ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
THÁI THIÊN MINH

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME
TREHALOSE SYNTHASE CHỊU NHIỆT TỪ
VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER
PHÂN LẬP TỪ SUỐI NƯỚC NÓNG Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.ĐỖ MINH SĨ

1

MỞ ĐẦU 2
Các vi sinh vật chịu nhiệt được xếp trong nhóm vi sinh vật cực đoan phân bố
nhiều ở các vùng suối nước nóng, các vùng địa nhiệt, miệng núi lửa Nhiệt độ cực
thuận nhất cho sự hoạt động của các vi sinh vật chịu nhiệt này là từ 50 – 80°C. Một
số vi sinh vật có thể hoạt động ở nhiệt độ 110°C hoặc cao hơn. Những enzyme của
những chủng vi khuẩn này được gọi là nh
ững enzyme chịu nhiệt. Các enzyme chịu
nhiệt này có những đặc tính về cấu trúc, chức năng khác thường cho sự chịu nhiệt
độ cao và hoạt động cực thuận của chúng. Vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn
chịu nhiệt này đồng thời tìm hiểu các enzyme chịu nhiệt của chúng sẽ mở ra một
hướng mới trong việc ứng dụng các enzyme này trong cách lĩnh vực sinh hóa, thực
phẩm và đặc biệt là trong lĩ
nh vực công nghệ sinh học phân tử.

 Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Trehalose synthase.
 Tái tổ hợp đoạn gen này vào chủng E.coli và biểu hiện chủng
E.coli tái tổ hợp. vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày 10
Bảng 2.1. Thành phần gel tách polyacrylamide 12% 36
Bảng 2.2. Thành phần gel gom polyacrylamide 4.5% 37
Bảng 3.1. Bảng tổng hợp các trình tự blast trên NCBI 49

Hình 3.8. Điện di SDS-PAGE các dòng mang plasmid tái tổ hợp 50
Hình 3.9. Kết quả phân tích Western blot 51
Hình 3.10. Kết quả điện di SDS-PAGE plasmid pET-TreS với 2 chất cảm ứng 52
Hình 3.11. Kết quả điên di SDS-PAGE mẫu plasmid tái tổ hợp với các nồng độ
IPTG khác nhau 53

Hình 3.12. Điện di SDS-PAGE thời giam cảm ứng 54
Hình 3.13. Điện di SDS-PAGE vận tốc lắc cảm ứng 55
Hình 3.14. Điện di SDS-PAGE nhiệt độ cảm ứng 56
Hình 3.15. Điện di SDS-PAGE điều kiện cảm ứng tối ưu 57 v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp base pair (cặp base)
cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid
DNA Deoxyribonucleotide acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
LB Luria-Bertani
MCS Multiple coding sequence (vùng tạo dòng)
OD Optical density (mật độ quang)
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamid gel electrophoresis (điện di
trên gel polyacrylamide)
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase)
RE Restriction Enzym (enzym cắt giới hạn)

1.2. TREHALOSE 6
1.2.1. Cấu trúc của Trehalose 6
1.2.2. Bản chất sinh học của trehalose 7
1.2.3. Đặc tính hóa học của trehalose 9
1.2.4. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể vi sinh vật 10
1.2.4.1. Là một nguồn dự trữ năng lượng và carbon 10
1.2.4.2. Là một chất ổn định và bảo vệ của các protein và màng 11
1.2.5. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể con người 12
1.2.5.1. Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon 12
1.2.5.2. Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose 13
1.2.5.3. Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng . 13
1.2.6. Con đường tổng hợp trehalose 14
1.2.7. Ứng dụng của trehalose 17
1.2.8. Sản xuất trehalose 18
1.2.9. Tình hình nghiên cứu enzyme trehalose synthase trên thế giới 19 ii
1.3. KỸ THUẬT TẠO DÒNG 21
1.3.1. Chọn và xử lý vector 21
1.3.2. Xử lý DNA cần tạo dòng 21
1.3.3. Tạo vector tái tổ hợp 21
1.3.4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 22
1.3.4.1. Hóa biến nạp 22
1.3.4.2. Điện biến nạp 22
1.3.5. Chọn lọc dòng tái tổ hợp: 22
Chương 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. VẬT LIỆU 25
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 25
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 25

