ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DƢƠNG LONG DUY

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ
THU NHẬN hIGF-1 (HUMAN INSULIN LIKE
GROWTH FACTOR 1) TÁI TỔ HỢP TỪ E. coli Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2012
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến GS.TS. Trần
Linh Thước, người thầy đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em học tập và hoàn
thành luận văn này.
Em chân thành cảm ơn TS. Đặng Thị Phương Thảo, cô là người đã luôn
động viên, quan tâm giúp đỡ và định hướng cho em trong suốt quá trình nghiên cứu
cũng như trong cuộc sống.
Chân thành cảm ơn chị Phương Hiếu và anh Văn Đức đã dìu dắt em trong

1.1.5.2. Điều trị một số bệnh khác 9
1.1.5.3. Ứng dụng khác của hIGF-1 10
1.1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 trên thế giới và ở Việt Nam 11
1.2. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên Escherichia coli 13
1.3. Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu hiện trong tế bào E.
coli 14
1.4. Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp 17
1.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro 18
PHẦN II: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 21
2.1. Vật liệu 22
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 22
2.1.2. Hóa chất và môi trường 23
2.1.3. Nguyên vật liệu 28
2.2. Phƣơng pháp 30
2.2.1. Thu nhận gene higf-1 từ phIGF1 bằng phản ứng PCR 32
2.2.2. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 34
2.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 37
2.2.4. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3) mang vector pET22b-higf1 40
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mục lục

2.2.5. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 ở E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 .40
2.2.6. Tinh chế thu nhận hIGF-1 44
2.2.7. Kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 thu nhận được 45
PHẦN III: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 43
3.1. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 48
3.1.1. Thu nhận gene higf-1 và chuẩn bị vector pET-22b 49
3.1.2. Tạo dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 50
3.2. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 55
3.3. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 57
3.3.1. Phân tích sự biểu hiện protein hIGF-1 trong tế bào chất

IPTG IsoPropyl-β-D-Thio-Galactoside
hIGF-1 human Insulin-like Growth Factor
IGF1R IGF-1 Receptor
IGFBP Insulin-Like Growth Factor Binding Protein
kDa kilo Dalton
LB Môi trường Luria-Bertani
MCS Multiple Cloning Site
PBST Phosphate Buffered Saline Tween
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribose Nucleic Acid
RNase Enzyme thuỷ giải RNA
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục các bảng và hình
-ii-

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pET-22b 50
Bảng 3.2. Lượng hIGF-1 trong các phân đoạn tinh chế 62
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của hIGF-1 5
Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1 6
Hình 1.3. Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường 12
Hình 1.4. Các phương pháp sắc ký được sử dụng để tinh chế protein 17
Hình 1.5. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro 18
Hình 2.1. Cấu trúc plasmid pET-22b 28
Hình 2.2. Thang chuẩn protein và DNA 29
Hình 2.3. Chương trình PCR 33

