ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VŨ VĂN THẮNG
TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN
INTERFERON GAMMA NGƯỜI TRONG HỆ THỐNG
BIỂU HIỆN E. coli Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH
MÃ SỐ: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN HOÀNG CHƯƠNG
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
i
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ iv
LỜI MỞ ĐẦU vi
1.1 Giới thiệu chung về IFN 1
1.1.1 Lịch sử phát hiện 1
1.1.2 Đặc điểm chung 2
1.1.3 Phân loại và nguồn gốc 4
1.2 Interferon gamma (IFN-γ) 6
1.2.1 Cấu trúc protein IFN-γ 6
1.2.2 Sự tạo thành protein IFN-γ 7
1.2.3 Cấu trúc thụ thể và con đường truyền tín hiệu của protein IFN-γ 8
1.2.3.1Cấu trúc thụ thể của IFN-γ 8
1.2.3.2Con đường truyền tín hiệu của protein IFN-γ
10
1.3 Ứng dụng điều trị xơ gan và những tác động của protein IFN-γ 12
1.3.1 Ứng dụng điều trị xơ gan của protein IFN-γ 12
1.3.2 Những tác động của protein IFN-γ trong điều trị bệnh 14

2.3 Dụng cụ và thiết bị 30
2.4 Phương pháp 30
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 30
2.4.2 Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli khả nạp 31
2.4.3 Cắt mở vòng vector pNanogen bởi cặp enzyme NdeI/HindIII 31
2.4.4 Tạo vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ 31
2.4.5 PCR khuẩn lạc 32
2.4.6 Quy trình nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ sinh tổng
hợp protein IFN-γ ở quy mô phòng thí nghiệm 33
2.4.7 Phương pháp điện di SDS-PAGE 34
2.4.8 Phương pháp lai western blot 34
2.4.9 Phương pháp ELISA 35
2.4.10 Thu nhận protein IFN-γ từ tế bào E. coli 36
2.4.11 Tinh sạch protein IFN-γ 37
2.4.12 Sắc ký HPLC 39
2.5 Sơ đồ tóm tắt toàn bộ quy trình thực hiện các thí nghiệm 40
2.5.1 Quy trình tạo dòng E. coli biểu hiện protein IFN-γ 40
2.5.2 Quy trình lên men thu nhận protein IFN-γ 41
2.5.3 Quy trình tinh chế thu nhận protein IFN-γ 42
3.1 Tạo dòng vi khuẩn E. coli biểu hiện protein IFN-γ 43
3.1.1 Thu nhận gen IFN-γ 43
3.1.2 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen IFN-γ 44
3.1.3 Tạo dòng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ biểu hiện protein IFN-γ
46 3.1.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E. coli BL21(DE3) Star/
pNanogenIFN-γ trên môi trường LB 47
3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men biểu hiện protein IFN-γ 48
3.2.1 Khảo sát thời điểm cảm ứng biểu hiện IFN-γ 48
3.2.2 Khảo sát nồng độ IPTG 50
3.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy trong quá trình cảm ứng 51
3.2.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy sau cảm ứng ảnh hưởng đến sự biểu hiện protein

Triphosphate
-
dsRNA
double strand Ribonucleic
Acid
RNA sợi đôi
E. coli Escherichia coli Chủng vi khuẩn E. coli
IFN Interferon -
IFN-γ Interferon-γ -
IFNGR1
IFN Gamma Receptor-α
chain
Thụ thể chuỗi alfa của
IFN-γ
IFNGR2
IFN Gamma Receptor-β
chain
Thụ thể chuỗi beta của
IFN-γ
IFN-α Interferon-α -
IFN-β Interferon-β -
IL- 4, 10, 12 Interleukin 4, 10, 12 -
IPTG
Isopropyl-β-D-
Thiogalactoside
Chất cảm ứng
Jak Janus tyrosin kinase -
Kan Kanamycin Kháng sinh kanamycin
Kan
r