2.2.12. Ly trích DNA plasmid của E.coli theo phương pháp DNA-spin 35
2.2.13. Kiểm tra sản phẩm tạo dòng 35
2.2.14. Biểu hiện protein tái tổ hợp 36
2.2.15. Điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide ( SDS-PAGE) 36
2.2.15.1 Nguyên tắc 36
2.2.15.2. Cách tiến hành 36
2.2.16.Phân tích protein bằng phương pháp Western blot 38
2.1.16.1. Nguyên tắc 38
2.1.16.2. Cách tiến hành 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ BÀN LUẬN 40
3.1. PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER Từ SUỐI
NƯỚC NÓNG 41

3.2.THU NHẬN GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE TỪ
CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER 42

3.3.TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE VÀO
VECTOR pET- 22b 43

3.3.1. Chèn gen TreS vào pJet1.2 blunt 43
3.3.2. Chèn gen TreS vào pET-22b 44
3.4.BIỂU HIỆN TRÊN E.COLI BL21(DE3) 49 iv
3.4.1.Chọn lọc dòng 49
3.4.2. Kết quả Western blot 51
3.4.3. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu 51
3.4.3.1. Khảo sát chất cảm ứng 52


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan

5
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN CHỊU NHIỆT
1.1.1. Sự phân bố của vi khuẩn chịu nhiệt [33]
Các chủng vi sinh vật chịu nhiệt được định nghĩa là tất cả các loài có khả
năng phát triển ở nhiệt độ trên 55
o
C. Có thể chia làm 3 loại: các loài vi sinh vật chịu
nhiệt trung bình phát triển ở trên 65
o
C, chịu nhiệt độ cao ở trên 75
o
C và chịu nhiệt
cực đoan ở trên 90
o
C.
Những vi sinh vật này, chủ yếu là vi khuẩn và cổ khuẩn, được phân lập ở hầu

các trình tự rRNA 16S ở prokayote và rRNA 18S ở eukaryote đã phân sinh giới ra
làm 3 nhóm chính: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và sinh vật nhân thật
(Eukarya).
Các vi sinh vật chịu nhiệt và chịu nhiệt cực đoan được tìm thấy ở cả 2 nhóm
cổ khuẩn và vi khuẩn. Các vi sinh vật chịu nhiệt cực đoan chiếm vị trí cơ bản nhất
trong cây phát sinh loài. Ở vi khuẩn, chỉ 2 loài
Thermotoga và Aquifex là chịu nhiệt
cực đoan.
1.1.3. Vi khuẩn Meiothermus ruber
Vi khuẩn Meiothermus ruber là vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram âm, không
di động. Vi khuẩn này được phân lập ở hầu hết các suối nước nóng có nhiệt độ từ
40
o
C đến 75
o
C. Vi khuẩn Meiothermus ruber thuộc chi Meiothermus, họ
Thermaceace có chiều dài khoảng 3-6 μm, đường kính từ 0,5-0,8μm. Trình tự DNA
của chủng vi khuẩn này được nhận thấy là có sự tương đồng với chủng vi khuẩn
chịu nhiệt Thermus aquaticus [23].
1.2 . TREHALOSE
1.2.1. Cấu trúc của Trehalose [5]
Năm 1974, quan điểm hiện hành về vai trò của trehalose đã cho rằng
trehalose như là một kho dự trữ glucose, là một nguồn năng lượ
ng hoặc là để tổng
hợp của các thành phần tế bào. Kể từ đó, quan điểm về chức năng khác nhau của
đường khử đơn giản này đã mở rộng rất nhiều, hiện nay trehalose không chỉ đơn
giản là một hợp chất lưu trữ. Chẳng hạn ở một số sinh vật, nó có một vai trò cấu
trúc, hoặc là vận chuyển. Ttrong khi ở một số
sinh vật khác nó liên quan đến việc
truyền tín hiệu hoặc điều khiển, hoặc các chức năng để bảo vệ màng tế bào

cũng như giai đoạn tăng trưởng và tình trạng dinh dưỡng của chúng.
Nhiều loài địa y và tảo cũng chứa đường đôi này, mặc dù ở nồng độ thấp
hơn đáng kể so với trehalose tìm thấy trong nấm men. Trehalose cũng hiện diện
Tổng quan

