Bộ giáo dục và đào tạo bộ quốc phòng

Học viện quân y
NGUYễN THị VÂN QUỳNH
NGUYễN THị VÂN QUỳ
NGUYễN THị VÂN QUỳNH
NGUYễN THị VÂN QUỳNH
NGUYễN THị VÂN QUỳNH Lê thanh sơn

A. Nghiên cứu áp dụng nội soi ổ bụng trong
B.
xác định
tổn thơng giảI phẫu bệnh và khả năng phẫu thuật ung
th 1/3 dới dạ dày giai đoạn tiến triển


TRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệM
TRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệMTRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệM
TRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệM
luận án tiến sĩ y học
Hà nội - 2015

B GIO DC V O TO B QUC PHềNG

HC VIN QUN Y
Hà nội - 2015
Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Gíao s, Tiến sĩ khoa
học Nguyễn Thu Vân
Nguyễn Thu Vân Nguyễn Thu Vân
Nguyễn Thu Vân
Chủ tịch Hội đồng khoa học, Công ty Vắc xin và Sinh
phẩm số 1; Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt
Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt
Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt
Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 là những ngời thầy hớng dẫn, luôn tận tình chỉ bảo và trực tiếp sát cánh cùng
tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm
Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm
Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm

Chăn nuôi động Chăn nuôi động
Chăn nuôi động vật thí nghiệm
vật thí nghiệm vật thí nghiệm
vật thí nghiệm
Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 đã nhiệt
tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành bản luận án
này.
Tôi xin cảm ơn Phòng Thí nghiệm viêm gan vi rút, Trung tâm Dự phòng
và kiểm soát bệnh (CDC) đã giúp đỡ chúng tôi trong việc giải trình tự gen vi rút
viêm gan A -HM175 hệ chủng gốc giống.
Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp đã đóng góp công sức cũng
nh động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin dành tình cảm sâu nặng nhất cảm ơn gia đình, nguồn
động lực, luôn cổ vũ, động viên và chia sẻ, giúp tôi hoàn thành tốt quá trình học
tập, công tác và nghiên cứu.

Nguyễn Thị Vân Quỳnh
Nguyễn Thị Vân QuỳnhNguyễn Thị Vân Quỳnh
Nguyễn Thị Vân Quỳnh

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các biểu đồ

ĐẶT VẤN ĐỀ
1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
3

1.1. Những hiểu biết hiện nay về vi rút viêm gan A
3

1.1.1. Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A 3

1.1.2. Đặc điểm sinh bệnh học, dịch tễ viêm gan vi rút A 10

1.1.3. Các biện pháp dự phòng 12

2.1. Vật liệu
33

2.1.1. Chủng vi rút 33

2.1.2. Các dòng tế bào 33

2.1.3. Vắc xin viêm gan A mẫu chuNn Quốc gia 34

2.1.4. Động vật thí nghiệm 34

2.1.5. Môi trường, hóa chất, sinh phNm 34

2.1.6. Dụng cụ, trang thiết bị 35

2.2. Phương pháp nghiên cứu
36

2.2.1. Thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5 37

2.2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A
bất hoạt trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm

44

2.2.3. Phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A trên nuôi
cấy tế bào MRC5 trong quá trình sản xuất và vắc xin thành phNm

48


3.3.1. Kết quả kiểm tra trong quá trình sản xuất 73

3.3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng vắc xin thành phNm 77

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

82

4.1. Thích ứng chủng
4.1.1. Ưu điểm của tế bào MRC5 trong sản xuất vắc xin
83

83

4.1.2. Nguồn gốc và chất lượng tế bào MRC5 sử dụng để thích ứng
chủng và sản xuất vắc xin.

85

4.1.3. Chủng vi rút viêm gan A 86

4.1.4. Kỹ thuật lựa chọn để thích ứng chủng 86

4.1.5. Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối ưu 884.1.6. Chất lượng chủng giống vi rút viêm gan A cho sản xuất vắc xin 89

