LỜI MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn tồn tại phổ biến trong trong tự nhiên,
được biết tới như tác nhân gây bệnh thực phẩm, có khả năng xâm nhập, sống sót và
nhân lên trong tế bào có hay không có khả năng thực bào. L. monocytogenes gây bệnh
listeriosis trên nhiều đối tượng khác nhau gồm người già, trẻ em, phụ nữ mang thai và
người suy giảm miễn dịch gây hậu quả nghiêm trọng. L. monocytogenes với nhiều loại
độc tố đa dạng, có khả năng nhận biết thụ thể chuyên biệt trên màng, để tiếp cận cũng
như phá vỡ màng tế bào. Protein listeriolysin O (LLO) là loại độc tố có khả năng nhận
diện cholesterol và hình thành cấu trúc lỗ trên màng phospholipid, giúp vi khuẩn thoát
khỏi các bóng không bào vào tế bào tế chất. Nhờ đặc tính này mà LLO được nghiên
cứu ứng dụng cho việc hỗ trợ vận chuyển các tác chất (phân tử thuốc, kháng nguyên-
kháng thể, plasmid DNA, antisense oligonucleotide,…) vào bên trong tế bào mục tiêu.
Tuy nhiên, hiện nay đa phần các nghiên cứu tập trung sử dụng LLO dạng tự nhiên
của L. monocytogenes. Các phân tử dạng tự nhiên có đặc điểm nhạy cảm với pH của
môi trường. Hoạt tính của LLO giảm nhanh ở điều kiệp pH trung tính. Do đó, việc ứng
dụng LLO còn nhiều mặt hạn chế khi phải đối mặt với điều kiện pH môi trường không
đồng nhất trong invivo. Khi sử dụng dạng LLO này đòi hỏi phải có nhiều chất hỗ trợ đi
kèm để bảo vệ chúng không bị ảnh hưởng bởi pH. LLO được ứng dụng nhiều trong hỗ
trợ liposome vận chuyển tác chất. Nhưng khi liposome dung hợp với màng tế bào và bị
thực bào, các enzyme phân hủy trong không bào sẽ phân cắt tác chất trước khi LLO kịp
phá vỡ không bào. Điều này làm giảm hiệu quả tác động của tác chất, cho thấy ứng
dụng đặc điểm hoạt động ở pH acid của LLO còn nhiều hạn chế.
Để khắc phục khó khăn cũng như mở rộng hơn nữa hướng ứng dụng của LLO
trong y học, LLO dạng đột biến điểm thay thế glutamate247 thành Methionine và
Aspartate320 thành lysine (LLO
E247M/D320K
) hoạt động không phụ thuộc pH bước đầu
được nghiên cứu ứng dụng. Nhờ hoạt tính ổn định trong khoảng pH rộng, LLO đột
biến hoạt động tốt trong nhiều điều kiên pH khác nhau bên trong tế bào. Nhờ vậy, LLO
dạng đột biến có khả năng hỗ trợ tốt hơn trong việc giải phóng tác chất và làm đơn
giản hơn cho việc thiết kế cấu trúc liposome.

0
C, nhưng giảm di động đáng kể ở 37
0
C [26].
Đầu những năm 1980, L. monocytogenes được công nhận là vi khuẩn gây bệnh
thực phẩm, đối tượng có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn này cao gồm người già, trẻ em,
người suy giảm miễn dịch và đặc biệt nguy hiểm cho phụ nữ mang thai. Ở trẻ em, L.
monocytogenes là lí do phổ biến thứ 3 gây ra bệnh viêm màng não do vi khuẩn, đứng
sau Escherichia Coli và Streptococcus Agalactiae [35]. Ở người, tỉ lệ nhiễm L.
monocytogenes trong cộng đồng không cao (7/1000000 người), tuy nhiên tỉ lệ tử vong
rất cao (30% số ca bị nhiễm) [31]. L. monocytogenes phát triển ở khoảng nhiệt độ
-0.4
0
C - 50
0
C, có thể tiếp tục nhân chậm ở nhiệt độ thấp, trong thực phẩm bảo quản
lạnh và có khả năng tồn tại trong điều kiện có tính axid hoặc mặn [10][9]. Do vậy, L.
monocytigenes là lí do đe dọa sức khỏe cộng đồng và ảnh hưởng rất lớn tới nền kinh tế.