PCR
Polymerase Chain
Reacton
Phản ứng khuếch đại DNA
PKR
Protein kinase dsRNA-
Regulated
Protein điều hòa
P
T7
Promoter T7 -
RNA Ribonucleic Acid -
Rnase Ribonuclease Enzyme phân hủy RNA
rpm round pump minute Tốc độ lắc (vòng/phút)
SDS Sodium Dodecyl Sulfate -
SDS-PAGE
Sodium Dodecyl
Sulfate Polyacrylamide
Gel Electrophoresis
Phương pháp điện di
TEMED
N, N, N, N-
TetramethylEthylenediamine
-
TNF-α
Tumor Necrosis factor alpha
Nhân tố gây hoại tử khối u
v/p vòng/phút
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Sự hình thành IFN 4
Hình 1.2: Mô hình cấu trúc IFN-α ở người
5
Hình 1.3: Mô hình cấu trúc IFN-β ở người
5
Hình 1.4: Mô hình cấu trúc IFN-γ ở người 5
Hình 1.5: Mô hình cấu trúc monomer IFN-γ ở người
7
Hình 1.6: Mô hình cấu trúc dimer của IFN-γ ở người
7
Hình 1.7: Sự hình thành IFN-γ bởi tế bào T/NK
8
Hình 1.8: Cấu tạo thụ thể của protein IFN-γ
10
Hình 1.9: Sự truyền tín hiệu của protein IFN-γ
11
Hình 1.10: Tỉ lệ nhiễm viêm gan siêu vi B trên toàn thế giới
13
Hình 1.11: Những tác động của protein IFN-γ
14
Hình 1.12: Cơ chế kháng virut của protein IFN-γ
16
Hình 1.13: Cơ chế điều hòa âm của hệ thống operon lac

Hình 3.15: Kết quả SDS-PAGE công đoạn cation
58
Hình 3.16: Phổ đồ công đoạn lọc gel lần 2 59
Hình 3.17: Kết quả SDS-PAGE công đoạn lọc gel lần 2
60
Hình 3.18: SDS-PAGE (A) và western blot (B) các giai đoạn tinh chế
60
Hình 3.19:Phổ đồ kiểm tra độ sạch của mẫu tinh chế IFN-γ bằng HPLC
61 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về IFN
1.1.1 Lịch sử phát hiện
Đầu những năm 1920, người ta đã nhận thấy khi các tế bào bị nhiễm virut thì các
tế bào đó và các tế bào lân cận không bị nhiễm tiếp bởi chính các virut ấy và các
virut khác. Năm 1937, Findlay và Mac Callum đã nhận thấy nếu nhiễm virut Rift
vào khỉ, sau đó nhiễm tiếp liều gây chết virut sốt vàng thì khỉ không bị bệnh sốt
vàng. Hai ông gọi hiện tượng này là sự can thiệp (interference) của virut [1].
Năm 1957, Alick Isaac và Jean Lindenman ở Viện nghiên cứu Y học Quốc gia
Luân Đôn đã tiến hành một thí nghiệm quan trọng mang tính lịch sử. Họ nhận
thấy rằng khi nhiễm virut cúm sống vào phôi gà đang phát triển mà trước đó đã
nhiễm virut cúm bất hoạt bằng nhiệt thì virut mới không thể nhân lên được. Nếu
nghiền phôi thành dịch rồi tiêm truyền vào phôi gà khác thì cũng ngăn cản sự nhân
lên của các virut trong phôi gà. Hai ông cho rằng hiện tượng này có liên quan đến
sự tạo thành một chất đặc biệt trong tế bào nhiễm virut và đặt tên cho nó là