8
trong nhiều loài thực vật bậc cao như trong hạt hướng dương, thực vật Selaginella
và tảo biển. ).
Trehalose cũng được tìm thấy ở một số loại vi khuẩn khác nhau như các loài
của Streptomyces chẳng hạn Streptomyces hygroscopicus, các loài mycobacteria
khác nhau bao gồm Mycobacterium smegmatis và Mycobacterium tuberculosis và
corynebacteria. Trong mycobacteria và corynebacteria, đường khử này đóng vai trò
như là một thành phần cấu trúc của vách tế bào. Ở vi khuẩn Propionibacterium
freudenreichii ssp, các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, hàm lượng NaCl,
O
2
…cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp trehalose [9]. Đối với vi khuẩn quang hợp
Rhodobacter sphaeroides trehalose được tích lũy như một chất bảo vệ chủ yếu trong
các đáp ứng với sự thay đổi của nồng độ muối [19]. Trehalose cũng có mặt trong
Escherichia coli [15] và một số vi khuẩn khác, chẳng hạn như Rhizobium sp,
Sulfdolobus acidocaldarius, Pimelobacter sp. R48, Arthrobacter sp. Q36. Trong
nhiều những sinh vật này, chức năng của trehalose vẫn chưa được biết rõ ràng. [6]
Trong thế giới động vật, trehalose l
ần đầu tiên được thấy trong côn trùng, nơi
mà nó hiện diện trong huyết tương và trong ấu trùng hay nhộng. Trong côn trùng
trưởng thành, hàm lượng trehalose giảm nhanh chóng trong các hoạt động cần năng
lượng, chẳng hạn như bay cho thấy một vai trò cho đường khử này như một nguồn
năng lượng glucose. Ngoài côn trùng, trehalose cũng đã được tìm thấy trong trứng
của giun tròn Ascaris lumbricoides, trong đó nó có thể chiếm đến 8% trọng lượng
khô, ở giun tròn trưởng thành và ấu trùng giun tròn Porrocae


10
dịch trehalose ở pH 3,5-10 được đun nóng ở 100°C trong 24 giờ, không có sự thoái
hóa của trehalose được quan sát trong mọi trường hợp. Vì là đường không khử nên
trehalose không tham gia phản ứng Maillard với hợp chất amin như amino acid
hoặc protein trong quá trình chế biến và lưu trữ. Và không giống như các đường
đôi khác, bao gồm sucrose, trehalose sẽ không dễ dàng bị thủy phân hóa thành
glucose. Trong các sản phẩm thực phẩm và nước giải khát, sự ổn định cao trehalose
cho phép các đặc tính sản phẩm gốc đượ
c giữ lại ngay cả sau khi xử lý nhiệt và lưu
trữ lâu dài. [31]
Bảng 1.1. Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày [16]

Loại thực phẩm
Hàm lượng đường
Trehalose (%)
Lượng thực phẩm tiêu
thụ mỗi ngày (g/ngày)
Kem 10 16
Nước ép hoa quả và rau 10-20 4.8
Mứt kẹo 7-20 10
Lớp phủ kem trên bánh
ngọt
5 0.1
Thóc, gạo 2 19
Các sản phẩm từ bột mỳ 2 14
Bánh quy, bánh ngọt 5-10 40
Sản phẩm từ cá 10 0.3
Hỗn hợp khác 10-20 1.8


nhưng khi chúng bước vào giai đoạn tăng trưởng với sự gia tăng hàm lượng
trehalose chúng có thể tồn tại trong tình trạng mất nước.
Khi gấu nước (tardigrades) thiếu nước, lượng đường glucose trong cơ th
ể
chúng thay đổi thành trehalose khi chúng vào một trạng thái gọi là cryptobiosis -
một trạng thái mà ở đó chúng xem như đã chết. Tuy nhiên, khi chúng nhận được
nước, chúng sống lại và trở về trạng thái trao đổi chất của chúng. Người ta cũng cho
rằng lý do ấu trùng ngủ chironomid của Polypedilum vanderplanki và Artemia có
thể chịu được mất nước là vì chúng lưu trữ trehalose trong các tế bào của nó. Ngay
cả trong giới thực vật, Selaginella (đôi khi được gọi là thực vậ
t sống lại) như
Selaginella dophylla-lepi và Myrothammus flabellifolius, phát triển ở khu vực sa
Tổng quan

