1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN BẢO HƯNG
TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CHITINASE
TỪ NẤM TRICHODERMA CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ SỐ: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC 2
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS NGUYỄN HOÀNG LỘC
Trong suốt quá trình làm việc, ngoài sự nổ lực của bản thân, em đã nhận
được sự giúp đở nhiệt tình của quý thầy cô, anh chị kỹ thuật viên ở Viện Tài
nguyên Môi trường và Công Nghệ Sinh Học, em xin chân thành cảm ơn.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành nhất đến thầy PGS.TS
Nguyễn Hoàng Lộc, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, giúp em
vững tin trên con đường mình đang đi.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân của
mình đã khích lệ, động viên tinh thần cho em trong suốt thời gian học tập và
làm việc.
Trong quá trình làm việc, bước đầu làm quen với chuyên môn có thể mắc
nhiều sai sót, em sẽ cố gắng hoàn thiện mình để ngày một trưởng thành hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Huế, tháng 11 năm 2010
Nguyễn Bảo Hưng
4
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục Lục
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Mở đầu
Chương 1. Tổng quan
1.1. Tổng quan về chitinase
1.1.1. Giới thiệu chitinase
1.1.2. Tình hình nghiên cứu chitinase
2.2.6. Các phương pháp thống kê sinh học
Chương 3. Kết quả và thảo luận
3.1. Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma tiết chitinase ngoại bào mạnh
6
3.2. Xác định hoạt độ chitinase bằng phương pháp quang phổ
3.3. Xác định khối lượng phân tử của enzyme chtinase
3.4. Định danh chủng nấm
3.5. Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase
Chương 4. Kết luận
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 7
Hình 3.4. So sánh trình tự ITS của chủng SH16 với chủng ZJPH0810
Hình 3.5. Phản ứng PCR với cặp mồi C42R và C42F
Hình 3.6. So sánh trình tự các gen chitinase phân lập được và gen ech42.
Dấu
* thể hiện sự giống nhau trong trình tự của các gen.
Hình 3.7. Vector pYES2/NT A có mang gen chi42-SH16
Hình 3.8. Kiểm tra sự hiện diện của gen chi42-SH16 trong nấm men tái tổ
hợp
Hình 3.9. Hoạt tính chitinase tái tổ hợp theo thời gian cảm ứng
Danh mục bảng
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của Trichoderma trên môi
trường cảm ứng
Bảng 3.2.Hoạt độ chitinase của các chủng Trichoderma spp.
9
MỞ ĐẦU
Cây trồng nông nghiệp bao gồm các loại rau và ngũ cốc như: rau ăn lá, ăn
quả, củ, đậu đỗ, lúa, ngô, khoai, sắn… giữ vai trò quan trọng trong bữa ăn
hàng ngày của từng gia đình và là nguồn hàng xuất khẩu có giá trị. Tuy nhiên,
đây là loại cây trồng có những đặc điểm hình thái và sinh trưởng thuận lợi cho
các loại sâu và nấm bệnh sống ký sinh. Sức tàn phá của các loại sâu và nấm
bệnh này nhiều khi rất lớn, gây tổn thất nghiêm trọng về năng suất và chất
lượng của cây trồng [15].
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, vì thế thích hợp cho nhiều loại sâu
khuẩn khác đã được công bố, như nghiên cứu của Boer và cộng sự (2007) về
biểu hiệu gen chit33 và chit42 của Trichoderma harzianum trong E. coli [32],
biểu hiện gen chitinase của Serratia marcescens trong các chủng
Sinorhizobium fredii USDA191 và S. meliloti RCR2011 (Krishnan và cs
1999), biểu hiện gen chitinase của T. aureoviride trong nấm men S. cerevisiae
(Jinzhu và cs 2005)...
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tạo dòng và
biểu hiện gen chitinase từ nấm Trichoderma ” nhằm mục đích sản xuất
enzyme này với hiệu suất cao hơn các sinh vật truyền thống, từ đó áp dụng
vào sản xuất nông nghiệp phòng trừ nấm bệnh trên một số cây trồng kinh tế
như rau, quả hoặc các loại ngũ cốc. 11
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE
1.1.1. Giới thiệu chitinase
Chitinase (poly (1,4-N-acetyl-β-glucosaminide) glucanhydrolase) là
enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase thủy phân liên kết 1,4-N-acetyl-β-
glucosaminide (β-1,4-GlcNAc) của chitin. Chitinase được tạo ra từ nhiều sinh
vật, từ những loài có thành phần cấu trúc là chitin như nấm, côn trùng, giáp
xác, đến những loài không có chitin như vi khuẩn, thực vật... Ở những sinh
vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình
thái và phân chia tế bào. Các sinh vật khác tổng hợp chitinase với các mục
đích khác nhau. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo ra nguồn
carbon. Ở thực vật và động vật chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác
Năm 1991, Henrissat dựa trên sự tương đồng trình tự amino acid ở vùng
xúc tác đã phân loại nhóm protein glycosyl hydrolases thành hơn 50 họ trong
đó chitinase được chia thành hai họ 18 và 19 (gồm những enzyme thuộc EC
3.2.1.14 và EC 3.2.1.52) [35].