1.1.2. Quá trình xâm nhiễm nội bào
L. monocytogenes là tác nhân gây bệnh nội bào, có khả năng phát triển và nhân
rộng trong bào tương của tế bào vật chủ. Vi khuẩn có khả năng vượt trội để qua mặt ba
rào cản của cơ thể: hàng rào biểu mô ruột, hàng rào máu não và hàng rào nhau thai. L.
monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào bằng cách phá vỡ các bóng không bào, thoát ra
tế bào chất, nhân lên và xâm nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác. (Hình 1.1)
: Quá trình lây nhiễm của Listeria monocytogenes [28].
L. monocytogenes nhận diện và bám vào tế bào chủ nhờ vào sự tương tác giữa các
protein bề mặt ( InlA và InlB) với thụ thể trên màng sinh chất của tế bào vật chủ. Thụ
thể bám dính của InlA là E-caherin, còn InlB thì liên kết với tyrosine kinase Met, cả
hai tương tác này đều thúc đẩy quá trình “ubiquitin hóa”, huy động protein clathrin tập
trung, mở kênh protiein này, thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào [28]. Với các

Mycobacterium tuberculosis [19]. Nhóm độc tố PFTs được vi khuẩn tiết ra dưới dạng
monomer, nhận biết các receptor chuyên biệt trên màng tế bào chủ để tiếp cận và hình
thành lỗ trên màng. Khi hình thành lỗ, tùy loại độc tố PFTs mà kích thước lỗ to nhỏ
khác nhau, lỗ nhỏ có kích thước 0,5-5 nm, lỗ lớn 20-100 nm . Dựa vào cấu trúc thứ cấp
khi xâm nhập vào màng tế bào chủ, PFTs phân thành 2 dạng chính: β-barrel (α-PFTs)
và α-helical (β-PFTs). Đa số các độc tố vi khuẩn là thuộc nhóm β-PFTs. Các α-PFTs
hình thành lỗ nhờ vào cấu trúc xoắn α. Một ví dụ cho độc tố nhóm α-PFT là Colicin A
(ClyA) (Hình 1.2A, 1.2B). ClyA thuộc nhóm colicin, một kháng sinh do Ecoli tiết ra.
Các gấp β là cấu trúc chủ yếu giúp β-PFTs hình thành lỗ trên màng. Đại diện cho nhóm
β-PFTs là α-hemilysin (Hình 1.2C, 1.2D), độc tố làm tan tế bào hồng cầu, có nguồn
gốc từ Staphylococcus aureus.
: Mô hình cấu trúc của nhóm α-PFTs và β-PFTs [8]. (A) Cấu trúc monomer của
ClyA (α-PFTs), (B) Dạng dodecamerric của ClyA. (C) Cấu trúc monomer của α-
hemolysin (β-PFTs), (D) dạng heptameric của β-PFTs.