yếu ở gan nhờ sự kích thích của hormone tăng trưởng GH (Growth Hormone).
hIGF-1 có vai trò kích thích sự tăng trưởng và phát triển của hầu hết các loại tế bào
trong cơ thể đặc biệt là các tế bào cơ - xương, tế bào gan, tế bào thần kinh, tế bào
da, tế bào tạo máu … Bên cạnh đó hIGF-1 còn giúp cân bằng các chu trình chuyển
hoá protein, lipid, carbohydrate cùng nhiều loại hormone và các hợp chất sinh học
khác. Sự thiếu hụt hIGF-1 ở trẻ gây ra bệnh IGFD (Insulin-like growth factor 1
deficiency). Trẻ bị mắc bệnh IGFD bị lùn hơn so với trẻ bình thường và phát triển
không cân đối trong khi lượng GH bình thường. Nguyên nhân có thể là do đột biến
gene mã hóa cho hIGF-1 hoặc thụ thể của GH không đáp ứng được với GH…Do đó
để đảm bảo cho trẻ thiếu hụt hIGF-1 có khả năng phát triển bình thường thì việc
phục hồi lượng hIGF-1 trong máu về mức bình thường là hết sức cần thiết. Hiện
nay không có phương thuốc chữa trị hiệu quả cho những bệnh nhân mắc bệnh IGFD
ở giai đoạn muộn, cách tốt nhất để chữa trị IGFD là phát hiện sớm bệnh nhân mắc
bệnh và tiêm bổ sung đủ lượng hIGF-1 cần thiết bằng cách sử dụng rhIGF-1. Vào
năm 2005 các sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp gồm Increlex (Tercia) và Iplex (Insmed)
đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực
phẩm, Hoa Kỳ) chấp nhận sử dụng là thuốc để điều trị trẻ bị lùn do thiếu hụt hIGF-
1. Trong những năm qua các cơ quan có chức năng đã cho phép trẻ em có tầm vóc
nhỏ, lùn được điều trị với rhIGF-1 ngày càng tăng lên.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có tác dụng tích cực trong việc
điều trị một số bệnh thần kinh, suy tim, tổn thương do bỏng, bệnh xơ cứng cột bên
teo cơ, đái tháo đường loại 1, 2 và làm giảm lượng mỡ trong cơ thể. hIGF-1 còn
được sử dụng trong công nghệ mỹ phẩm làm đẹp da và sử dụng cho các vận động
viên thể dục thể thao để tăng lượng cơ bắp cũng như tăng cường các quá trình đồng
hóa giúp tăng cường thể lực. Ngoài ra, đang có rất nhiều nghiên cứu đang được tiến
hành để làm rõ hơn vai trò và khả năng ứng dụng của hIGF-1.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu
Trang 2
Tại Việt Nam các sản phẩm hIGF-1 chủ yếu được nhập về từ nước ngoài với

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 4
1.1. Nhân tố tăng trƣởng hIGF-1 (human Insulin-like growth factor 1)
1.1.1. Giới thiệu
Trong quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể từ giai đoạn thai nhi đến
lúc trưởng thành luôn chịu sự chi phối của nhiều loại hormone khác nhau. Trong đó
đóng vai trò quan trọng nhất là nhóm các hormone điều hòa tăng trưởng bao gồm
GHRH, GH, IGF-1,…Các hormone điều hòa tăng trưởng có vai trò quan trọng và
quyết định đối với giai đoạn phát triển từ trẻ nhỏ sang giai đoạn trưởng thành thông
qua việc kích thích thúc đẩy quá trình trao đổi chất, tăng cường các quá trình tổng
hợp đặc biệt là tổng hợp hệ cơ-xương; đồng thời kiểm soát quá trình tăng trưởng ở
một giới hạn nhất định để tạo ra một cơ thể phát triển cân đối hài hòa. Một trong
những nhóm hormone điều hòa tăng trưởng quan trọng đó là nhóm hormone tăng
trưởng insulin-like growth factors (IGFs).
IGFs là họ protein hormone có trình tự amino acid tương đồng với proinsulin
khoảng 50% bao gồm IGF-1 và IGF-2 (hay còn gọi là somatomedin C và
somatomedin A) [9]. Trình tự amino acid của IGF-1 và IGF-2 có độ tương đồng
khoảng 70% và có độ bảo tồn cao giữa các loài [16]. IGFs có vai trò kích thích tăng
sinh hầu hết các loại tế bào, tham gia vào các quá trình trao đổi chất quan trọng của
cơ thể [2, 16-17]. IGF-2 có vai trò kích thích tăng sinh và phát triển cơ thể chủ yếu
ở giai đoạn thai nhi trong khi đó IGF-1 lại có vai trò kích thích thúc đẩy sự tăng
trưởng ở trẻ mới lớn và tham gia vào các quá trình biến dưỡng ở người trưởng thành
[16]. Vì IGF-2 có vai trò chủ yếu trong giai đoạn thai nhi và ít có vai trò quan trọng
trong giai đoạn trưởng thành nên nhiều nghiên cứu chỉ tập trung chủ yếu vào IGF-1.
Cho đến nay, vai trò và chức năng IGF-1 ngày càng được làm sáng tỏ, nhiều nghiên
cứu ứng dụng IGF-1 đã và đang mang lại hiệu quả trong trị liệu và nhiều ứng dụng
quan trọng khác [1, 15].
1.1.2. Đặc điểm gene mã hóa và cấu trúc phân tử protein hIGF-1
Protein hIGF-1 được mã hóa bởi gene dài 90kb, gồm 6 đoạn exon nằm trên
cánh dài của NST số 12 [13]. Gene này được biểu hiện ở nhiều mô trưởng thành,