khi đó năm 1979, trình tự axit amin đầu của IFN ở tế bào bạch cầu và tế bào sợi ở
người đã được khám phá, và cho thấy có sự tồn tại của phân tử IFN tương đồng
trong chuột. Vào đầu những năm 1980, Committee đã đồng ý với đề xuất về thuật
ngữ IFN-α và IFN-β về một lớp của IFN, cả hai loại đều tồn tại ở trạng thái ban
đầu và xuất hiện sự đồng nhất. Mặc dù IFN cảm ứng miễn dịch không tồn tại ở
trạng thái ban đầu nhưng Committee đã nhận ra thành phần chính của nó rất khác
so với IFN-α và IFN-β, và đặt tên cho nó là IFN-γ, qua đó giải quyết được những
tranh luận về lựa chọn giữa “type II IFN” và “IFN miễn dịch”. Năm 1990, lần đầu
tiên Sydney Peska đã thành công trong việc tạo dòng và sản xuất chế phẩm từ
interferon (được tổ chức FDA của Mỹ cấp giấy chứng nhận) đó là interferon alfa
có khả năng điều trị viêm gan siêu vi B và C [1], [2], [21], [65], [81].
1.1.2 Đặc điểm chung
IFN là một nhóm các protein tự nhiên được tạo ra do các tế bào của hệ miễn dịch
ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virut, vi khuẩn,
kí sinh trùng và tế bào ung thư. Nó chỉ được tổng hợp khi có mặt các chất sinh
IFN (còn gọi là IFNogen). IFN thuộc một lớp glycoprotein được biết đến dưới cái
tên cytokine (chất hoạt hoá tế bào). IFN đóng vai trò quan trọng trong hệ thống
miễn dịch, nó là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại virut và sự phát
triển bất thường của tế bào. IFN là một phần của hệ thống miễn dịch không đặc
hiệu (non-specific immune system) và được kích hoạt trong giai đoạn đầu của quá
trình cảm nhiễm trước khi hệ miễn dịch đặc hiệu (specific immune system) có thời
gian để phản ứng. Cần phân biệt IFN nội sinh được sinh ra trong cơ thể và IFN
ngoại sinh do nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể [18].
IFN có phân tử lượng thấp, khoảng 15 kDa (kiloDaltone) đến 25 kDa, dễ bị phân
giải bởi các enzyme như trypsin, pepsin. IFN khá bền nhiệt, hoạt tính chỉ bị mất
khi đun nóng ở 65-70
o
C trong một giờ hoặc 100
o
C trong 5 phút. Ở 4

ch
ủ
1
T
ế
b
à
o
ch
ủ
1

Hình 1.
1
:
S
ự h
ình thành
IFN

1. Virut xâm nhiễm vào tế bào.
2. Dưới tác động của virut, các nhân tố trong tế bào sẽ di chuyển vào nhân và kích
thích các gen của IFN tạo mRNA.
3. mRNA di chuyển ra khỏi nhân và được dịch mã tạo ra interferon.
4. IFN được tổng hợp sẽ ở lại một phần trong tế bào và phần lớn sẽ di chuyển sang
các tế bào bên cạnh và kích hoạt trạng thái kháng virut ở các tế bào đó.
5. IFN chuyển sang các tế bào bên cạnh sẽ di chuyển vào nhân và kích thích tế bào
tiết ra các protein có khả năng kháng lại virut.
Các tế bào chịu tác động của IFN sẽ ức chế sự tổng hợp RNA hoặc DNA virut. Do
vậy, IFN được sử dụng như chất điều trị không đặc hiệu cho mọi nhiễm trùng

