1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thái Nguyên - 2012
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, khi đời sống xã hội ngày càng nâng cao, chất lƣợng cuộc sống
ngày càng cải thiện, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm trở thành vấn đề đƣợc quan
tâm của các ngành, các cấp và của toàn thể ngƣời tiêu dùng. Thực phẩm phải đảm
bảo tiêu chuẩn: tƣơi, sạch, giàu dinh dƣỡng và an toàn cho ngƣời sử dụng. Trong
đó, thịt tƣơi là một loại thực phẩm thông dụng trong thực đơn hàng ngày của mỗi
gia đình. Tuy nhiên, trong quá trình vận chuyển, tiêu thụ con ngƣời thƣờng chỉ quan
tâm tới lợi nhuận trƣớc mắt mà sẵn sàng bỏ qua các quy chuẩn về vệ sinh an toàn
thực phẩm (VSATTP), do vậy nguồn thực phẩm tƣơi sống nói chung, nguồn thịt nói
riêng bị ô nhiễm ngày càng lớn đe dọa sức khỏe của con ngƣời. Thực phẩm ô nhiễm
do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yếu là các vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ô nhiễm
vi khuẩn Escherichia coli trong thực phẩm đã trở thành đề tài nghiên cứu của nhiều
tác giả trong những năm gần đây. E. coli gây bệnh bằng nhiều yếu tố khác nhau
nhƣ nhiễm trùng huyết, sinh tổng hợp độc tố gây ngộ độc thực phẩm (NĐTP), rối
loạn tiêu hóa hấp thu. Nếu bệnh xảy ra không đƣợc điều trị kịp thời có thể dẫn đến
tử vong. Điều đáng ngại hơn, ngƣời ta lo ngại về nguy cơ biến chủng của loài vi
khuẩn này. Nếu không đƣợc kiểm soát và xử lý kịp thời, có thể gây ngộ độc hàng
+ Nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập
+ Tách chiết DNA tổng số, nhân đoạn gen mã hóa riboxom 16S bằng kỹ
thuật PCR, thiết kế plasmid tái tổ hợp, tạo tế bào E. coli DH 5α khả biến, biến nạp
plasmid vào E. coli DH 5α, tách và tinh sạch plasmid.
+ Đọc trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỊT
1.1.1. Đặc tính chung của thịt
Thịt là loại thực phẩm giàu dinh dƣỡng và dễ tiêu hóa, cung cấp nhiều loại
axit amin không thay thế, cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể, giúp con ngƣời
phát triển tốt về thể lực. Thịt cũng là loại thực phẩm giàu khoáng chất, đặc biệt là
các khoáng chất dễ hấp thu [23]. Thịt tƣơi là thịt chƣa bị biến chất bởi quá trình tự
phân hủy, chƣa có sự thay đổi về cảm quan và độc chất có hại.
1.1.2. Thành phần hóa học của thịt
Thành phần hóa học của thịt rất khác nhau, phụ thuộc vào các yếu tố giống,
loài, lứa tuổi, độ béo gầy và điều kiện chăm sóc, nuôi dƣỡng. Nhƣng nhìn chung
thành phần hóa học của thịt bao gồm:
+ Nƣớc : 50 - 75%
+ Protein : 14 - 21%
+ Lipit : 3,5 - 21,5 %
+ pH của thịt tƣơi thông thƣờng ở mức 6 - 6,5%
Ngoài các thành phần chính ở trên thớ thịt còn có các khoáng chất, các loại
vitamin, các loại men và các chất dinh dƣỡng khác cần thiết cho con ngƣời.
Màu sáng, độ rắn và mùi vị tự nhiên
của thịt tƣơi, không có mùi lạ
Màu tối, độ rắn giảm, có vị
ôi
Gân
Gân trong, bám chặt vào thành ống
xƣơng
Kém trong, độ đàn hồi
kém
Tuỷ
Tuỷ trong, bám chặt vào thành ống
xƣơng
Đục, co lại, không đầy ống
xƣơng
Nƣớc luộc
Trong, mùi vị thơm ngon, trên mặt có
những giọt mỡ to
Đục, mùi vị ôi, trên bề mặt
có giọt mỡ nhỏ
Theo phƣơng pháp sinh hóa học, thịt tƣơi đƣợc đánh giá bằng các phản ứng
sinh hóa học dựa theo các tiêu chuẩn nhƣ bảng 1.2.