tồn tại hIGF-1 trong cơ thể đồng thời bất hoạt chức năng của hIGF-1 nhằm ngăn
chặn tác dụng hạ đường huyết không mong muốn [16]. hIGF-1 chỉ hoạt động khi
tồn tại dưới dạng tự do, khi đến cơ quan đích, dưới tác động của một số nhân tố, quá
trình ly giải phức hợp IGFBP-ALS-hIGF-1 xảy ra và phóng thích hIGF-1 để liên
kết với thụ thể IGF1R trên bề mặt tế bào đích và thực hiện chức năng [7, 10]. Giống
như hIGF-1, IGFBPs cũng được tổng hợp phần lớn ở gan và ở một số mô, cơ quan
khác. Trong một số trường hợp nhất định, các IGFBPs còn có khả năng tác động hỗ
trợ hIGF-1 gắn lên thụ thể IGF1R [9].

Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1.
IGF1R là thụ thể của hIGF-1 thuộc họ Tyrosine kinase, có cấu trúc tương
đồng với thụ thể insulin. IGF1R gồm 2 tiểu đơn vị α nằm ngoài tế bào và 2 tiểu đơn
vị β xuyên màng tế bào. IGF1R hoạt động ở dạng dimer hóa tạo thành phức hợp
α2β2 [9, 16]. Khi hIGF-1 gắn vào tiểu phần α sẽ kích hoạt quá trình phosphoryl hóa
gốc tyrosine nằm trên tiểu đơn vị β ở bên trong tế bào. Sự phosphoryl hóa tyrosine
dẫn đến kích hoạt một loạt các con đường truyền tín hiệu tiếp theo bao gồm sự tăng
cường biểu hiện các gene liên quan đến chu trình tế bào như cyclin D1 và D2 làm
cho tế bào bước sang giai đoạn phân bào và tăng sinh; đồng thời kích hoạt các con
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 7
đường tín hiệu AKT/protein kinase B, MAPK làm ngăn chặn quá trình apoptosis
của tế bào; ngoài ra còn hoạt hóa một loạt các quá trình khác nhau tùy thuộc vào
loại tế bào đích tác động như tăng tăng cường biểu hiện các protein liên quan đến
quá trình tạo cơ ở tế bào cơ, kích thích quá trình tạo xương ở các tế bào xương, điều
hòa quá trình tạo cytokine ở các tế bào thuộc hệ miễn dịch,…[17].
Cho đến nay, vai trò của hIGF-1 vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ và nhiều
nghiên cứu đang được tiến hành để làm sáng tỏ thêm. Dựa trên sự hiểu biết và vai
trò của hIGF-1 đối với từng loại tế bào từ đó có thể đưa ra những ứng dụng có ý
nghĩa to lớn trong việc điều trị một số bệnh quan trọng.
1.1.4. Chức năng hIGF-1 trong cơ thể sống