ấu trúc IFN
-
α
ở
Hình 1.
3
:
Mô hình c
ấu trúc IFN
-
β
ở ng
ư
ời

người
Hình 1.4: Mô hình cấu trúc IFN-γ ở người 1.2 Interferon gamma (IFN-γ)
1.2.1 Cấu trúc protein IFN-γ
Protein IFN-γ đã được nghiên cứu rất rộng rãi. Ở người, protein IFN-γ được dịch
mã từ một đoạn mRNA dài khoảng 1,2 kb tạo thành một chuỗi polypeptide chứa
khoảng 166 axit amin (Hình 1.5). Vị trí đầu amio axit ở axit amin thứ 23 tạo thành
cấu trúc kỵ nước đặc biệt, đây là cấu trúc mà khi bị ly giải sẽ tạo thành phân tử
protein IFN-γ hoàn chỉnh với 143 axit amin và có trọng lượng phân tử khoảng 17
kDa. Ở chuột, bản sao mRNA được dịch mã thành chuỗi polypeptide chứa 134

cứu sử dụng protein IFN-γ đột biến và chuỗi polypeptide nhân tạo đã phát hiện ra
vai trò của His 111, axit amin trong liên kết nối xoắn α giữa A và B (AB loop), và
phần còn lại ở đầu C trong vùng bám trung gian giữa IFN-γ và thụ thể của nó [29],
[48], [77].
1.2.2 Sự tạo thành protein IFN-γ
Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer: NK) là nguồn sản sinh IFN-γ chủ yếu, nhất là
ở giai đoạn miễn dịch tự nhiên (miễn dịch bẩm sinh). Không giống như tế bào T
hay B, tế bào NK không sử dụng hệ thống thụ thể của kháng nguyên. Thay vào đó,
chúng sử dụng cả hai cách thức hoạt hóa và kiềm chế các thụ thể để nhận biết các
mục tiêu của chúng. Sự tăng nhanh về số lượng và chức năng cảm ứng của IFN-γ
bị ảnh hưởng bởi sự cân bằng của quá trình truyền tín hiệu thông qua hoạt hóa hay
ức chế tyrosin trên vùng bên trong tế bào của các thụ thể [24], [79].
Sự vắng mặt của phức hợp mô gắn màng (MHC) nhóm I có thể làm tăng sự kích
thích thông qua quá trình hoạt hóa các thụ quan, hoặc làm giảm tín hiệu thông qua
ức chế thụ quan, kết quả là sự biểu hiện chức năng của tế bào NK, bao gồm cả sự
sản xuất IFN-γ. Các cytokine cung cấp hai cơ chế mà qua đó tế bào NK có thể tiết
ra IFN-γ. Trong lúc phản ứng với các sản phẩm nhiễm từ vi sinh vật, các đại thực
bào tiết ra một lượng thấp TNF-α và các tiểu phần p40, p35 của IL-12. Chính
những cytokine này sẽ kích thích tế bào NK/T tiết ra một lượng thấp IFN-γ. IFN-γ
bắt nguồn từ tế bào NK sẽ kích thích lại các đại thực bào và làm tăng hàm lượng
các TNF-α và IL-12, các cytokine này sẽ bắt đầu cho việc tổng hợp IFN-γ với số
lượng lớn bởi tế bào NK. Chính sự tác động kích thích qua lại này đã tạo ra được
một lượng lớn IFN-γ và một lượng lớn các đại thực bào đã được hoạt hóa. Bên
cạnh đó, một lượng IFN-γ cũng tham gia kích thích, hoạt hóa các tế bào T và NK
(Hình 1.7) [6], [33], [75].

Hình 1.7: Sự hình thành IFN-γ bởi tế bào T/NK
Sản phẩm IFN-γ được điều hoà âm bởi IL-4, IL-10. Chức năng chủ yếu của IL-10
là ngăn cản đại thực bào tiết ra TNF-α và IL-12 bởi cơ chế làm giảm quá trình tạo
bản sao của nhân tố Stat3 (nhân tố đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của