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn đánh giá thịt tƣơi bằng các phản ứng sinh hóa học
chuyển màu nâu
Nƣớc thịt ngâm,
lọc không có hoặc
lâu mới có màu
xanh lá mạ
Nƣớc thịt ngâm,
lọc không biến đổi
màu sắc
Phản ứng Nestler tìm
NH
3
Nƣớc thịt ngâm,
lọc không màu
Nƣớc thịt ngâm,
lọc có màu vàng
nhạt
Nƣớc thịt ngâm,
lọc có màu vàng
vỏ chanh
Phản ứng tìm H
2
S
(dùng axetat chì)
Giấy lọc giữ
nguyên màu
Giấy lọc có màu
nâu nhạt
Giấy lọc có màu
nâu sẫm hoặc đen
loại vi khuẩn gây hƣ hỏng theo các nhóm sau [27]:
+ Nhóm vi khuẩn làm mất độ tƣơi của thịt: gồm có các vi khuẩn thuộc họ
Alcaligenes, Chromobacteriaceae các loài vi khuẩn Proteus vulgaris và
Pseudomonas fluorescens.
+ Nhóm làm chua thịt: gồm có các vi khuẩn thuộc họ Chromobacteriaceae, và vi
khuẩn Pseudomonadaceae.
+ Nhóm làm nhớt mặt thịt: vi khuẩn Alcaligenes, Xanthomonas.
+ Nhóm gây mùi khó ngửi ở thịt với điển hình là Pseudomonas.
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Một số vi khuẩn gây hư hỏng thịt bảo quản lạnh.
Nhiều loài vi khuẩn không phát triển ở nhiệt độ thấp, nhƣng vẫn có thể sống
sót trong quá trình bảo quản lạnh. Theo Bell và Gill (1986) [28] đã tìm thấy một số
loài của các giống Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Lactobacillus,
Brochothrix, Alteromonas và thành viên của họ Enterobacteriaceae trong thịt bảo
quản lạnh. Nói chung, các vi khuẩn ở dạng sinh dƣỡng tăng lên trong suốt thời gian
bảo quản lạnh [47].
Một số vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời có thể phát triển trong thịt bảo quản
lạnh với tốc độ chậm. Số lƣợng ban đầu, chủng loại vi khuẩn gây hƣ hại thịt và tốc
độ sinh trƣởng của chúng sẽ quyết định thời gian bảo quản thịt [40]. Tuy nhiên
trong thịt bảo quản lạnh vẫn có các vi sinh vật ƣa lạnh nhƣ: Nhóm Pseudomonas,
Achrmobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Aerobacterium và một số loại cầu
khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas nhƣ Pseudomonas fragi, Pseudomonas
fluoresceus, Pseudomonas geniculata, ngoài ra còn có nấm men, nấm mốc vẫn phát
triển. Thịt có mùi đất là do xạ khuẩn mọc. Thịt muối vẫn tồn tại vi sinh vật ƣa mặn
và làm hỏng thịt [10].
1.2. VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
bệnh hiểm nghèo.
Ngộ độc thực phẩm có thể gây ra do thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật và độc
tố do vi sinh vật tạo ra. Vấn đề NĐTP đang là mối lo ngại và đƣợc quan tâm xử lí ở
hầu hết các quốc gia trên thế giới, thậm chí cả các quốc gia phát triển nhƣ Mỹ (Hoa
Kỳ), Anh, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng không phải là ngoại lệ [1].