1.2.1.2. Β-pore-forming toxins (β-PFTs)
Β-PFTs đến nay là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất của PFTs. Một số đột tố
trong nhóm này gồm có Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), perforin, α-
hemolysin, aerolysin, pseudomonas aeruginosa cytotoxin. Các β-PFTs được tiết ra ở
dạng monomer hòa tan, có cấu trúc tinh thể dạng hình nấm gồm 3 phần: nắp, vành và
domain gốc (Hình 1.2D). Các mũ có đường kính khoảng 100Å, giàu phiến β xếp thành
β-sandwich, cùng với phần vành tạo nên cốt lõi cho protein. Các gốc được xây dựng từ
14 phiến β-barrel của 7 β-hairpins, mỗi β-hairpin hình thành từ một monomer đơn, đặc
trưng bởi các phần phân cực và không phân cực xen kẽ nhau. Vùng giàu aromatic nằm
giữa domain vành và domain gốc hình thành vị trí bám cho α-hemolysin. [25]
1.2.1.3. Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs)
CDCs là một trong những độc tố phổ biến rộng rãi nhất được biết đến, trong đó có
chứa hơn 20 độc tố hình thành lỗ [7]. Các gen độc tố hoặc các sản phẩm của gen đã
được xác định có trong nhiều loài từ năm chi khác nhau của vi khuẩn gram dương. Bao
gồm: Clostridium, Bacillus, Streptococcus, Listeria, và gần đây nhất là
Arcanobacterium [43]. Streptolysin O (SLO), pneumolysin (PLY) và perfringolysin O

LLO.
Phân tử LLO có cấu trúc kéo dài phân thành 4 domain chính (D1-D4) (Hình 1.3).
Các doamain D1, D2 và D3 của LLO gắn kết với nhau, còn domain D4 gần như là một
đơn vị độc lập kết nối với D2 qua một glycine (G417) [13]. Domain D4 tham gia liên
kết với lớp kép phospholipid của tế bào chủ qua 3 vòng kị nước (L1-L3), nằm ở vùng
đáy của D4. Vùng trình tự undecapeptide ở D4 kiểm soát quá trình tái sắp xếp trong D3
cho tới khi độc tố “oligomerization”. Vùng D3 có hai xoắn α chuyển đổi thành hai
phiến β chèn (TMHs) vào màng đôi lipid của tế bào chủ tạo thành oligome với 34-35
tiểu phần [3]. Vùng D1 và D2 cũng có chức năng trong việc hình thành cấu trúc
oligome và cấu trúc xuyên màng.
: Mô hình cấu trúc LLO mô phỏng theo cấu trúc tinh thể của PFO [37]. Các kí hiệu
D1-D4 tương ứng với các vùng domain từ 1 tới 4.
Trong các thành viên của họ CDCs, cặp threonine-leucine (Thr515 / Leu516) nằm
trong L1 là bảo tồn, cặp amino acid này đã được chứng minh là nhân tố bám vào
cholesterol và có vai trò trong hình thành lỗ ở LLO [37]. Leucine 461 cũng đã được
chứng minh là yếu tố điều khiển tốc độ oligomerization của LLO [36].
1.2.3. Chức năng của LLO
Protein LLO là một dạng protein tan được tiết ra bởi L. monocytogenes, giúp vi
khuẩn này trốn thoát khỏi các bóng không bào của tế bào chủ. Chèn các gen nhảy vào
gen hly hay xóa bỏ gen hly khỏi L. monocytogenes, vi khuẩn vẫn bị kẹt trong bóng
không bào, không thể thoát ra và phân chia được. L. monocytogenes không tổng hợp
được LLO là một dạng không có độc lực trong cơ thể, cho thấy sự quan trọng của
protein LLO trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn [29]. Để vi khuẩn thoát ra khỏi
bóng không bào vào tế bào chất, LLO hình thành cấu trúc lỗ trên màng. Cơ chế hình
thành cấu trúc lỗ ở LLO cũng được xác định tương tự như các thành viên khác của họ
CDCs [7]. Cơ chế cụ thể LLO tạo thành lỗ được tham khảo từ cơ chế hình thành lỗ
của PFO (Hình 1.4).
: Cơ chế hình thành lỗ của LLO [7].
Tất cả độc tố trong họ CDCs đều đặc trưng bởi khả năng bám với cholesterol trên
màng tế bào chủ, khởi xướng quá trình chuyển đổi cơ cấu cần thiết cho sự hình thành

lưới nội chất và đảo ngược quá trình phân mảnh của ti thể cũng như thay đổi di truyền
do sự thay đổi sau dịch mã của đuôi histone [33][39][6].