Năm 1993, Henrissat và Bairoch phân loại thêm những enzyme từ các loài
Flavobacterium, endo-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.96) vào họ 18.
Những protein này phân cắt liên kết β 1,4-N-GlcNAc thành các manosyl
glycoprotein. Các protein thuộc hai họ 18 và 19 hoàn toàn khác nhau về cơ
chế xúc tác, trình tự amino acid cũng như cấu trúc không gian do đó chúng
được cho là có nguồn gốc tiến hóa khác nhau. Hai họ này chứa cả
endochitinase và exochitinase [36].
Chitinase họ 18 bao gồm những chitinase từ thực vật (Arabidopsis, dưa
leo, cây họ đậu, thuốc lá...), nấm (Aphanocladium, Rhizopus,
Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia,
Streptomyces...), virus và động vật… Các chitinase họ 18 thủy phân các liên
kết GlcNAc-GlcNAc, GlcNAc-GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình
anomeric. Hoạt tính của các chitinase họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [36].
Ở Việt Nam, gần đây chitinase mới được quan tâm nghiên cứu do những
ứng dụng của nó trong việc xử lý môi trường và khả năng ức chế chống lại
nấm bệnh hại cây trồng. Một số công trình đã được công bố như: Nghiên cứu
13
chitinase và β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát
sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật [9]; Khảo sát hoạt tính các
hệ enzyme thủy phân chiết tách từ môi trường nuôi cấy Trichoderma sp. và
thử nghiệm ứng dụng chế biến phân hữu cơ vi sinh [13]. Tuy nhiên, nghiên
cứu về chitinase vẫn còn là vấn đề mới mẻ tại Việt Nam.
1.1.3. Khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật của
chitinase
solani [59]. Hai enzyme CHIT42 và CHIT33 từ nấm T. harzianum là yếu tố
cơ bản trong quá trình đối kháng với các loại nấm khác. Hệ thống gen mã hóa
cho chitinase từ các loài Trichoderma đã được giải mã, tạo dòng và chuyển
vào cây trồng [60].
Theo Jollès và Muzzarelli (1999), các loài nấm mốc như Trichoderma,
Gliocladium... cho hàm lượng chitinase cao. Nấm Trichoderma khi ký sinh
trên nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của thành tế bào nấm
gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme β-1,4-N-acetylglucosaminidase và 4
enzym endochitinase. Robert và Selitrennikoff (1988) cũng đã nghiên cứu
hoạt tính kháng nấm của chitinase thực vật và chitinase vi khuẩn, các tác giả
cho rằng chitinase phân lập từ hạt cây lúa mì, lúa mạch và ngô có hoạt tính
phân cắt nội mạch phân tử cơ chất và ức chế sự kéo dài sợi nấm. Trái lại,
chitinase phân lập từ nấm men Saccharomyces marcescens, S. griseus và vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri có hoạt tính phân cắt cơ chất từ đầu không khử,
không ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm Tetranichus reesei và
Phycomyces blackesleeanus [59]. Tuy nhiên, theo Ordentlich và cs (1988),
khi có sự hiện diện của S. marcescens, bệnh do nấm Sclerotium rolfsii trên hạt
đậu phát triển chậm hơn. Shapira (1991) đã tạo dòng gen chitinase từ S.
15
marcescens và nhận thấy trong điều kiện nhà kính chitinase tạo ra có tác dụng
kìm hãm sự phát triển của bệnh do nấm S. rolfsii gây ra trên cây đậu và nấm
R. solani trên cây bông.
1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM TRICHODERMA
1.2.1. Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma
Khái niệm sử dụng nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây trồng
có từ những năm 1930, người đầu tiên đề xuất vấn đề này là Weinding
(Seiketov, 1982). Tác giả này đã đề nghị dùng nấm Trichoderma để trừ nấm
Rhizoctonia gây bệnh thối cây con mới mọc ở cam quýt. Weinding đã ghi
lớp Hyphomycotes, bộ Hyphales (Moniliales) [14]. Cho đến nay có ít nhất 33
loài Trichoderma đã được tìm thấy.