1.2.3. Một số vi khuẩn phân lập đƣợc từ thịt gây ngộ độc thực phẩm
Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm không gây bệnh cho ngƣời sử dụng nhƣng
trong quá trình trao đổi chất cũng sản sinh ra yếu tố gây hại [14], [45]. Một số vi
sinh vật nhiễm trong thực phẩm gây ngộ độc, có thể chia làm 2 dạng:
i) Ngộ độc thực phẩm xảy ra ngay lập tức trong các trƣờng hợp thức ăn nhiễm các
vi khuẩn tổng hợp ngoại độc tố nhƣ S. aureus, C. botulinum, B. cereus… Các vi
khuẩn này sinh trƣởng và phát triển trong thức ăn và giải phóng ra một lƣợng độc tố
gây ngộ độc cấp tính cho ngƣời khi ăn thực phẩm bị nhiễm loại vi khuẩn này.
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ii) Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi một số vi khuẩn nhƣ: Listeria, Salmonella, E. coli,
Shigella, Campylobacter nhiễm trong thực phẩm, khi xâm nhập vào cơ thể chúng
không những gây nên các triệu chứng ngộ độc mà còn làm tổn thƣơng nghiêm trọng
các cơ quan nội tạng.
* Tổng số vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện
Sự phát hiện ra số lƣợng lớn vi khuẩn trên thịt, điều này chứng tỏ rằng việc
giết mổ gia súc và gia cầm tại các cơ sở với điều kiện vệ sinh là rất kém. Việc xác
định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm đƣợc sử dụng nhƣ một yếu tố đánh
dấu (maker) về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ bảo quản trong quá trình sản xuất, vận
chuyển thực phẩm. Đây là phƣơng pháp tốt nhất để đánh giá sơ bộ tình trạng vệ
sinh của thực phẩm [29]. Số lƣợng vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện ở thịt thay
đổi theo thời gian và điều kiện bảo quản. Hệ vi khuẩn hiếu khí trên thịt đƣợc chia
làm 3 nhóm, dựa vào nhiệt độ thích hợp để chúng có thể phát triển đƣợc.
Là những trực khuẩn bắt màu gram (-) thuộc họ Enterrobacterriaceae. Hiện nay theo
bảng phân loại Kauffmann-white ngƣời ta phân loại đƣợc hơn 600 type huyết thanh.
Trong đó 86 type huyết thanh đã đƣợc phát hiện ở nƣớc ta. Một số type gây bệnh
cho ngƣời, phổ biến nhất là S. typhimurium, S. enteritidis gây ngộ độc thực phẩm.
Salmonella có sức đề kháng với môi trƣờng cao, chúng tồn tại đƣợc vài
tháng trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật. Vi khuẩn phát triển đƣợc trong
khoảng nhiệt độ từ 5,2 – 45
o
C và pH từ 4,3 -9,6. Khả năng chịu mặn tối đa là 8,0%
muối. Vi khuẩn phát triển đƣợc khi nƣớc hoạt động (a
w
) tối thiểu trong thực phẩm là
0,95 [35].
Bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc do Salmonella có đặc điểm lâm sàng chủ yếu
là hội chứng viêm dạ dày, tiểu tràng cấp đôi khi có cả viêm đại tràng, bao gồm sốt
đau bụng, sốt tiêu chảy kèm theo nôn, dễ mất nƣớc ở trẻ em. Thời gian phát bệnh từ
6-72 giờ phổ biến từ 2- 3 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn.
* E. coli
Là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông di động đƣợc, không
hình thành nha bào, bắt màu gram âm, thƣờng thẫm hai đầu, ở giữa nhạt, kích thƣớc
2-3 µ × 0,4-0,6 µm. E. coli thử nhóm phản ứng sinh hóa IMVIC cho kết quả (++ )
[25].
E. coli có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 7 – 46
o
C, nhiêt độ thích hợp
nhất là 35 - 40
o
C, chúng phát triển tốt trong thực phẩm có nƣớc hoạt động (a
w
) từ
[3]. Đây chính là những nguy cơ tiềm tàng gây ngộ độc thực phẩm. Trong 6 tháng
đầu năm 2011, Cục ATVSTP cho biết: toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộ độc với 1.776
nạn nhân, trong đó có 9 trƣờng hợp tử vong. So với cùng kỳ 2010, số vụ ngộ độc đã
giảm, số tử vong giảm, nhƣng con số vẫn còn đáng lo ngại.