1.3. Protein LLO dạng đột biến
Với tính năng phá vỡ màng trong điều kiện pH thấp, LLO được tập trung nghiên
cứu để ứng dụng vào y học, chủ yếu theo hướng sản xuất vaccine và làm tá chất vận
chuyển thuốc tới tế bào. Xây dựng mô hình protein LLO đột biến nhằm xác định chức
năng của một amino acid, một vùng gen hoặc để tối ưu hóa hoạt tính của LLO trong tế
bào chủ.
1.3.1. Các dạng đột biến của LLO
Vùng N-terminal của LLO giống như chuỗi PEST-like, trình tự PEST do sáu
proline, chuỗi helix xoắn 4 lần, không có liên kết hidro nội phân tử. Sự sắp xếp này
cũng được biết đến như một loại polyproline II helix (PPII), tham gia vào tương tác
giữa các phân tử LLO, trình tự này bảo tồn trong các loài thuộc chi Listeria. Đột biến
trong vùng PPII, gồm mất đoạn PPII (LLO
DPPII
) hay đột biến trong vòng xoắn PPII
(LLO
A40W
, LLO
S44D
, LLO
S44E
) cho thấy hoạt động tán huyết tăng đáng kể (tế bào hồng
cầu với một một lượng lớn cholesterol trên màng, thí nghiệm khả năng phá vỡ tế bào
hồng cầu để xác định mức độ hoạt động của LLO). Ở nghiên cứu này, cũng quan sát
thấy rằng hoạt tính tán huyết tăng đáng kể ở LLO
D394W
. Ngược lại, các đột biến thay thế
K175 bởi glutamate (LLO
K175E

mức Canxi nội bào. Quan sát các đột biến trong vùng PPII (LLO
A40W
, LLO
S44D
,
LLO
S44E
) và đột biến mất đoạn PPII, dòng Ca
2+
vào tế bào tăng rõ rệt kèm theo hiện
tượng tế bào co rút, trong khi đó các thể đột biến LLO
K175E
, LLO
S176W
không gây ra hiện
tượng co rút tế bào và không làm tăng lượng Ca
2+
nội bào. Với LLO
E262W
thì không gây
tăng lượng ca
2+
nội bào nhưng làm tăng nhẹ hoạt động tán huyết. [13]
Giảm hoạt động tán huyết cũng còn do quá trình chuyển đổi oligomerization bị
kìm hãm hay các oligome ban đầu bị ức chế không thể hình thành các trúc tiền lỗ và lỗ.
Kiểm tra trên các đột biến LLO
DPPII
, LLO
A40W
, LLO

L461T
không bị biến tính ở pH 7.4 khi không còn phụ thuộc vào pH nữa. Tuy nhiên,
ở pH 5.5 hoạt động của LLO đột biến cũng tương tự như LLO
WT
; đột biến này làm tăng
đáng kể tỉ lệ tán huyết ở 23
o
C và vẫn bị biến tính ở 37
o
C khi thí nghiệm ở điều kiện pH
7.4. [36]
Nghiên cứu tối ưu hóa hoạt tính tán huyết của LLO trong các điều kiện pH khác
nhau, đột biến vùng đầu dò pH có khả năng thành công cao nhất. Một số nghiên cứu đã
được tiến hành.
1.3.2. Dạng đột biến E247M và D320K
Hoạt động phụ thuộc pH của LLO là do sự biến tính của LLO ở điều kiện pH
không thích hợp. LLO mất hoạt tính do các TMH của domain 3 không gấp cuộn để
hình thành cấu trúc xuyên màng. Sự không gấp cuộn sớm của TMH được điều hòa bởi
bộ ba amino acid trong domain 3. Sự biến tính LLO cũng cần nhiệt độ cao, nhiệt độ
cao kết hợp với pH trung tính kích thích sự biến tính. Bộ ba amino acid Glu247, Asp-
320, và Glu208 nằm cạnh nhau trong domain 3 (Hình 1.5), sự tích điện giữa 3
carboxylate này tạo điều kiện thích hợp làm domain 3 bị mất ổn định ở pH trung tính.