có khả năng bị phosphoryl hoá trong quá trình vận chuyển tín hiệu
để cho phép phân tử Stat1 đến được với thụ thể của nó. Phần còn lại
441
DKPH
444
là
những vị trí chịu trách nhiệm cho khả năng gắn đặc hiệu của Stat1 vào IFNGR1
(Hình 1.8) [20], [44], [76].
1.2.3.2 Con đường truyền tín hiệu của IFN-γ
Sự kiện cốt yếu trong truyền tín hiệu ở cả IFN nhóm I và IFN nhóm II là sự dimer
hóa của các thụ thể. Con đường truyền tín hiệu của IFN-γ cần ít nhất 5 protein: 2
tiểu đơn vị của thụ thể, protein tyrosine kinase Jak1 và Jak2, và Stat1.
Trong tế bào không được kích thích, các tiểu đơn vị của thụ thể IFN-γ kết hợp lại
với nhau ở vùng bên trong tế bào tạo thành trạng thái không hoạt động của Jak1 và
Jak2. Jak1 bám vào IFNGR1 cần 4 trình tự axit amin (LPKS), ở vùng gần màng
bên trong tế bào của IFNGR1, trong khi đó Jak2 kết hợp với 12 axit amin
(PPSIPLQIEEYL) bên trong tế bào của IFNGR2. Tín hiệu vận chuyển được bắt
đầu khi phân tử IFN-γ bám vào thụ thể của nó và cảm ứng Jak bởi sự phosphoryl
hóa (Hình 1.8). Các enzyme phosphoryl hóa (kinase) được hoạt hóa, khi đó nó sẽ
phosphoryl hóa lại phần tyrosin ở vùng axit amin YDKPH gần đầu C của chuỗi
IFNGR1, bằng cách đó nó sẽ hình thành nên một vùng trình tự được phosphoryl
hóa trên các thụ thể, đây là điểm nhận diện của vùng SH2 của Stat1. Hai phân tử
Stat1 khi đó sẽ bám vào hai vị trí đã được hoạt hóa trên thụ thể và và chúng sẽ tự
phosphoryl hóa ở vị trí Tyrosin (Y701) gần đầu C của chúng bởi sự kết hợp và
hoạt hóa tyrosin kinase. Hai phân tử protein Stat1 được phosphoryl hóa khi đó sẽ
tách ra từ đơn vị IFNGR1 và hình thành một dimer thông qua sự tương tác lẫn
nhau giữa phosphotyrosine và vùng SH2. Trong quá trình hoạt hóa, phân tử Stat2
cũng được phosphoryl hóa ở phần serine (S727) thông qua cơ chế khác biệt của
kinase từ Jak. Homodimer Stat1 được hoạt hóa sẽ kết hợp với một thụ quan liên
quan tới nhân là NPI-1 (importin-α) qua một tín hiệu với cấu thể mới là vùng giàu

hoại tử. Ở nước ta, xơ gan do virut chiếm một tỷ lệ đáng kể (khoảng 40%). Khi bị
nhiễm virut viêm gan B có thể trở thành viêm gan B mạn tính hoặc người lành
mang virut viêm gan B. Người ta thấy rằng đối với viêm gan B mạn tính thì loại
viêm gan B thể hoạt động là đáng lo ngại nhất bởi vì chúng rất dễ dẫn đến xơ gan.
Tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B mạn tính có tính chất địa lý khác nhau (Hình 1.10).
Khu vực Đông Nam châu Á, trong đó Việt Nam, Trung Quốc, một số nước Trung
Á, Ả rập, khu vực Trung và Nam châu Phi, khu vực Bắc Nam Mỹ, Alaska và Bắc
Canada là những vùng đại dịch nhiễm virut viêm gan B mạn tính, với tỷ lệ người
nhiễm virut mạn tính trên 8% dân số, có khoảng 2 tỷ người trên thế giới đã hoặc
đang nhiễm virut viêm gan B và 350 triệu người mang virut này mãn tính và dẫn
tới xơ gan. Tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B mạn tính tại Việt Nam trên 8% dân số và
một số tỉnh có thể lên đến 15-20%, ước tính hiện nay tại Việt Nam có khoảng 12-
14 triệu người nhiễm virut viêm gan B và dẫn tới xơ gan [85].
Xơ gan sau viêm gan B mạn tính có ảnh hưởng xấu nhất bởi vì có khoảng 75%
bệnh nhân tử vong trong vòng từ 1-5 năm do chảy máu đường tiêu hoá hoặc ung
thư hoá. Xơ gan là một bệnh nặng mà hậu quả xấu nhất là khi xơ gan đã có cổ
chướng (báng nước) hoặc hoàng đản (vàng da). Có khoảng gần 70% bệnh nhân tử
vong trong năm đầu và khoảng 85% sau 2 năm bị xơ gan. Tuy vậy bệnh tiến triển
như thế nào còn tùy thuộc vào chế độ dinh dưỡng, chế độ sinh hoạt, làm việc cũng
như việc phòng tránh các bệnh nhiễm khuẩn khác tốt hay không. Hậu quả của xơ
gan có thể bị chảy máu tiêu hoá, điển hình là vỡ tĩnh mạch thực quản gây chảy
máu ồ ạt đưa đến tình trạng sốc do trụy tim mạch rất khó cứu chữa. Hầu hết các
trường hợp khác có thể hôn mê dẫn đến tử vong hoặc bị ung thư hoá [35], [36],
[68], [72], [84].