tạo kháng thể trong cơ thể [12, 28]. Bên cạnh đó hIGF-1 còn có vai trò cân bằng
hormone cho cơ thể, sự hiện diện hIGF-1 kiểm soát quá trình sản xuất GH. Tùy vào
nồng độ mà hIGF-1 sẽ cho tín hiệu ức chế hay kích thích tiết GH từ tuyến yên [2].
1.1.5. Các hƣớng ứng dụng hIGF-1
1.1.5.1. Điều trị bệnh IGFD
Bệnh IGFD (insulin-like growth factor 1 deficiency) là tình trạng cơ thể sản
xuất không đủ lượng protein hIGF-1 để đáp ứng nhu cầu cần thiết cho quá trình
tăng trưởng và phát triển của cơ thể. Nếu kết quả kiểm tra nồng độ hIGF-1 < 15μg/l
hoặc nồng độ IGFBP-3 < 400μg/l thì cơ thể đang thiếu protein hIGF-1 và cần phải
được xem xét để điều trị kịp thời [4]. Nguyên nhân thiếu hụt hIGF-1 có thể là do
[7]:
- Những yếu tố có liên quan tới sự suy giảm tín hiệu của thụ thể hormone GH,
từ đó làm giảm sự tổng hợp hIGF-1.
- Thiếu hụt GH nghiêm trọng do suy tuyến yên, hoặc các bệnh liên quan đến
vùng dưới đồi.
- Do đột biến của các nhân tố trong con đường truyền tín hiệu của GH.
- Do gene mã hóa cho GH bị phá hủy hoặc kháng thể trung hòa GH.
- Hoạt động bất thường của thụ thể GH.
- Sự phá hủy hay đột biến trong cấu trúc gene mã hóa hIGF-1 cũng làm thiếu
hụt hIGF-1.
- Tình trạng tuổi tác, dinh dưỡng, các bệnh về gan cũng góp phần ảnh hưởng
đến lượng hIGF-1 trong cơ thể.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 9
Triệu chứng của bệnh IGFD cho thấy cơ thể có biểu hiện tích tụ chất béo dư
thừa, giảm độ vững chắc của xương, giảm quá trình tổng hợp amino acid, mất cân
bằng nội tiết, tăng nguy cơ rối loạn chuyển hóa chất dinh dưỡng, thiếu chất dinh
dưỡng dẫn đến tình trạng chậm tuổi dậy thì, cơ thể lùn bất thường, phát triển không
cân đối. Ngoài ra thiếu hụt hIGF-1 có thể trở nên bị điếc, kém trí tuệ và chậm hiểu
biết [4].