1.2.2. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma
Trichoderma là một loại nấm đất, chúng phát triển tốt trên các loại đất giàu
dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật. Do đó, Trichoderma có khả năng sử
dụng hỗn hợp carbon và nitrogen làm nguồn dinh dưỡng. Nguồn carbon và
năng lượng Trichoderma sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với
hỗn hợp polysaccharide, amino acid… Đặc biệt acid béo, methanol
methylamine và NH
3
là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi
cấy Trichoderma. Muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp vitamin cũng có ảnh
hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma. Tuy nhiên, muối
sodium chloride làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số loài
Trichoderma. Do vậy, trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma
không được có mặt của loại muối này [9].
Hầu hết các loài Trichoderma phát triển mạnh ở nhiệt độ 24-28
0
C, một số
17
loài phát triển tốt ở 35
0
C, thậm chí ở 40
0
C [11].
Theo Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự (2004), nhiệt độ ảnh hưởng đến lên
men sinh khối của Trichoderma, nhiệt độ thích hợp là 28-34
0
thể ức chế sự phát triển của bệnh do R. solani gây ra trên khoai tây, hiệu quả
ức chế đạt tối đa là 83,4% (Singh và cộng sự, 1995) [13].
Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thiên Trang (2004) [6]
cho thấy các loài T. harzianum, T. minutisporum, T. koningii, T. viride và T.
asperellum phân lập tại một số điểm điều tra của tỉnh Đak Lak đều có tính đối
kháng với nấm bệnh hại cây như Fusarium solani, Fusarium sp1, Fusarium
sp2, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia sp1, Rhizoctonia sp2. Trong đó có T.
harzianum là loài có khả năng đối kháng mạnh nhất đối với một số loài nấm
bệnh.
Đỗ Tấn Dũng (2006) tiến hành khảo sát hiệu lực đối kháng của nấm T. viride
với bệnh héo rũ gốc mốc trắng hại đậu tương và cây lạc trong điều kiện thí
nghiệmnhận thấy nấm T. viride có thể sử dụng để phòng trừ bệnh héo rũ gốc
mốc trắng hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh rất cao, đạt tới 86,5%
(trên cây lạc) và 94,4% (trên cây đậu tương) [3].
Ngoài ra nấm Trichoderma còn có khả năng phòng trừ một số bệnh như T.
harzianum trừ bệnh mốc xám (Botrytis cinera), bệnh gỉ sắt (Puccinia
arachidis), bệnh thối hạch (Sclerotinia sclerotiorum) và bệnh đốm vòng
(Aternaria solani); T. viride phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc đen (A. niger),
bệnh thối đọt mía (Ceratocystis paradoxa) và bệnh héo cây mía (F.
moniliforme). Bên cạnh đó, nấm T. viride còn có tác dụng trong khống chế
sinh học với một số loại tuyến trùng như Meloidogyne và Heterodera. Nấm T.
viride có khả năng hạn chế tuyến trùng trong tự nhiên với cơ chế cạnh tranh
thức ăn và vị trí nơi chúng sinh sống [2].
Tóm lại, những kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà lưới, nhà
kính và ở ngoài đồng ruộng về hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đã
19
cho thấy nhóm nấm Trichoderma rất có triển vọng trong phòng trừ nhiều loại
bệnh hại cây trồng.
trồng, tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt [31].
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP
1.3.1. Giới thiệu chung
Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sự
phát triển các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình
sinh học ở mức độ phân tử. Từ đó cho phép phân lập, phân tích và thao tác
trên các gen theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu biết sâu sắc các
lĩnh vực mới của sinh học như công nghệ sinh học, bào chế các loại thuốc
mới, y học phân tử và liệu pháp gen [8].
Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen
hay kỹ thuật gen…) là tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến
đổi và nghiên cứu các đoạn DNA. Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường
xuyên do mục tiêu của nó là kết hợp DNA từ hai nguồn xa nhau. Ví dụ: các
gen từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gen
người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn [7].
Mục đích việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sản phẩm
đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại. Sự biểu hiện
của các gen trong tế bào vi khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó cần phải thiết
kế các vector biểu hiện thích hợp cho phép gen ngoại lai biểu hiện ở mức độ
cao [49].