Hình 1.10: Tỉ lệ nhiễm viêm gan siêu vi B trên toàn thế giới

Phương pháp điều trị xơ gan bằng IFN-γ
Hiện nay trên thế giới cũng như tại Việt Nam chưa có thuốc điều trị đặc hiệu đối
với xơ gan. Việc điều trị chủ yếu là nhằm vào việc loại bỏ hay kìm hãm các tác

h
ó
a
Tăng
ho
ạ
t
t
í
nh
t
ế
b
à
o
NK
T
á
c
đ
ộ
ng
t
ớ
i
MHC
nh
ó
m
I

Kh
á
ng
virut
Gây
appoptosis

Hình 1.11: Những tác động của protein IFN-γ
Tác động đến sự trình diện kháng nguyên bởi MHC nhóm I
IFN-γ làm tăng số lượng và độ đa dạng của các đoạn polypeptide được trình diện
trên MHC nhóm I. Sự tăng cường trình diện MHC I bởi IFN-γ đóng vai trò quan
trọng trong đáp ứng của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh nội bào, vì nó làm
tăng khả năng nhận diện của tế bào T độc với các chuỗi polypeptide lạ, do đó thúc
đẩy sự cảm ứng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. IFN-γ kích thích cảm
ứng sự thay thế các tiểu phần của proteasome bằng các tiểu phần
immunoproteasome tạo thành các loại proteasome mới và cắt các đoạn
polypeptide lạ, từ đó làm tăng số lượng các chuỗi polypeptide được trình diện và
làm tăng khả năng phân giải các chuỗi polypeptide lạ. Ngoài việc tăng về số lượng
các chuỗi polypeptide được cắt thì immunoproteasome còn góp phần tạo ra các
đoạn polypeptide có khả năng liên kết với MHC tốt hơn, giúp cho việc trình diện
kháng nguyên hiệu quả hơn. IFN-γ còn cảm ứng sự biểu hiện của protein hoạt hóa
proteasome như PA28, protein vận chuyển TAP vận chuyển các đoạn polypeptide
từ tế bào chất vào lưới nội chất [7], [15], [30], [31], [32], [63].
Tác động đến sự trình diện kháng nguyên bởi MHC nhóm II
IFN-γ cảm ứng làm tăng sự biểu hiện của các tiểu phần trong phức hợp MHC
nhóm II, qua đó tăng khả năng trình diện các đoạn polypeptide lạ cho các tế bào T-
CD4. IFN-γ cũng cảm ứng sự biểu hiện chuỗi Ii, là chaperon có vai trò trong sự
trình diện kháng nguyên của MHC II. DM, một protein có chức năng loại bỏ các
đoạn CLIP (là phần còn lại của chuỗi Ii trong endosome, có chức năng che vùng