KẾT LUẬN
109

KIẾN NGHN
111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
112TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh/ nghĩa tiếng việt
ADN Desoxyribonucleic acid (Axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid (Axít ribonucleic)
CDC Centers of Diseases Control and Prevention
(Trung tâm dự phòng và kiểm soát bệnh – Mỹ)
ECACC The European Collection of Cell Cultures
(Ngân hàng tế bào châu Âu)
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(Kỹ thuật miễn dịch gắn men)
FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bê bào thai)
FDA Food and Drug Administration
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang
1.1 Các vắc xin viêm gan A bất hoạt được lưu hành 16
1.2 Các tiêu chuNn của vắc xin viêm gan A 30
3.1 Hiệu giá vi rút theo thời gian hấp phụ 59
3.2 Hiệu giá vi rút qua các đời cấy truyền 60
3.3 Hệ thống chủng giống cho sản xuất vắc xin viêm gan A trên MRC5 60
3.4 Kết quả kiểm tra vô khuNn chủng giống gốc (MSV) và
chủng giống sản xuất (WSV) 63
3.5 Kết quả kiểm tra hiệu giá và tính ổn định chủng 64
3.6 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chủng 65
3.7 Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch của chủng 66
3.8 Hiệu giá vi rút ở các môi trường duy trì 68
3.9 Hiệu giá vi rút ở các liều khác nhau trên môi trường LH3E 69
3.10 Hiệu giá vi rút trên MRC5 ở môi trường không chứa huyết thanh 71

3.11 Nuôi cấy và chuNn bị tế bào MRC5 của các loạt sản xuất thử nghiệm 73
3.12 Hiệu giá vi rút của 3 loạt sản xuất thử nghiệm 74
3.13 Kết quả kiểm tra hiệu giá sau cô đặc thNm tích hỗn dịch vi rút 75
3.14 Kết quả kiểm tra bất hoạt vi rút 3 loạt vắc xin viêm gan A 75
3.15 Kết quả kiểm định các loạt bán thành phNm 76
3.16 Kết quả thử nghiệm vô khuNn 3 loạt vắc xin viêm gan A 77
3.17 Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của vắc xin viêm gan A 78
3.18 Kết quả kiểm tra an toàn chung của vắc xin trên chuột nhắt 78
3.19 Kết quả kiểm tra an toàn chung vắc xin trên chuột lang 79
3.20 Kết quả kiểm tra công hiệu của 3 loạt vắc xin 80
3.21 Kết quả kiểm tra các thành phần hóa học trong vắc xin 80

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1 Hiệu giá vi rút ở các liều gây nhiễm 58
3.2 Đường cong sinh trưởng của vi rút 58
3.3 Hiệu giá vi rút theo nhiệt độ nuôi cấy 59
3.4 Hiệu giá vi rút trong môi trường LH3E với các pH khác nhau 70
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang

2.1 Thiết kế nghiên cứu 36
2.2 Gây miễn dịch và lấy máu 43
2.3 Thay môi trường và lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi rút 46
2.4 Tiêm vắc xin và theo dõi chuột trong kiểm tra an toàn chung 51
2.5 Tiêm vắc xin và lấy máu chuột trong kiểm tra công hiệu 55

1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan A (VGA) là bệnh truyền nhiễm do vi rút viêm gan A gây
nên. Bệnh phổ biến với 1,5 triệu người mắc mới hàng năm trên toàn thế giới
và có thể dự phòng được bằng vắc xin [33], [51], [72], [94]. Việt Nam là quốc
gia nằm trong vùng lưu hành cao của vi rút viêm gan A nên nhu cầu sử dụng
vắc xin viêm gan A là rất lớn [5], [9].

gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm”
được tiến hành với 3 mục tiêu:
1. Thích ứng chủng vi rút viêm gan A HM 175 trên tế bào MRC5 để sản
xuất vắc xin viêm gan A.
2. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên nuôi
cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm.
3. Đánh giá chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản xuất và
vắc xin thành phm. 3
CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN

1.1. Những hiểu biết hiện nay về vi rút viêm gan A
1.1.1. Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A
Vi rút VGA (Hepatitis A virus - HAV) được Feinstone phát hiện lần
đầu tiên vào năm 1973 nhờ phương pháp hiển vi điện tử miễn dịch [1], [19].
Hình 1.1. Hình ảnh vi rút viêm gan A dưới kính hiển vi điện tử (tỷ lệ 1/10
6
)
(Nguồn: theo WHO (2007) [94])
Hình 1.2. Cấu trúc vi rút viêm gan A
(Nguồn: theo Martin A. (2006) [69])