Khi pH càng tăng các carboxylate càng bị khử proton hóa, do đó tăng lực đẩy tĩnh điện
giữa các gốc làm domain 3 rối loạn. Sự rối loạn làm domain 2 và 3 không hình thành
được giao diện liên kết, thêm vào đó sự không gấp cuộn của các bó α-helix trong
domain 3 khiến cho LLO không hình thành được tương tác với màng. [36]
Từ các đột biến điểm riêng lẻ, mức ảnh hưởng của từng amino acid trong vùng
đầu dò pH tới hoạt tính của LLO đã được biết rõ. Đột biến Glu247Met cải thiện đáng
kể tính ổn định của LLO ở pH 7.4, nó giữ lại 32% hoạt tính sau 16 phút, trong khi đó
LLO

nay, để vận chuyển thuốc, các tác chất vào tế bào gặp rất nhiều khó khăn khi phải đối
mặt với hàng rào thực bào của tế bào chủ. Các liposome mang tác chất, bị thực bào bởi
màng tế bào chủ, lúc này liposome bị mắc kẹt trong các bóng không bào. Tại đây,
liposome và các chất kèm theo dần bị phân cắt bởi enzyme của bóng không bào, không
thể thoát ra tế bào chất để thực hiện chức năng theo mong muốn của người dùng.
LLO được đóng gói trong liposome cùng với thuốc, đại phân tử như plamid DNA,
các antisense oligonucleotide, kháng nguyên hòa tan, toxin peptide [17][18][20][38].
Khi vào cơ thể liposome sẽ dung hợp với màng tế bào và bị mắc kẹt trong bóng không
bào, nhạy cảm với pH acid ở không bào liposome giải phóng tác chất vào bóng không
bào. LLO gặp điều kiện pH acid của bóng không bào, hoạt hóa chức năng ly giải màng,
phá vỡ bóng không bào, thuốc và tác chất được phóng thích vào tế bào chất, thực hiện
chức năng đã được quy định.
Nồng độ cao LLO có thể gây độc cho tế bào, do đó lượng LLO cần thiết để phân
phối thuốc càng ít càng tốt, nhưng vẫn đảm bảo hiệu qua phân phối [2]. Đột biến điểm
tại ví trí có nhiều cytein, LLO
C484S
đã được chứng minh là nâng cao hoạt tính, ổn định
hơn LLO
WT
khi vào trong tế bào cùng với liposome, cho phép giảm lượng LLO sử
dụng cho các ứng dụng phân phối thuốc nhờ liposome trong tương lai, giảm thiểu khả
năng gây độc cho tế bào. [44]
Ngoài cách đóng gói LLO vào liposome, LLO còn được sử dụng cho bám dính
quanh liposome, giảm hiệu quả của thuốc. Cách này ứng dụng trong một nghiên cứu
tiếp cận thuốc vào tế bào ung thư vú sử dụng liposome và LLO để hỗ trợ [15].
Các ứng dụng trên đều lợi dụng đặc tính chỉ hoạt động trong điều kiện pH acid
của LLO, để ứng dụng phá vỡ rào cản không bào ngăn cản phân phối thuốc, nhưng
không làm ảnh hưởng tới tế bào. Thể đột biến 2 điểm E247M/D320K hoạt động tốt ở
các pH khác nhau, bước đầu mở ra hướng ứng dụng LLO ở nhiều điều kiện khác nhau
trong tế bào. Do đó, so với dạng tự nhiên, LLO dạng đột biến này có khả năng hỗ trợ

sự thất thoát plasmid, đã cải thiện đáng kể khó khăn. Đồng thời, vector con thoi có thể
được tạo dòng trong E. coli và biểu hiện trong B. subtilis. Để nâng cao hiệu quả sản
xuất protein tái tổ hợp, nhiều chủng B. subtilis bị đột biến bất hoạt protease đã được
thiết kế và đưa vào sử dụng như: WB600, WB700, WB800, WB800N… [21][47][46].
