ĐẠI HỌC THÁI
NGUYÊN
TRƢỜNG
ĐẠI HỌC
SƢ
PHẠM
PHẠM TUẤN OANH
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ
PHÂN LẬP GEN CYSTATIN CỦA MỘT SỐ DÕNG LẠC
(Arachis hypogaea L.) CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO
CHỊU MẤT
NƢỚC
VÀ XỬ LÝ CHIẾU XẠ
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên -
2011
ĐẠI HỌC THÁI
NGUYÊN
TRƢỜNG
ĐẠI HỌC
SƢ
PHẠM
PHẠM TUẤN OANH
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ
PHÂN LẬP GEN CYSTATIN CỦA MỘT SỐ DÕNG LẠC
(Arachis hypogaea L.) CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO
CHỊU MẤT
NƢỚC
VÀ XỬ LÝ CHIẾU XẠ
Chuyên ngành: Di truyền
học

Tác giả
Phạm Tuấn Oanh
Trang bìa phụ
MỤC LỤC
Trang
Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt iv
Danh mục các bảng v
Danh mục các hình vi
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. CÂY LẠC
3
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây lạc
3
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của hạt lạc 4
1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam
5
1.2. TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 7
1.2.1. Hạn và tác động của hạn đến thực vật 7
1.2.2. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn
8
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
TRONG CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 10
1.4. MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY
TRỒNG
VÀ CÂY LẠC
12

mầm bằng
phƣơng
pháp gây hạn sinh lý 24
2.2.5.
Phƣơng
pháp sinh học phân tử 25
2.2.6.
Phƣơng
pháp xử lý số liệu 27
Chƣơng
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC VÀ CHẤT LƢỢNG
HẠT CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU 28
3.1.1. Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 28
3.1.2. Chất
lƣợng
hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 31
3.1.3. Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Sáu 35
3.1.4. Nhận xét về đặc điểm nông học, chất
lƣợng
hạt của các dòng lạc nghiên
cứu 37
3.2. KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở GIAI ĐOẠN NẢY MẦM CỦA MỘT SỐ
DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU Ở THẾ HỆ THỨ NĂM TRONG ĐIỀU KIỆN
GÂY HẠN SINH LÝ 40
3.2.1. Hoạt độ của α - amylase trong điều kiện gây hạn sinh lý 40
3.2.2. Hàm
lƣợng đƣờng
trong điều kiện gây hạn sinh lý 42
3.2.3. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
HSP Heat shock protein
IPTG Isopropyl β – D –1 thiogalactopyranoside
ha Hecta
Krad Kilorad Kb
Kilo base
kDa Kilo dalton
LB Luria – Bertani
LEA Late embryogenesis abundant
LTP Lipid transfer protein
MGPT Môi giới phân tử
mRNA Messenger Ribonucleic acid
Nxb Nhà xuất bản
OD Optical density
PCR Polymerase chain reaction
TAE Tris acetate EDTA
TN Thí nghiệm
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản
lƣợng
lạc trên thế giới từ năm 2005 – 2009 5
Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản
lƣợng
lạc ở Việt Nam từ 2005 – 2009 6
Bảng 3.1. Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc ở thế hệ thứ Năm 28
Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất và chất
lƣợng
hạt của các dòng
lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 32

5
.46 và R
5
.44 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố trên
Genbank 56
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Mô hình nghiên cứu tổng quát 22
Hình 2.2. Vector pTZ57R/T 26
Hình 3.1. Khu vực thí nghiệm và một số dòng nghiên cứu ngoài đồng ruộng 33
Hình 3.2. Một số dòng lạc nghiên cứu và giống lạc L18 ở thế hệ thứ Năm 34
Hình 3.3. Hình ảnh quả và hạt của các dòng lạc nghiên cứu và giống L18 ở thế
hệ thứ Sáu 39
Hình 3.4. Hoạt độ của α - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng
phƣơng
pháp
định tính 42
Hình 3.5. Hoạt độ của protease ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng ph
ƣ
ơng pháp định
tính 46
Hình 3.6. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ
thứ Năm và giống gốc L18 49
Hình 3.7. Kết quả nhân gen cystatin ở dòng lạc R
5
.44 và RM
5
.46 50
Hình 3.8. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α 51
Hình 3.9. Kết quả colony – PCR ở dòng lạc R