có gene mã hóa cho IGF-1 bị phá hủy cho thấy sự sớm tích lũy protein amyloid beta
(Aβ) trong não. Amyloid beta là một chuỗi liên kết peptide của 36-43 amino acid,
tạo thành màng bao phủ trong mạch máu não làm tổn thương mạch máu não và tế
bào thần kinh. Điều đó nói lên rằng hIGF-1 có thể giảm mức độ tích tụ của protein
amyloid beta trong não và hIGF-1 có nhiều tiềm năng trong chữa bệnh AD [6].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có thể sử dụng trong điều trị bệnh
suy tim. Suy tim là tình trạng cơ tim ngày càng yếu đi và không thể bơm đủ máu để
đi nuôi các cơ quan trong cơ thể, không đưa được máu thiếu oxi về tim nên máu bị
ứ lại gây tình trạng phù nề, mệt mỏi, khó thở. hGF-1 có thể kích thích tăng trưởng
cơ tim bằng cách tăng sự hấp thu amino acid, tổng hợp protein, ngăn ngừa quá trình
apoptosis của tế bào cơ tim. Điều khiển tăng lượng canxi trong tế bào để tăng hoạt
động co bóp cơ tim. Mở rộng mạch máu, tăng lượng oxi và các chất dinh dưỡng đến
từng phần của cơ thể bằng cách kích hoạt làm tăng oxide nitric (NO) [8].
hIGF-1 còn góp phần quan trọng trong quá trình tổng hợp, kích thích tăng sinh
tế bào xương, tế bào cơ, nguyên bào sợi ở da, giúp tăng mật độ tế bào xương làm
xương vững chắc, tăng khả năng phục hồi, mau chóng chữa lành vết thương ở các
vùng da và tăng khối lượng cơ. Vì vậy hIGF-1 được đề xuất cho liệu pháp chữa
bệnh loãng xương, bệnh teo cơ, điều trị các tổn thương ngoài da [6]. Một số nghiên
cứu đã chỉ ra rằng hIGF-1 có vai trò làm chậm quá trình thoái hóa cơ ở bệnh xơ
cứng cột bên theo cơ (ALS) và vai trò của hIGF-1 đối với bệnh này vẫn đang được
tiếp tục nghiên cứu [23].
1.1.5.3. Ứng dụng khác của hIGF-1
Trong thể dục thể thao, các vận động viên trên thế giới thường hay sử dụng
các sản phẩm rhIGF-1 để tăng khối lượng cơ, cải thiện hiệu quả luyện tập. hIGF-1
thúc đẩy sự tăng trưởng cơ bắp, kích thích sự giảm mỡ, giúp thân hình trở nên săn
chắc, thể lực cường tráng, thúc đẩy chữa lành các vết thương. Trong quá trình luyện
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 11
tập đòi hỏi cơ thể phải sử dụng năng lượng, sự hiện diện hIGF-1 làm tăng quá trình
oxy hóa chất béo, glycogen để cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho cơ thể

- Iplex (mecasermin rinfabate) là sản phẩm gồm hIGF-1 tái tổ hợp và IGFBP-
3 tái tổ hợp với tỉ lệ phối trộn 1:1 được sản xuất trên hệ thống E. coli bởi công ty
Insmed (Hoa Kỳ). Sản phẩm kết hợp này giúp tăng thời gian tồn tại hIGF-1 trong
máu sau khi tiêm đồng thời làm giảm tác dụng phụ của hIGF-1. IPLEX được bán
dưới dạng liều tiêm một lần 36mg/0,6ml. Giá bán Iplex trên thị trường Hoa Kỳ là
90 USD/liều [31].
- Hiện nay trên thị trường còn có loại sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp đã được
biến đổi cấu trúc với tên gọi là IGF-1 Long R3. Trình tự hIGF-1 đã được thay thế
glutamine ở vị trí thứ 3 thành arginine đồng thời dung hợp thêm chuỗi 13 amino
acid ở đầu N. Kết quả của sự biến đổi này là phân tử hIGF-1 không thể gắn được
vào các IGFBPs và do đó hoạt tính của hIGF-1 không bị kìm hãm và tăng lên một
cách đáng kể. Sản phẩm này chủ yếu sử dụng cho nghiên cứu mà không được sự
chấp thuận cho việc sử dụng điều trị vì lý do không kiểm soát được tác dụng của
hIGF-1. IGF-1 Long R3 được bán trên thị trường thế giới với giá dao động từ 300-
500 USD/ 1mg [36].
- Ngoài ra còn một loạt các sản phẩm hIGF-1 không sử dụng cho điều trị
nhưng được sử dụng cho nghiên cứu của các hãng hóa chất và công nghệ sinh học
như Sigma, R&D system,… với giá thành khá cao.