Nhờ các đặc điểm sẵn có và các hạn chế đã được khắc phục nhằm tối ưu chủng, B.
subtilis dần trở thành sinh vật chủ hấp dẫn trong sản xuất protein tái tổ hợp.
1.4.2. Vector biểu hiện
Hệ thống vector pHT là một trong những hệ thống vector plasmad cho phép biểu
hiện trong B. subtilis khá hiệu quả, điển hình là pHT01 (Hình 1.7) và pHT43 (Hình
1.8). Tất cả các vector trong hệ thống pHT đều sử dụng promoter Pgrac (Hình 1.9),
được dung hợp từ promoter PgroES của B. subtilis với lac operator (lacO) của E. coli,
cho phép biểu hiện cảm ứng bằng IPTG ở cả B. subtilis và E. coli. Ngay sau promoter
Pgrac, trình tự Shine-Dalgarno (SD) của gen gsiB và vùng Multi cloning site – MCS
(BamHI, XbaI, AatII, SmaI) được chèn vào để hỗ trợ cho việc tạo dòng và biểu hiện
gen của hệ thống vector plasmid pHT. pHT43 được tạo ra từ pHT01 nhằm hỗ trợ cho
việc tiết protein bằng cách chèn thêm trình tự tín hiệu tiết ssamyQ của α-amylase ngay
sau promoter Pgrac.
: Sơ đồ plasmid pHT01
: Sơ đồ plasmid pHT43
Vector pHT01 được chèn thêm các đuôi dung hợp dùng cho tinh chế như 8xHis-
tag (pHT08), Strep-tag (pHT09) và epitope c-Myc-tag (pHT10).
Pgrac: Pgrac promoter (chứa
groES promoter, lacO operator,
chuỗi gsiB SD).
ColE1: ColE1 origin.
Amp
R
: gen kháng Ampicillin.
LacI: gen lacI (lac repressor).
Cm

- Bộ nguồn (Cleaver)
- Màng lọc 0,2 μm
- Cột Histrap HP 5 ml (GE healthcare)
- Bơm nhu động (GE healthcare)
- Tủ mát 4
ο
C (Lucland Fukusima)
- Tủ lạnh -20°C (Lucland Fukusima)
- Tủ lạnh sâu -80
°
C (Testler)
- Máy phá mẫu (Sonicator)
- Đèn UV
- Lò viba
- Máy heat nhiệt (Benchmark)
- Dụng cụ lên men GX-Fermentor 5L (BIOTRON Inc)
- Các dụng cụ tiêu hao khác: eppendorf, tip, fancol, màng thẩm tích…
2.1.2. Vật liệu sinh học
2.1.2.1. Chủng sinh vật
- Chủng b. subtilis 1012 mang vector pHT387. pHT387 (Hình 2.1) là vector cho
phép biểu hiện protein LLO
E247M/D320K
dung hợp với đuôi LysSN-6xHis-TEVsite
trong B. subtilis. Đuôi LysSN-6xHis-TEVsite chứa 3 vùng trình tự chính gồm:
LysSN là vùng đầu N của protein LysS của B. subtilis, vùng này có tác dụng
tăng cường biểu hiện và ổn định của protein mục tiêu. Đuôi 6xHis giúp tinh chế
và thu nhận protein được thuận lợi. TEVsite là vị trí cắt của TEV protease giúp
loại bỏ đuôi dung hợp khỏi protein mục tiêu. Chủng vi sinh và plasmid được
cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.