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Trên thế giới
Theo báo cáo gần đây của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hơn 1/3 dân số các
nƣớc phát triển bị ảnh hƣởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm. Đối với
các nƣớc đang phát triển, tình trạng lại càng trầm trọng hơn nhiều, hàng năm gây tử
vong hơn 2,2 triệu ngƣời, trong đó hầu hết là trẻ em. Các vụ ngộ độc thực phẩm có
xu hƣớng ngày càng tăng. Hàng năm, tại Mỹ hiện xảy ra 76 triệu ca NĐTP với
325.000 ngƣời phải nhập viện và 5.000 ngƣời chết vì NĐTP. Trung bình cứ 1.000
dân có 175 ngƣời bị NĐTP và một ca NĐTP tiêu tốn 1.531 đôla Mỹ (US, FDA
2006). Nƣớc Úc có Luật thực phẩm từ năm 1908 nhƣng hiện nay mỗi năm vẫn có
khoảng 4,2 triệu ca bị NĐTP và các bệnh truyền qua thực phẩm, trung bình mỗi
ngày có 11.500 ca mắc bệnh cấp tính do ăn uống gây ra và chi phí cho 1 ca NĐTP
là 1.679 đôla Úc. Ở Anh cứ 1.000 dân có 190 ca bị NĐTP mỗi năm và chi phí cho 1
ca NĐTP là 789 bảng Anh. Ngày 7/4/2006 ở trƣờng học Thiểm Tây, Trung Quốc,
hơn 500 học sinh bị NĐTP. Tại Hàn Quốc, tháng 6/2006 có 3.000 học sinh ở 36
trƣờng học bị ngộ độc thực phẩm [1].
Trong diễn tiến dịch nhiễm khuẩn E. coli ở châu Âu, Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) cho biết, có khoảng 12 nƣớc bị ảnh hƣởng. Nó đã cƣớp đi sinh mạng của 16
ngƣời châu Âu. CHLB Đức đã ghi nhận gần 1.400 trƣờng hợp nhiễm bệnh do vi
khuẩn E. coli gây ra. Nhiều ca nhiễm bệnh cũng đã xảy ra tại Pháp, Thụy Điển, Anh
Quốc, CH Séc, Hà Lan… Tổ chức Y tế Thế giới WHO cũng nhận định, đợt dịch E.
coli đang hoành hành ở châu Âu hiện nay là trận dịch lớn nhất trong những năm gần
đây, so với đợt dịch E. coli bùng phát tại Canada hồi năm 2000 đã làm chết 7
tễ của bệnh. Cho đến nay, E. coli đƣợc chia thành 5 nhóm:
- VTEC (Verotoxigenic E. coli) hoặc STEC (E. coli sản xuất độc tố Shiga)
và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli gây xuất huyết ở ruột.
- EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đƣờng ruột.
- ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột.
- EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E. coli): E. coli kết tập ở ruột.
- EIEC (Enteroinvasive E. coli): E. coli xâm lấn niêm mạc ruột [22], [46].
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.3.3. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn E. coli
- Đặc điểm hình thái
E. coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thƣớc trung bình từ 0,5 x
1 – 3 µm hai đầu tròn, di động bằng tiên mao quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi
xếp thành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có vỏ bao capsule, loại
không có động lực thì không có vỏ bao capsule [5], [26].
Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc:
- Lớp: Gammaproteobacteria
- Bộ: Eubacteriales
- Họ: Enterobacteriaceae
- Giống: Escherichia
- Loài: Escherichia coli
- Đặc điểm cấu trúc
E. coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Năm 1947 Kauffmann đƣa ra
hệ thống phân nhóm huyết thanh (serotype) dựa vào việc xác định kháng nguyên bề
mặt O, H, K.
- Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là
lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn. Khi đun nóng ở
100
thành phần hóa học của chúng và đã có hơn 80 loại kháng nguyên K đƣợc xác
định.
1.3.4. Đặc tính nuôi cấy, đặc điểm sinh hóa
- Đặc tính nuôi cấy:
E. coli là loại hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát
triển từ 35 – 37
o
C, nhƣng có thể phát triển trên 40
o
C, pH thích hợp 6,4 – 7,5
nhƣng pH tối ƣu nhất từ 7,2 – 7,4.
- Trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng (Nutrient agar) tạo khuẩn lạc
tròn ƣớt (dạng S) sau 24 giờ, màu trắng đục hơi lồi, kích thƣớc khoảng 2 – 3 mm,
để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn (dạng R).
- Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β.
- Trên môi trƣờng chẩn đoán chuyên biệt Eozin Methylen Blue tạo khuẩn
lạc có ánh kim tím.
- Trên môi trƣờng Rapid có khuẩn lạc màu tím.
- Trên môi trƣờng MacConkey khuẩn lạc màu hồng đỏ.
- Trên thạch Gelatin không tan chảy.
- Trên môi trƣờng thạch nghiêng Triple Sugar Iron Agar: E. coli tạo
acid/acid màu vàng/vàng.
- Trên môi trƣờng Kliger Iron Agar lên men đƣờng glucose và lactose
(vàng/vàng), sinh gas, không sinh H
2
S.
- Trên môi trƣờng Brilliant Green Agar tạo khuẩn lạc xanh lá mạ.
- Trên môi trƣờng canh dinh dƣỡng sau 4 – 5 giờ E. coli làm đục nhẹ môi
trƣờng, để càng lâu càng đục, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt hay xám, sinh
H
chuyển đến các cơ quan trong cơ thể. Ở đó vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ
hai, phá hủy tế bào, gây viêm và sản sinh độc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá
hủy tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết [6], [11].
- Các yếu tố gây bệnh:
Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám
dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất độc tố. Các
chủng vi khuẩn không có yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh [6].
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.4. PHƢƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI PHÁT HIỆN E. COLI TRONG THỰC PHẨM
1.4.1. Phƣơng pháp PCR (polymerase Chain Reaction)
* Nguyên tắc
Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) là một phƣơng pháp in vitro
để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu khuếch đại,
nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của
enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này [21].
* Môi trường tăng sinh
Do số lƣợng E. coli nhóm STEC, đặc biệt là E. coli gây bệnh hiện diện trong
thực phẩm rất ít. Do vậy, trƣớc khi phân lập cần sử dụng môi trƣờng tăng sinh
pepton đệm có bổ sung kháng sinh cefixime (0,0125 mg/l) và vancomycin (8 mg/l)
để ức chế các vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn sống hoại sinh khác.
* Môi trường phân lập
Môi trƣờng MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey (SMAC), Sorbitol
MacConkey (CT-SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime (0,05 mg/l) và tellurite
(2,5 mg/l) đƣợc sử dụng để phân lập. Khoảng 90% chủng E. coli đều lên men
đƣờng lactose, trên môi trƣờng MAC. E. coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ, trên
môi trƣờng SMAC và CT-SMAC. Chủng E. coli không lên men đƣờng sorbitol nên
cho khuẩn lạc màu trắng. Ngƣợc lại những chủng E. coli lên men sorbitol cho khuẩn
1.4.2. Phƣơng pháp ELISA
* Nguyên tắc
Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate).
Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ
đƣợc giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ đƣợc phát hiện bằng cách
sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme nhƣ horseradish peroxidase hay
alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme
sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng.
Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lƣợng kháng
nguyên.
Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch
tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng
nguyên bao gồm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và polysacharide.
20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kháng thể (antibody) là protein ﻹ - globulin đƣợc sinh ra bởi dòng tế bào
lympho tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên
* Các phương pháp Elisa :
+ ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
+ Sandwich ELISA
+ ELISA cạnh tranh
* Phát hiện E. coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa:
- Phản ứng Elisa gián tiếp:
+ Nguyên liệu:
- Microplate
- Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ,conjugate (chất gắn kết) có gắn enzym
peroxidase, bub
C trong 30 phút.
Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer
Saline) có chứa 0,05% Tween 20, rửa đĩa 5 lần, và đập khô.
- Bƣớc 5. Cơ chất tạo màu: 100 µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15
phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dƣơng tính. Dừng phản ứng
bằng dung dịch 1M H
2
SO
4
, lúc này phản ứng có màu vàng.
- Bƣớc 6. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bƣớc sóng 450 nm.
