSP gắn kết trên các RNA polymerase để ngăn cản
sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình bị stress nóng. Sau sốc nóng,
các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các ribosome hoạt động sinh tổng
hợp protein [42].
LEA (Late embryogenis abudant protein)
Khi cây trồng gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ: nóng, lạnh,
thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế
tác hại của stress môi trƣờng (muối, hạn). Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu
và đtg nhận thấy rằng hàm lƣợng của mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều
kiện stress muối, hạn hay hàm lƣợng ABA ngoại bào tăng cao [34].
LTP đƣợc chia thành hai dạng khác nhau về khối lƣợng phân tử. Dạng
thứ nhất có khối lƣợng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối
lƣợng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2). Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo
thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại proline [32]. Có thể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
nói LTP đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều
kiện khô hạn.
Gen
P5CS (gen mã hóa enzyme Pyrroline-5-carboxylate synthetase)
Nhóm gen P5CS mã hóa tổng hợp pyrroline-5-carboxylate synthetase.
Enzyme P5SC giữ vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa sinh tổng hợp
proline ở thực vật. Các nghiên cứu sử dụng enzyme này nhằm mục đích điều
khiển hàm lƣợng proline để thích ứng và tăng cƣờng khả năng chống chịu của
cây đối với các bất lợi về áp suất thẩm thấu và oxy hóa của môi trƣờng đã
đƣợc thực hiện ở nhiều loài cây khác nhau. Nhƣ vậy, sự biểu hiện của gen
P5CS mạnh sẽ làm tăng hàm lƣợng proline, có vai trò tăng áp suất thẩm thấu
của tế bào và cây trong điều kiện hạn hán [15].
1.2.4. Cystatin và vai trò của cystatin với tính chịu hạn
1.2.4.1. Cystatin
Cystatin (CYS) là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine
proteinase. Trong cơ thể sống, cysteine proteinase thực hiện nhiều chức năng
quan trọng nhƣ: Trƣởng thành protein, làm mới protein để phù hợp với những
thay đổi bên ngoài và loại bỏ protein bất thƣờng, protein gấp cuộn [29]. Khi
vật và thực vật, ngƣời ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [44], gồm hầu hết
các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với
hầu hết các cystatin họ I và II. Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt
gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên đƣợc nghiên cứu sâu sắc nhất.
Nó có mối liên hệ về mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng
gà (Barett). Oryzacystatin cũng đƣợc xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng mặt
của liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide cũng đƣợc tạo thành bởi Gln-Val-
Val-Ala-Gly ( gốc thứ 57 - 61) và khối lƣợng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
102 gốc amino acid. Trình tự amino acid của oryzacystatin giống 30% với
cystatin họ II, nó có vùng trình tự Phe-Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try
(gốc thứ 83 - 84), điều đó chứng tỏ oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm
cystatin họ II.
Các chất ức chế cysteine proteinase có nguồn gốc từ thực vật đƣợc chia
làm hai nhóm, nhóm 1 gồm chủ yếu là phytocystatin có chứa vùng đơn và
nhóm thứ 2 có chứa vùng đa, nhƣ multicystatin đƣợc phân lập từ củ khoai tây
và cystatin của lá cà chua. Cystatin phân lập từ củ khoai tây không chứa vùng
bảo thủ Gln-X-Val-Y-Gly [49]. Tám chất ức chế Bromelain dạng iso đƣợc
phân lập từ thân dứa cũng thể hiện sự khác biệt so với các cystatin khác vì
không chứa vùng bảo thủ Gln-X-Val-Y-Gly nhƣng lại có sự tƣơng đồng về
mặt cấu trúc với chất ức chế trypsin/chymotrypsin từ hạt đậu tƣơng. Từ thực
tế này ngƣời ta đã cho rằng, rất có thể các chất ức chế protease có chung
nguồn gốc [30].
Nhiều mô hình tƣơng tác giữa cystatin và cysteine proteinase đã đƣợc mô
tả. Nhìn chung có ba vùng tƣơng tác là: gốc Gly gần đầu amino, vùng bảo thủ
trung tâm Gln-Val-Val-Ala-Gly và cấu trúc kẹp tóc bậc 2 gần đầu carboxyl.
Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, liên kết disulfide không tham gia vào tƣơng
tác này [23]. Đối với oryzacystatin, Abe và Arai đã tiến hành nghiên cứu về
gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của
enzyme mà còn giúp protein mới đƣợc tổng hợp cuộn xoắn chính xác và bảo
vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh.
Ở động vật có xƣơng sống, cysteine proteinase liên quan đến hệ thống
phân giải protein của lysosome và giữ vai trò ngoại bào trong một vài quá
trình trao đổi chất [45]. Ở động vật không xƣơng sống nhƣ giun tròn và nhậy,
cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa. Ở động vật chân đốt nhƣ tôm hùm,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
chúng không những giữ vai trò trong tiêu hóa mà còn liên quan đến hệ thần
kinh [41]. Ở côn trùng, cystein proteinase tìm thấy trong cả cơ quan tiêu hoá
và một số mô khác nữa, chứng tỏ chúng giữ nhiều vai trò khác nhau [51].
Ở thực vật, cysteine proteinase đƣợc tìm thấy chủ yếu trong không bào
và có thể tham gia biến đổi protein dự trữ trong suốt quá trình nảy mầm của
hạt, điều đó cung cấp nguồn dinh dƣỡng nitơ hỗ trợ cho sự phát triển của cây
non. Ngoài ra, ngƣời ta còn tìm thấy cysteine proteinase trong môi trƣờng
ngoại bào của cây xung và cây đu đủ [42].
1.2.4.3. Gen cystatin
Gen cystatin ở thực vật mã hóa protein cystatin ức chế hoạt động của
cysteine protease. Trong những năm gần đây, cystatin đƣợc bàn luận nhiều
bởi mối liên quan của nó tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh
nhƣ: nóng, lạnh, mặn, hạn…[39], [54], đặc biệt là tính chống chịu hạn. Khi
gen này hoạt động, sản phẩm tạo thành sẽ tham gia vào việc hạn chế sự phân
giải các chất và do đó bảo vệ các cấu trúc trong tế bào.
Đặc tính tăng sự biểu hiện của các gen cystatin trong điều kiện bất lợi
của môi trƣờng đƣợc phát hiện trên nhiều cây trồng khác nhau và từ nhiều
phần khác nhau của cây. Gen cystatin đƣợc phân lập đầu tiên từ mRNA của
cây lúa, ký hiệu là OC1 có đoạn mã hóa dài 309 nucleotide, mã hóa phân tử
protein dài 102 amino acid [19]. Ở cây đậu xanh, gen cystatin đƣợc Kang và
enzym, hạn chế sự phân giải các chất do đó bảo vệ các cấu trúc trong tế bào.
Diop và đtg (2004) đã phân lập trình tự gen VuCl từ mRNA (cDNA)
mã hóa cystatin từ lá cây đậu cô ve (Vigna unguiculata (L.) Walp.). Các
protein VuCl tái tổ hợp (rVuCl) đƣợc biểu hiện từ cDNA là một chất ức chế
hiệu quả hoạt động của papain. Sự biểu hiện của gen VuCl trong tế bào phản
ứng với tác động của các yếu tố bất lợi phi sinh học (hạn hán, ABA ngoại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
sinh) đƣợc phân tích bởi phƣơng pháp Northern blot và Western blot. Kết quả
cho thấy, trong các mô lá của cây đậu cô ve thuộc hai giống khác nhau về khả
năng chịu hạn, các yếu tố bất lợi phi sinh học đã tạo ra sự tích tụ các
polypeptide VuCl. Sự khác nhau về mật độ tích tụ cystatin tƣơng ứng với mức
độ chịu đựng của cây đậu cô ve [27].
Việc nghiên cứu gen cystatin không những giải quyết mối liên quan của
gen với tính chống chịu hạn mà còn liên quan đến khả năng chống vi sinh vật,
chống côn trùng gây bệnh đối với cây trồng [47], [54].
Copyright: Tài liệu đại học ©