12
mạc, miền núi, có thể bị nứt và khô, nhưng sẽ chuyển sang màu xanh trở lại và phục
hồi sau một cơn mưa vì chức năng của trehalose.
Bảo vệ chống lại nhiệt: Một nghiên cứu invivo và invitro quan trọng cho
thấy trehalose bảo vệ tế bào từ nhiệt bằng cách ổn định các protein ở nhiệt độ
cao. Sử dụng hai loại protein nhạy cảm nhiệt độ khác nhau, các nhà khoa học cho
thấy các enzyme th
ể giữ lại hoạt động được tốt hơn trong quá trình sốc nhiệt trong
các tế bào sản xuất được trehalose. Trong khi đó, nghiên cứu về sự phát triển ở
nhiệt độ cao của vi khuẩn Salmonella enterica đã cho thấy một sự tích lũy ở nồng
độ cao hàm lượng trehalose, cụ thể các tế bào phát triển ở nhiệt độ 45
o
C thì hàm
lượng trehalose tạo ra cao gấp 5 lần so với các tế bào phát triển ở 30
o
C [8].

thấy nếu uống sử dụng thực phẩm có chứa trehalose hàng ngày có thể hữu ích cho
cả hai quá trình chuyển hóa xươ
ng và phòng ngừa chứng loãng xương. [31]
Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già. Cơ chế
thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều có một kết luận
chung là do ba yếu tố sau:
 Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lên men, làm
giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi
 Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường
có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tán vào
tế
bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi.
 Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của
hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tế
bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu. Ngoài canxi,
Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie. Điều này thúc đẩy
quá trình phát triển xươ
ng, tăng cường hàm lượng canxi trong xương.
1.2.5.3. Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong
khoang miệng
Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liên cầu
khuẩn gây nên. Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng của người và động
vật. Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinh dưỡng thích hợp dễ lên
men, phát triển và gây bệnh. Vì thế nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa
hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinh dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có
thể ngăn ngừa được bệnh. Để xét ảnh hưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người
ta đã tiến hành thí nghiệm trên cơ thể chuột. Kết quả cho thấy nhóm chuột thí
Tổng quan

14

cuối chuỗi maltodextrins từ liên kết α1-α4 đến liên kết α1-α1 tạo thành
Tổng quan

15
maltooligosyltrehalose. Tiếp theo, enzyme maltooligosyl trehalose trehalohydrolase
(TreZ), được mã hóa bởi các gen treZ, xúc tác sự thủy phân tạo thành trehalose.
Trong con đường thứ tư, trehalose phosphorylase (TreP), hiện diện ở một số
nấm, xúc tác sự thủy phân thuận nghịch của trehalose với sự hiện diện của
phosphate vô cơ. Việc chuyển một phân tử glucose và một phosphate để tạo ra
glucose-1-phosphate và tạo ra các phân tử glucose khác. Tuy nhiên, không có sự
chắc chắn về sự tham gia của các enzyme TreP trong tổng hợp hoặc thoái hóa của
trehalose, vì các phản ứ
ng sinh tổng hợp chỉ được thể hiện trong ống nghiệm.

Hình 1.4. Sự phân bố các con đường sinh tổng hợp Trehalose trong tự
nhiên [7]
Một con đường sinh tổng hợp mới cho trehalose được tìm thấy trong các cổ
khuẩn chịu nhiệt cực đoan Thermococcus litoralis, và liên quan đến enzyme
trehalose glycosyltransferring synthase (TreT) xúc tác hình thành thuận nghịch của
trehalose từ ADP-glucose và glucose. Nó cũng có thể sử dụng UDP-glucose và
GDP glucose, mặc dù nó ít hiệu quả với các cơ chất khác.
Trehalose được phân hủy bởi enzyme trehalase (TreH) thành hai phân tử
glucose.
Tổng quan

16
Hình 1.5. Các con đường tổng hợp Trehalose [7]
Các trình tự hoàn chỉnh các gen mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp
trehalose được phân tích và đã cho thấy rằng các enzyme này phân bố rộng khắp
trong ba giới của sự sống và nhiều sinh vật có nhiều hơn một con đường để tổng

D Con đường TreP
Glucose 1-
p
hosphate
+
glucose
Trehalose
+
Pi
Trehalose phosphorylase
(TreP)
E Con đường TreT
ADP-Glucose
+
Glucose
Trehalose
+
ADP
Trehalose glycosyltransferring
synthase (TreT)
F
Con đường TreH
Trehalose
D-Glucose
+
D-Glucose
Trehalase( TreH)

Trích đoạn Ứng dụng của trehalose Sản xuất trehalose Điện di phân tách protein trên gel polyacrylamid e( SDS-PAGE) PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER Từ SUỐ Chèn gen TreS vào pET-22b

---