Vi rút VGA có sức đề kháng cao, có thể tồn tại được ở nhiệt độ 60
0
C
trong 1 giờ, 100
o
C trong 5 phút, 37

Hình 1.3. Cấu tạo hệ gen của vi rút viêm gan A
(Nguồn: theo Martin A. (2006) [69])
Có ba phần chính trong bộ gen:
a) Đầu 5
’
gồm 742 nucleotid không dịch mã, nối với protein VPg bằng
liên kết đồng hóa trị. Cấu trúc bậc hai của vùng không mã hóa đầu 5
’
rất quan
trọng, tạo thành điểm gắn với ribosom có vai trò điều khiển dịch mã
polyprotein của vi rút.
b) Khung đọc mở (ORF) nằm ở vị trí trung tâm gồm 6681 nucleotid mã
hóa cho một polyprotein. Polyprotein được mã hóa bởi 3 vùng P1-2A, 2BC,

6
P3. Vùng cấu trúc tiền P1-2A về sau sẽ được tách ra bởi proteaza của vi rút
tạo thành VP4, VP2, VP1-2A và VP3. VP1-2A là protein cấu trúc quan trọng
khi hình thành hạt vi rút.
Khung đọc mở được dịch mã tạo ra polyprotein. Polyprotein này sau đó
được tách ra bởi một proteaza (3C
pro
) để tạo thành 4 protein cấu trúc (VP1,
VP2, VP3, VP4) và 7 protein không cấu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D).
Kháng thể kháng vi rút VGA gắn vào VP1 và/hoặc VP3 [33], [60], [69], [94].

Hình 1.4. Sự nhân lên của vi rút viêm gan A trong tế bào gan
(Nguồn: theo Martin A. (2006) [69])
Quá trình nhân lên của vi rút VGA trong tế bào chủ gồm các giai đoạn [69]:
a. Vi rút nhận diện và gắn vào thụ cảm thể trên màng tế bào chủ.
b. Sợi ARN (+) được giải phóng vào tế bào chất.
c. Khởi đầu quá trình dịch mã là một ribosom nội bào vào vị trí 5
’
của gen
để dịch mã tạo chuỗi polyprotein của vi rút.
d. Chuỗi polyprotein tiếp tục dịch mã đồng thời nhờ protease của vi rút
phân cắt thành các phân tử nhỏ có chức năng khác nhau như protein
cấu trúc tạo capsid, ARN polymerase, protease, VPg.
e. Tổng hợp sợi ARN (-) bổ sung trên ARN (+) khuôn mẫu, bắt đầu từ
đầu 3
’
với sự tham gia của ARN polymerase.
f. Sợi ARN (-) vừa được sao chép làm khuôn để tổng hợp ra nhiều sợi
ARN (+) mới của vi rút.
g. ARN (+) mới được tổng hợp có thể làm khuôn để tổng hợp nhiều ARN
(-) rồi từ đó tổng hợp nhiều sợi ARN hoặc dùng làm mARN để tổng
hợp polyprotein.
h. Lắp ráp sợi ARN (+) với protein cấu trúc để tạo ra hạt vi rút mới.
i. Hạt vi rút mới nNy chồi qua những vị trí trên màng tế bào chủ ra ngoài.


đoạn : tổng hợp các hạt vi rút VGA trưởng thành xuất hiện vào ngày thứ 2 - 4

9
sau gây nhiễm và đạt hiệu giá cao nhất vào ngày thứ 8. Từ ngày thứ 14 sau
gây nhiễm, khi vi rút nhân lên đã đạt đến mức ổn định, sự tổng hợp ARN vi
rút giảm dần. Sự nhân lên của vi rút VGA không làm gián đoạn quá trình tổng
hợp protein, ADN, ARN cũng như không gây hủy hoại tế bào trong thời gian
ủ kéo dài. Những điều này liên quan tới sự nhân lên kéo dài của vi rút trong
nuôi cấy trên tế bào. Vi rút được giải phóng ra khỏi tế bào theo cơ chế nNy
chồi [35]. Do đó các chủng vi rút VGA trong nuôi cấy tế bào được đặc trưng
bởi việc giải phóng khoảng 30- 50% vi rút (vi rút ngoại bào) và có một số
lượng lớn 50-70% các vi rút nằm trong tế bào – đây chính là nguyên liệu để
tinh chế thành vắc xin [65], [87], [74], [78], [79].

Sự nhân lên của vi rút VGA trên tế bào được xác định bằng việc phát
hiện kháng nguyên hoặc phát hiện vi rút.
Hiệu suất nuôi cấy vi rút thu được
phụ thuộc vào một số điều kiện nuôi cấy như : nhiệt độ, thời gian, môi trường
nuôi cấy và liều vi rút gây nhiễm. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp dao động từ 32
đến 35
o
C. Liều gây nhiễm 0,05-0,1 PFU/tế bào tùy từng công nghệ sản xuất
[29], [83], [77], [101],
[52], [36], [100], [29], [59].
Vi rút VGA phân lập từ người đã được nuôi cấy thành công trên các
dòng tế bào khác nhau và sử dụng cho sản xuất cả hai loại vắc xin
VGA bất hoạt và vắc xin sống giảm độc lực [18], [61], [80], [82].

1.1.1.5. Kháng nguyên và tính sinh miễn dịch
Tính kháng nguyên của vi rút VGA phụ thuộc vào hình thái của hạt vi

thuốc kháng vi rút đặc hiệu [4], [19], [21], [89].
1.1.2.2. Đáp ứng miễn dịch của cơ thể với vi rút viêm gan A
Đáp ứng miễn dịch tự nhiên với vi rút VGA rất phức tạp và có sự tham
gia của một vài thành phần khác nhau trong hệ miễn dịch. Có bằng chứng cho
thấy tế bào giết tự nhiên (NK - natural killer), tế bào T gây độc và các kháng

11
thể được sản xuất ra từ dòng tế bào B tham gia vào đáp ứng miễn dịch với
nhiễm vi rút VGA. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Lemon S. (1993), chỉ
riêng kháng thể dịch thể cũng đủ khả năng bảo vệ không bị bệnh VGA trên
lâm sàng [64]. Đáp ứng miễn dịch dịch thể liên quan chủ yếu đến kháng thể
trung hòa. Kháng thể này bao gồm hai lớp IgG và IgM. Sự có mặt của IgM
kháng vi rút VGA chứng tỏ bệnh nhân đang ở thời kỳ cấp tính của bệnh. Sự
xuất hiện và tồn tại của mỗi loại kháng thể trên được tìm thấy trong huyết
thanh bệnh nhân từ giai đoạn khởi phát đạt cao nhất 7 - 21 ngày, và thường
biến mất trong vòng một đến hai tháng. Tuy nhiên, một số trường hợp hiếm
gặp, chúng có thể tồn tại nhiều tháng sau khi bệnh nhân đã khỏi hoàn toàn
[63], [93], [97], [73]. Ngoài IgM kháng vi rút VGA, người ta còn thấy IgG
kháng vi rút VGA. Kháng thể này cũng bắt gặp từ giai đoạn khởi phát của
bệnh và kéo dài trong nhiều năm. Sự có mặt của IgG kháng vi rút VGA chứng
tỏ bệnh nhân đang hoặc đã mắc VGA trong quá khứ. Như vậy, ở giai đoạn
phục hồi, IgG kháng vi rút VGA trở thành chủ yếu và tồn tại rất lâu, có khả
năng chống tái nhiễm [51], [63], [73], [93], [97].


Tỷ lệ này tăng dần theo nhóm tuổi, từ 62% (ở nhóm dưới 5 tuổi) tới gần 100%
(ở nhóm trên 10 tuổi). Một số tác giả khác cũng cho kết quả tương tự [5], [7].
Tỷ lệ IgM anti-HAV ở các bệnh nhân viêm gan cấp tại các bệnh viện theo một
số nghiên cứu trong nước giao động từ 36,89 – 51,35% [7].
1.1.3. Các biện pháp dự phòng
Dự phòng VGA cần phải xem xét đến các yếu tố sinh miễn dịch và các
đường lây chính của bệnh. Có hai biện pháp cơ bản là ngăn chặn sự xâm nhập
của vi rút VGA vào cơ thể và tạo miễn dịch với vi rút VGA [1], [9], [19],
[22], [51].