- Kháng nguyên thu hoạch nhƣ trên, đƣợc đo nồng độ protein và giữ ở nhiệt độ -
20
0
C.
* Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E. coli O157:H7
E. coli O157:H7 có hai loại kháng ngyên có ý nghĩa trong chuẩn đoán là
kháng nguyên O157 và H7. Vì vậy, kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitop của
hai loại kháng nguyên này thƣờng sử dụng để xác định vi khuẩn trong các hệ thống
chuẩn đoán huyết thanh.
Kháng thể đơn dòng đặc hiệu MAB 46 E9-9 nhận biết đặc hiệu kháng
nguyên lông H7 của loài E. coli .
Kháng thể MAB 13C4 nhận biết theo hƣớng nhận biết kháng nguyên độc tố
Stx1 của E. coli O157:H7.
* Ưu nhược điểm của phương pháp Elisa
- Ƣu điểm:
+ Nhanh chóng và thuận tiện .
+ Kháng nguyên của nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể đƣợc phát hiện kể
từ khi bắt giữ kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể.
- Nhƣợc điểm:
hạt nano silica vẫn giữ đƣợc hoạt tính và có khả năng nhận biết và liên kết với vi
khuẩn đích [21].
23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
86 mẫu thịt lợn tƣơi lấy ngẫu nhiên tại các chợ trên địa bàn thành phố Thái
Nguyên trong khoảng thời gian từ 5/2011 đến 5/2012.
2.1.2. Môi trƣờng, nguyên liệu, hóa chất
* Môi trường:
- Môi trƣờng thông dụng (Merck, Đức) đạt tiêu chuẩn Quốc tế (ISO) đƣợc sử
dụng để phân lập và giám định vi khuẩn E. coli. Môi trƣờng chế biến sẵn ở dạng
tổng hợp, khi dùng pha theo công thức hƣớng dẫn.
+ Môi trƣờng thạch Macconkey: Dùng để phân lập vi khuẩn E. coli.
+ Môi trƣờng thạch máu: Thử khả năng dung huyết của vi khuẩn E. coli.
+ Môi trƣờng TSI (Triple Sugar Iron Agar): Dùng để kiểm tra khả năng lên
men đƣờng glucose, lactose, saccharose, sinh khí, sinh H
2
S của vi khuẩn E. coli.
+ Môi trƣờng Nutrient Broth, thuốc thử Kovac’s: Dùng để kiểm tra đặc tính
sinh Indol của vi khuẩn E. coli.
2
, sodium dodecyl sulfate (SDS) (Merck, Đức);
Agarose, cao nấm men, peptone (Biobasic ICN, Mỹ); và một số hóa chất khác đều ở
dạng tinh khiết.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
* Dụng cụ
Dụng cụ
Nƣớc sản xuất
Đĩa petri thủy tinh đƣờng kính 90-100 mm
Việt Nam
Pipet có chia độ loại 1ml, 5 ml, 10 ml
Việt Nam
Bình tam giác thủy tinh dung tích 250 – 500 ml
Đức
Ống nghiệm loại 16 – 10 mm và lớn hơn
Đức
Đèn cồn, que cấy, giá để ống nghiệm
Việt Nam
Kéo, panh, quả bóp, cối chày sứ
Việt Nam
* Thiết bị thí nghiệm
Thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng tại Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái
Nguyên; Phòng CNSH Enzyme, Phòng Các chất chức năng sinh học và Phòng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ gene, Viện Công nghệ sinh học, Viện KH và CN
Việt Nam.
Box cấy vi sinh vật clean bench
Việt Nam
Cân phân tích BL 150S
Sartorius (Đức)
Cân phân tích AB 240
Thụy sỹ
Hệ thống chụp ảnh gel-doc
Pharmacia
Hệ thống điện di ngang
Mupid (Nhật bản)
Lò vi sóng
Samsung (Hàn Quốc)
Máy lắc nuôi cấy
Certomat HK (Đức)
Máy ly tâm lạnh Mikro 22R
Hettich (Đức)
Nồi khử trùng ES-315
Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh -80C, -20C, 4C
Sanyo, Toshiba (Nhật)
Copyright: Tài liệu đại học ©