kinh tế nông nghiệp hiện nay [4].
Ở Việt Nam, lạc đƣợc trồng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc vào Nam, tuy nhiên
diện tích trồng còn khá phân tán, năng suất và chất lƣợng chƣa ổn định. Một
trong những nguyên nhân ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng lạc là do biến
đổi khí hậu toàn cầu đang theo xu
hƣớng
sa mạc hóa, gây hạn hán kéo dài ở nhiều
nơi. Vì vậy, vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu và tuyển chọn đƣợc những giống lạc
có năng suất, chất
lƣợng
tốt và có khả năng chịu hạn, thích hợp với điều kiện khí
hậu và thổ
nhƣỡng
ở
nƣớc
ta [4], [18], [19].
Kỹ thuật chọn dòng biến dị soma
đƣợc
ứng dụng rộng rãi trong chọn tạo các
giống cây trồng có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi
trƣờng. Với nguồn biến dị cao (10
-5
– 10
-8
), đa đạng về kiểu gen và kiểu hình, kỹ
thuật này cho phép tiến hành chọn lọc các dòng tế bào nhanh và hiệu quả hơn so với
các
phƣơng
pháp truyền thống. Ngoài ra, có thể nghiên cứu ảnh h
ƣ

nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và xử lý chiếu xạ”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý thổi khô và
thổi khô kết hợp chiếu xạ ƣu việt về một số đặc điểm nông sinh học và khả năng
chịu hạn ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu.
Xác định
đƣợc
điểm khác biệt về trình tự gen cystatin của dòng lạc có nguồn
gốc từ mô sẹo chịu xử lý thổi khô và thổi khô kết hợp chiếu xạ so với giống gốc ở
thế hệ thứ Năm.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của một số dòng lạc có nguồn gốc từ
mô sẹo chịu xử lý thổi khô và chiếu xạ ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu.
3.2. Đánh giá chất lƣợng hạt của một số dòng lạc nghiên cứu thông qua xác định
hàm
lƣợng
lipid và protein trong hạt tiềm sinh ở thế hệ thứ Năm.
3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng lạc nghiên
cứu trong điều kiện hạn sinh lý ở thế hệ thứ Năm.
3.4. Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen cystatin của dòng lạc chịu hạn tốt
và dòng lạc chịu hạn kém ở thế hệ thứ Năm.
1.1. CÂY LẠC
Chƣơng
1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây lạc
Cây lạc là loại cây thân thảo, thuộc học đậu (Leguminosae), chi Arachis,
phân họ cánh bƣớm phƣợng (Papillionaceae), bộ NST 2n = 40. Chi Arachis có
9 loài. Loài lạc trồng là Arachis hypogaea L. Loài Arachis hypogaea gồm nhiều
kiểu, dạng và biến chủng khác nhau [4].

Về mặt sinh thái, cây lạc chịu ảnh hƣởng của nhiều nhân tố sinh thái: nhiệt
độ, nƣớc, độ ẩm, ánh sáng, đất và các chất khoáng. Nhiệt độ trung bình từ 25 –
30°C thích hợp cho cây lạc sinh
trƣởng,
phát triển và đạt năng suất cao.
Nƣớc
là
yếu tố chính đảm bảo cho sinh tr
ƣ
ởng và phát triển của cây lạc. Nhu cầu về
nƣớc
thay đổi theo từng thời kỳ. Độ ẩm thích hợp cho cây lạc phát triển từ 60 – 70% [4].
Dựa vào thời gian sinh trƣởng, cây lạc đƣợc chia làm hai loại: giống
chín sớm có thời gian sinh
trƣởng
từ 90 – 125 ngày, giống chín muộn có thời gian
sinh trƣởng từ 140 – 160 ngày [4], [18], [19].
Lạc là loại cây trồng có giá trị về nhiều mặt: kinh tế, cải tạo đất, tăng vụ. Hạt
lạc là một trong những loài thực phẩm cung cấp lƣợng dinh dƣỡng cao cho
con ngƣời. Hạt lạc còn là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị, đƣợc sử
dụng làm nguyên liệu trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, phomat. Dầu lạc
đƣợc sử dụng trong y học, kỹ nghệ dầu máy, sản xuất xà phòng. Các sản phẩm phụ
của lạc (khô dầu lạc, thân, lá) đƣợc sử dụng làm thức cho gia súc, phân bón [4].
Việc trồng lạc góp phần cải tạo, bồi dƣỡng đất, chống xói mòn. Ngoài ra, lạc là
nhóm cây ngắn ngày, có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau nên đƣợc sử
dụng làm cây xen canh, gối vụ, làm tăng giá trị kinh tế trên một diện tích đất trồng
[19].
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của hạt lạc
Thành phần hóa sinh hạt phụ thuộc vào giống cây, điều kiện canh tác, khí
hậu, đất đai, dịch bệnh, sâu hại Hạt lạc thƣờng chứa 40,2 – 60,7% lipid; 20,0 –