Ở Việt Nam, gần đây cũng có một số thành tựu nổi bật nghiên cứu về gen
như Nguyễn Quỳnh Anh và cs (2003) đã thành công trong việc tạo dòng và
21
biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP19 của virus WSSV gây hội chứng đốm
trắng ở tôm sú tại Việt Nam, góp phần trong việc giám sát, phòng ngừa dịch
bệnh do WSSV gây ra [1]. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã biểu hiện
thành công gen protease trung tính (nprC10) của chủng B. subtilis C10 trong
E. coli BL21 (DE3) sử dụng vector biểu hiện pET200/D-TOPO [49].
dòng và biểu hiện gen này trong một đối tượng khác nhằm khai thác tối đa
hiệu suất của gen chitinase đã được nghĩ tới từ lâu. Các vật chủ thường được
các nhà nghiên cứu chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có khả năng
sinh trưởng và phát triển nhanh như E. coli, nấm men (Saccharomyces,
Pichia) [30], [64], [56].
Ping và cs (2008) đã tạo dòng, phân tích trình tự và biểu hiện gen
endochitinase của Trichoderma sp vào E. coli BL21, DNA và cDNA của gen
này sau khi phân tích trình tự có kích thước tương ứng là 1.476 và 1.275 bp,
trình tự cDNA sau đó được tạo dòng vào vector pET-28a+ và chuyển vào E.
coli BL21. Sau đó dòng E. coli mang vector pET biến nạp được phân lập,
nuôi 30
0
C để cảm ứng sinh enzyme. Băng enzyme được phát hiện bằng điện
di SDS-PAGE và phân tích hoạt tính đạt 70,2 U/mg protein. Quá trình tối ưu
sự biểu hiện của enzyme này cho thấy enzyme này hoạt động tốt ở pH 7 và
nhiệt độ 35
0
C, sự có mặt của các ion Mg
2+
, Fe
2+
làm tăng khả năng hoạt động
của enzyme này [56].
Một nghiên cứu khác của Shimosaka và cs (2001) đã tạo dòng và biểu hiện
2 gen chiA và chiB mã hóa cho 2 enzyme chitinase A và B (ChiA và ChiB)
được phân lập từ vi khuẩn Burkholderia gladioli CHB101 vào E. coli, 2
enzyme này có độ dài tương ứng là 343 và 307 amino acid và thuộc 2 họ 18
và 19 của nhóm enzyme thủy phân (glycosyl hydrolases) [61]. Một gen
chitinase dài 1.047 bp đã được phân lập từ hệ gen của Beauveria bassiana
23
Alias và cs (2009) biểu hiện và phân tích tính chất của một endochitinase
được phân lập từ Trichoderma virens UKM-1 trong E. coli BL21 (DE3), gen
này dài 1.690 bp mã hóa cho protein có 430 amino acid có khối lượng 42
kDa. Phân tích sự biểu hiện của enzyme này người ta thấy enzyme này hoạt
động tốt nhất ở pH 6.0 và nhiệt độ 50
0
C, enzyme này bền khi bảo quản trong
phạm vi pH 3.0 đến 6.0 và nhiệt độ 30 đến 60
0
C, ion Mg
2+
và Ca
2+
làm tăng
sự hoạt động của enzyme lên thêm 20% so với bình thường [16].
Một nghiên cứu khác tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ vi khuẩn sống
trong môi trường nước, nhưng ở công trình này Tsujibo và cs (1993) đã phân
lập gen từ vi sinh vật sống ở môi trường biển, gen chitinase của chủng
Alterromonas sp. mã số 0-7 đã được tạo dòng trong E. coli JM109 sử dụng
vector pUC18, ở nghiên cứu này enzyme không tiết trực tiếp ra môi trường
nuôi cấy mà tiết vào chu chất. Đoạn gen mã hóa cho enzyme tái tổ hợp dài
3.394 bp nằm giữa 2 enzyme cắt hạn chế SphI và HindIII, trình tự chỉ giống
33,4% so với chitinase A và 15,3% so với chitinase B của loài Seratia
marcescens [66]. Mã hóa cho protein dài 820 amino acid và có khối lượng
phân tử 87 kDa. Chitinase tái tổ hợp này có tính chất tương tự chitinase của
chủng Alterromonas sp. mã số 0-7.
Trong nông nghiệp, nấm bệnh hại cây là một vấn đề rất được quan tâm vì
nó ảnh hưởng đến cuộc sống của người dân cũng như an ninh lương thực của
quốc gia đó. Vấn đề sử dụng thuốc hóa học để trừ nấm bệnh đã và đang bị
phản đối do nó ảnh hưởng đến môi trường sống và con người (theo FAO,
gel polyacrylamide. Khối lượng phân tử của enzyme tinh sạch là 32 kDa.
Chitinase tái tổ hợp có khả năng thủy phân N-acetylglucosamine. Sự sinh
trưởng của nấm (200 µl dịch nuôi cấy) được xác định bởi độ hấp thụ quang ở
Copyright: Tài liệu đại học ©