Hình 1.3. Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường
Tại Việt Nam, hIGF-1 vẫn chưa được biết đến nhiều và tiềm năng ứng dụng
của hIGF-1 là rất lớn. Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng đã xuất hiện một số
sản phẩm rhIGF-1 dưới dạng thực phẩm chức năng. Sản phẩm kết hợp IGF-1 và
Vigorex dạng dịch phun 30ml/lọ được sản xuất bởi công ty Megalife (Hoa Kỳ) có
giá bán 4.600.000VNĐ tại Việt Nam [35]. Giá thành như vậy còn khá cao so với
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 13
mặt bằng chung thu nhập của người dân Việt Nam. Do đó việc nghiên cứu quy trình
sản xuất lượng lớn hIGF-1 với giá rẻ nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị và nghiên cứu
trong nước là việc hết sức cần thiết.

mục tiêu. Ngoài ra các dẫn xuất BL21 được thiết kế di truyền để có được những đặc
tính mong muốn như chủng đột biến recA giúp tăng cường tính ổn định của plasmid
mục tiêu, chủng đột biến trxB/gor giúp tăng cường khả năng hình thành cầu nối
disulfide (Novagen Origami và AD949), chủng đột biến lacY tạo khả năng biểu
hiện protein ở các mức biểu hiện khác nhau (Novagen Tuner) [26]…. Tùy thuộc
vào hệ thống vector được sử dụng mà từ các chủng chủ này có thể được biến đổi di
truyền để tạo thành nhiều dẫn xuất khác nhau phù hợp với vector được sử dụng.
Chẳng hạn như chủng tế bào E. coli BL21(DE3) là chủng BL21 có mang gene mã
hóa cho T7 RNA polymerase là enzyme phiên mã của T7 promoter. Chủng này
được sử dụng cho các hệ thống vetor biểu hiện gene dưới sự kiểm soát của T7
promoter [5]. Dựa vào đặc điểm gene và cấu trúc protein ngoại lai muốn biểu hiện
và hệ thống vector biểu hiện được sử dụng mà lựa chọn chủng chủ E. coli cho thích
hợp.
Tuy nhiên việc biểu hiện protein tái tổ hợp bằng E. coli cũng gây ra nhiều khó
khăn đối với các protein có nguồn gốc từ eukaryote vì tế bào chủ E. coli không có
quá trình biến đổi sau dịch mã. Protein tái tổ hợp được biểu hiện vượt mức tạo thể
vùi không có hoạt tính. Điều này gây khó khăn cho việc thu hồi, tốn chi phí tái gấp
cuộn sản phẩm và hiệu suất thu hồi thấp [18].
1.3. Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu hiện trong tế bào E.
coli [20-21]
Đã có nhiều chiến lược được sử dụng để làm tăng khả năng tan và có hoạt tính
của protein mục tiêu biểu hiện trong E. coli như biểu hiện ở nhiệt độ thấp, điều kiện
stress, sử dụng hệ thống promoter cho phép biểu hiện ở mức độ vừa phải, đồng biểu
hiện các chaperone phân tử như scPDI, DsbA, GroES/EL… nhằm hỗ trợ quá trình
gấp cuộn đúng của protein mục tiêu. Tuy nhiên các phương pháp này vẫn còn một
số giới hạn như lượng protein có hoạt tính thu được ít, ảnh hưởng đến sức sống của
tế bào chủ, protein tan trong tế bào chất gây khó khăn cho quá trình tinh chế thu
nhận. Do đó, hướng thu nhận protein từ thể vùi vẫn được ưa chuộng do sản lượng
protein mục tiêu thu được cao có thể lên đến 50% lượng protein tổng số của tế bào,
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu

diễn ra trong dung dịch tái gấp cuộn. Cần phải kiểm soát những yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình tái gấp cuộn như:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 16
- Nồng độ protein mục tiêu tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn. Đây là yếu tố
quan trọng cần được xác định dựa vào thực nghiệm đối với từng loại protein. Vì quá
trình tái gấp cuộn thường xảy ra ở nồng độ protein mục tiêu thấp nên cần phải có
thêm những bước cô mẫu để tăng nồng độ protein mục tiêu để phục vụ cho các
bước tinh chế thu nhận tiếp theo.
- Nhiệt độ tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn. Nhìn chung đối với nhiều loại
protein thì nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tái gấp cuộn và làm giảm sự kết tụ
protein mục tiêu bởi vì nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ tái gấp cuộn cũng như làm
giảm tương tác kị nước trong đó khi nhiệt độ cao làm tăng tốc độ kết tụ.
- Đối với tái gấp cuộn các protein có cầu nối disulfide, sự hiện diện của hệ
thống oxy hóa-khử là hết sức cần thiết cho việc tạo thành cầu nối disulfide giữa hai
gốc cysteine. Việc lựa chọn cặp oxy hóa-khử cũng đóng vai trò quyết định. Một
trong những cặp oxy hóa-khử thường được sử dụng phổ biến là GSSG/GSH. Tuy
nhiên trong một số trường hợp, các cặp oxy hóa-khử nhỏ hơn như cystein/cystine
lại cho hiệu quả tốt hơn như trong trường hợp tái gấp cuộn proinsulin.
- Sự kết cụm protein trong quá trình tái gấp cuộn cũng là một vấn đề đáng lưu
ý. Để ngăn chặn sự kết cụm, người ta thường sử dụng các hợp chất hóa học có trọng
lượng phân tử nhỏ. Chất thường được sử dụng phổ biến đó là L-arginine, có giả
thuyết cho rằng L-arginine làm mất ổn định các cấu trúc trung gian của protein mục
tiêu và không ảnh hưởng đến cấu trúc gấp cuộn đúng. Ngoài ra còn có các chất biến
tính như urea, GdnHCl; các chất tẩy như SDS, Triton X-100…; các chất hoạt động
bề mặt như Tween 20 cũng được bổ sung vào dung dịch tái gấp cuộn để hạn chế sự
kết cụm protein.
- pH tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn của từng loại protein. Đối với trường
hợp protein có cầu nối disulfide thì pH kiềm là cần thiết cho quá trình hình thành và
tái sắp xếp cầu nối disulfide. pH dao động cũng làm ảnh hưởng đến hiệu quả tái gấp

hiện nay là sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography-IEC), sắc kí lọc gel
(size exclusion chromatography), sắc kí ái lực (affinity chromatography), sắc kí kị
nước (hydrophobic interaction chromatography), sắc kí đảo pha (reverse phase
chromatography) .
1.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro
Trong việc nghiên cứu các phân tử có hoạt tính sinh học người ta sử dụng
phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro để đánh giá hoạt tính của chúng. Đây là
phương pháp hiệu quả để đo đạc mức độ đáp ứng của dòng tế bào chuyên biệt đối
với phân tử cần thử nghiệm. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên việc sử
dụng dòng tế bào có các receptor đáp ứng hiệu quả với phân tử cần thử nghiệm, từ
đó gây ra chuỗi truyền tín hiệu nội bào, kết quả là một số gene quan trọng được hoạt
hóa dẫn đến các đáp ứng có thể đo đạc được [27].

Hình 1.5. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro [27]
Dựa trên cách thức tác động của phân tử cần thử nghiệm đối với tế bào đích,
thử nghiệm sinh học in vitro được chia thành 4 nhóm bao gồm: thử nghiệm sinh học
đo mức độ tăng sinh hoặc ức chế tăng trưởng của tế bào, thử nghiệm sinh học đánh
giá mức gây độc đối với tế bào, thử nghiệm sinh học đánh giá một chức năng đặc
biệt nào đó của tế bào chẳng hạn kiểm tra tính xâm lấn của tế bào (invasive), và thử
nghiệm sinh học định lượng các sản phẩm được tạo ra bởi tế bào đích dưới tác động
của phân tử được thử nghiệm [27].
Trong phương pháp thử nghiệm sinh học tăng sinh tế bào, lượng phân tử thử
nghiệm hoạt tính được xác định dựa trên khả năng kích thích tăng sinh dòng tế bào
Tế bào Hoạt hóa
receptor
Tín hiệu
nội bào
Gen
biểu hiện Đáp ứng
Tế bào Hoạt hóa