lƣợng
đứng thứ hai sau đỗ
t
ƣ
ơng và
đƣợc
trồng khắp các châu lục [4].
Cây lạc đƣợc gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nƣớc trên thế giới và là
cây trồng quan trọng đối với các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Á, Châu Phi
và Nam Châu Mỹ [4], [19]. Trên 90% diện tích trồng lạc tập trung ở lục địa Á
phi: châu Á (60%), châu Phi (30%), châu Mỹ (5%), châu Âu (0,22%). Các
nƣớc
sản
xuất lạc lớn nhất gồm: Ấn Độ, Trung Quốc, Xênêgan, Nigiêria và Mỹ [18]. Về năng
suất, Mỹ là
nƣớc
có năng suất trung bình
tƣơng
đối cao, xấp xỉ 2,8 tấn/ ha, sau
đó đến Trung Quốc 2,6 tấn/ha, Argentina 2 tấn/ha. Trong khi đó, ở Châu Phi, năng
suất lạc chỉ đạt 0,7 - 0,8 tấn/ha. Sự khác biệt về năng suất lạc do sự khác biệt về điều
kiện tự nhiên, khả năng đầu
tƣ
và trình độ ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật trong sản
xuất lạc ở các
nƣớc
trên thế giới [19]. Các số liệu về diện tích, năng suất, sản
lƣợng
lạc trên thế giới từ năm 2005 đến 2009
đƣợc

và
đƣợc
chia làm 5 khu vực chính, bao gồm: Đồng bằng sông Hồng, Trung du và
miền núi phía bắc, Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông
Nam Bộ, Đồng bằng sông Cửu Long. Trong đó, khu vực Bắc Trung Bộ và Duyên
hải miền trung có diện tích trồng lạc, năng suất và sản
lƣợng
cao nhất
nƣớc
(năm
2008, diện tích trồng lạc của khu vực này đạt 111,2 nghìn ha, sản lƣợng đạt
204,0 nghìn tấn [54]. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc ở Việt Nam đƣợc cập
nhật trong những năm gần đây, từ năm 2005 đến 2009 đƣợc thể hiện ở bảng 1.2.
Bảng 1.2 cho thấy, diện tích gieo trồng lạc ở Việt Nam năm 2009 đạt 249,2 nghìn ha
(giảm 1,08 lần so với năm 2005), nhƣng năng suất tăng 1,17 lần so với năm 2005
(đạt 2,11 tấn/ha) [53]. Năng suất lạc tăng cao cho thấy Việt Nam đã ứng dụng tốt
các tiến bộ kỹ thuật vào trong sản xuất, lai tạo và tuyển chọn
đƣợc
những giống lạc
cho năng suất cao và phù hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng của Việt Nam
(Trạm Xuyên, Sen Lai, V79, MD7, L02, L05, L14 ) [4], [19].
Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản
lƣợng
lạc ở Việt Nam từ 2005 – 2009
Chỉ tiêu/năm 2005 2006 2007 2008 2009
Diện tích (1000 ha) 269,6 246,7 254,5 255,3 249,2
Năng suất (tấn/ha) 1,81 1,87 2,00 2,08 2,11
Sản
lƣợng
(1000 tấn)

hết là đến sự mất
nƣớc
của tế bào và mô. Sự thiếu
hụt
nƣớc
càng lớn thì ảnh
hƣởng
càng xấu. Thiếu
nƣớc
nhẹ chỉ ảnh
hƣởng
đến quá
trình sinh trƣởng. Thiếu nƣớc nặng hơn gây nên biến đổi hệ keo nguyên sinh
chất theo cùng
hƣớng
với sự già hóa của tế bào, làm cho cây bị héo. Khi bị khô,
nguyên sinh chất bị đứt gẫy cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn
thƣơng
và chết [2].
Hạn ảnh hƣởng đến hai quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây là giai đoạn
cây non và giai đoạn ra hoa, do đó làm giảm năng suất cây trồng [11]. Phản ứng của
cây đối với hạn là sự đóng của khí khổng, giảm tỉ lệ thoát hơi
nƣớc
của mô, giảm
quang hợp và tăng tích lũy ABA, proline, manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm
ascobat, glutathion và sự tổng hợp protein mới [50].
Cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn tƣơng đối ở một thời kỳ sinh trƣởng
nhất định. Thiếu
nƣớc
ở các thời kỳ khác nhau đều ảnh

lớn nhất. Nếu thiếu
nƣớc
trong giai đoạn này làm
giảm số quả chắc, giảm trọng
lƣợng
hạt, dẫn đến giảm năng suất [4], [19].
Đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu
hạn trên một số loại cây trồng: lúa [2], đậu
tƣơng
[8], lạc [1], [10], [16].
1.2.2. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn
Hai cơ chế bảo vệ thực tồn tại trên môi trƣờng thiếu
nƣớc
gồm cơ chế
tránh mất
nƣớc
và cơ chế chịu mất
nƣớc.
Cơ chế tránh mất
nƣớc
phụ thuộc vào khả
năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ và chồi nhằm giảm thiểu tối
đa sự mất
nƣớc
hoặc tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua tích lũy các
chất hòa tan, các protein và axit amin nhằm duy trì
lƣợng nƣớc
tối thiểu trong tế
bào. Cơ chế chịu mất nƣớc liên quan tới những thay đổi sinh hóa trong tế bào
nhằm sinh tổng hợp ra các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt