Bộ giáo dục và đào tạo Bộ quốc phòng
Học viện quân y
NGUYN TH VN QUNH
Nghiên cứu phát triển vắcxin viêm gan a bất hoạt
Trên dòng tế bào mrc5 ở quy mô phòng thí nghiệm

Chuyờn ngnh: Vi sinh y hc
Mó s: 62. 72. 01.15

Tóm tắt luận án tiến sĩ y học

Hà nội 2015



DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Vân Quỳnh, Đỗ Thủy Ngân, Nguyễn Thu Vân, Đỗ Tuấn
Đạt (2013) ,“ Tính an toàn và sinh miễn dịch của vắc xin viêm gan A sản
xuất trên nuôi cấy tế bào MRC5 tại Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1”,
Tạp chí Y học Việt Nam, 408 (1), tr. 108-110. 2. Nguyễn Thị Vân Quỳnh (2014), “Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu của
chủng vi rút viêm gan A HM175 trên nuôi cấy tế bào MRC5”, Tạp chí Y
học Việt Nam, 414 (2), tr. 28-30.
CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Desoxyribonucleic acid (Axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid (Axít ribonucleic)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan A (VGA) là bệnh truyền nhiễm thường gặp do vi rút viêm
gan A gây nên. Bệnh phổ biến trên toàn thế giới và có thể phát triển thành
dịch trong cộng đồng đặc biệt ở các nước đang phát triển. Việt Nam là
quốc gia nằm trong vùng lưu hành cao của vi rút VGA với hơn 90% dân
số phơi nhiễm với vi rút. Bệnh có thể dự phòng được bằng vắc xin.
Vắc xin viêm gan A (VXVGA) đã được sản xuất bởi một số nước
tiên tiến trên thế giới bằng công nghệ sử dụng tế bào MRC5 (MRC5- tế
bào lưỡng bội phổi người), với các ưu điểm:
- Tế bào MRC5 có nguồn gốc từ người nên sử dụng dòng tế bào này
để sản xuất vắc xin sẽ hạn chế các nguy cơ gây dị ứng cho người sử dụng
so với các dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật.
- Sử dụng tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin thì có thể chủ động và
dễ mở rộng quy mô sản xuất .
- Tế bào MRC5 có thể tạo thành hệ thống ngân hàng tế bào với sự
kiểm tra chất lượng đầy đủ và không có đặc tính sinh khối u.
- Tế bào MRC5 đã được cấp phép sản xuất nhiều loại vắc xin trên
TG với chất lượng tốt.
Việt Nam chưa sản xuất vắc xin viêm gan A trên MRC5, hơn nữa
việc chuyển giao công nghệ sản xuất vắc xin viêm gan A vào Việt Nam
còn khó khăn.
Để tiến tới tự lực sản xuất vắc xin viêm gan A trên tế bào MRC5 ở
Việt Nam nhằm nhằm giảm giá thành của vắc xin so với vắc xin nhập
ngoại và đáp ứng nhu cầu vắc xin phòng bệnh cho cộng đồng, đề tài:
“Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào
MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm” được tiến hành với 3 mục tiêu :

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU


trang không kể phụ lục, gồm 4 chương, 24 bảng,
4 biểu đồ, 15 hình, 103 tài liệu tham khảo.
Bố cục luận án gồm:
 Đặt vấn đề 02 trang;
 Chương 1: Tổng quan tài liệu 30 trang;
 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24 trang;
 Chương 3: Kết quả nghiên cứu 25 trang;
 Chương 4: Bàn luận 27 trang;
 Kết luận 02 trang; Kiến nghị 01 trang; Danh mục các công trình
nghiên cứu có liên quan 01 trang.
 Tài liệu tham khảo (tổng số 103 tài liệu, 25 tài liệu tiếng Việt, 78
tài liệu tiếng Anh).

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Những hiểu biết hiện nay về vi rút viêm gan A
* Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A: Vi rút viêm gan A được
Feinstone phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 bằng phương pháp hiển vi
điện tử miễn dịch. Vi rút viêm gan A nhỏ, thuộc họ Picornaviridae, có lõi
là 1 sợi ARN đơn và capsid đối xứng hình khối với 4 protein cấu trúc
VP1, VP2, VP3, VP4. Vi rút VGA được phân loại thành 07 kiểu gen (từ I
đến VII). Hầu hết các chủng vi rút gây bệnh ở người thuộc kiểu gen I
(80%) và III. Vi rút VGA chỉ có 1 týp huyết thanh.
Vi rút VGA nhân lên trong tế bào chất của tế bào gan và giải phóng
theo cơ chế nẩy chồi. Vi rút VGA nhân lên chậm, kéo dài và sản lượng vi
rút thấp. Do đó, việc nhân nuôi vi rút để sản xuất vắc xin gặp nhiều khó

Nghiên cứu phát triển VXVGA bắt đầu từ bước chọn chủng, xây
dựng quy trình nuôi cấy, quy trình tinh chế, bất hoạt và bổ sung tá chất,
chất bảo quản để tạo thành vắc xin.
Bảng 1.1: Các vắc xin viêm gan A bất hoạt được lưu hành
Vắc xin
(Hãng sản
xuất)
Loại
tế bào

Chủng
virut
Phương pháp cô
đặc và tinh khêt
Phương pháp
Bất hoạt
Tá chất Chất bảo
quản
HAVRIX,
TWINRIX
(GSK)
MRC5 HM175 Siêu lọc và sắc
ký lọc gel
Formallin
1/4000/37oC/
15 ngày
Al(OH)3 2-phenoxyl-
ethanol
AVAXIMTM
(Aventis

(VABIOTECH
, Việt Nam)
PMMK HM175 Siêu lọc & thẩm
tích
Formallin
37oC/
4ngày
Al(OH)3

2-phenoxyl-
ethanol
(VABIOTECH: Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1)
Nuôi cấy thành công vi rút VGA trên tế bào mở ra sự phát triển các
VXVGA. Vắc xin VGA bất hoạt đầu tiên được cấp phép và sử dụng năm
1995 ở Mỹ. Hiện nay có 4 loại VXVGA bất hoạt được cấp phép đó là
Avaxim, Epaxal, Havrix,Vaqta - sản xuất từ nhân nuôi các chủng vi rút
viêm gan A (HAV) khác nhau trên MRC5, sau đó hỗn dịch vi rút thu
hoạch được cô đặc và tinh khiết rồi được bất hoạt bằng formallin bổ sung
chất bảo quản, tá dược và đóng lọ.
Đáng chú ý là 1 quy trình tinh chế vi rút viêm gan A có thể là sự phối
hợp của nhiều phương pháp tinh chế như phối hợp sắc ký trao đổi ion và
sắc ký lọc qua gel; hoặc cô đặc bằng tủa PEG kết hợp với sắc ký lỏng,
hoặc siêu lọc và sắc ký lọc gel hoặc cô đặc và tinh chế bằng siêu ly tâm
tùy theo “bí quyết” của nhà sản xuất VXVGA. Đa số các nghiên cứu về
VXVGA đều tập trung vào vắc xin bất hoạt vì tính an toàn cao của loại
vắc xin này.
5

* Kiểm tra chất lượng vắc xin trong quá trình sản xuất
Kiểm tra chất lượng tế bào MRC5 trước khi cấy vi rút; kiểm tra các mẻ
gặt đơn; kiểm tra quá trình bất hoạt; kiểm tra bán thành phẩm
* Kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A thành phẩm
- Các phương pháp kiểm tra sinh học: Kiểm tra vô khuẩn; kiểm tra an
toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang; kiểm tra chất gây sốt; kiểm tra
công hiệu vắc xin VGA
6
- Các phương pháp kiểm tra hóa lý: Xác định pH, hàm lượng protein, hàm
lượng nhôm, hàm lượng formallin, 2-phenoxylethanol trong vắc xin.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Chủng vi rút viêm gan A HM 175 (HAV HM175) do Trung tâm kiểm
soát bệnh tật Atlanta - Mỹ (CDC) cung cấp.
- Tế bào lưỡng bội phổi người MRC5, P19 (P – đời cấy truyền) do ngân
hàng tế bào châu Âu (ECACC-European Collection of Cell Cultures)
cung cấp. Tế bào thận khỉ thường trực Frhk-4 do CDC cung cấp.
- VXVGA mẫu chuẩn quốc gia iR/HA-02 do Viện Kiểm định Quốc gia
cung cấp. Động vật thí nghiệm, môi trường, hóa chất, sinh phẩm,
dụng cụ và trang thiết bị cần thiết để kiểm định chất lượng chủng giống,
nuôi cấy tế bào, cô đặc và tinh chế vi rút.
2.2. Phương pháp nghiên cứu: thử nghiệm phòng thí nghiệm.
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Thích ứng và tạo chủng

Xây dựng quy trình sản xuất

Sản xuất chủng giống và
kiểm tra chất lượng
↓

Tinh sạch hỗn dịch vi rút
↓

- Hiệu giá vi rút Sản xuất chủng sản xuất và
kiểm tra chất lượng

Bất hoạt vi rút
↓
- Kiểm tra bất hoạt
- Hàm lượng protein
- Vô khuẩn

Pha vắc xin
- Các thành phần hóa
học, vô khuẩn, chất gây
sốt, an toàn chung, công
hiệu.
7
2.2.1. Thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5
2.2.1.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho HAV HM175 trên tế

- Điều kiện chọn chủng: chủng gốc giống (MSV), chủng sản xuất (WSV)
đạt từ 10
6
– 10
8
(PFU/ml).
2.2.1.3. Sản xuất và kiểm tra chất lượng chủng giống
*Sản xuất chủng gốc giống và chủng sản xuất
- Các bước sản xuất chủng tuân theo quy trình sản xuất chủng vi rút VGA
- đã được Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế cấp phép
để sản xuất VXVGA.
8
- Sản xuất MSV: Nuôi cấy chủng với liều gây nhiễm (MOI - Multiplicity
of Infection) và ở các điều kiện nuôi cấy thích hợp (đã xác định), thu
hoạch vi rút tại thời điểm đạt hiệu giá vi rút cao nhất, đông tan, ly tâm loại
bỏ tế bào, chia 1,5ml/ túyp, bảo quản chủng giống gốc ở -80
o
C.
- Sản xuất WSV: Tan băng chủng MSV, trộn đều, gây nhiễm với MOI
thích hợp trên tế bào MRC5. Quy trình nhân giống WSV tương tự như
nhân giống MSV.
* Kiểm tra chất lượng chủng giống: Theo hướng dẫn kiểm tra chất lượng
chủng giống vi rút VGA của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Dược điển
châu Âu.
+ Nhận dạng:
- Phương pháp hiển vi điện tử: Nhận dạng vi rút trong tế bào MRC5
bằng kỹ thuật nhuộm âm bản cắt lát, soi hiển vi điện tử. Tiêu chuẩn chấp

hủy hoại tế bào và không có vi rút hấp phụ hồng cầu.
+ Kiểm tra khả năng sinh miễn dịch: Tiêm 0,5 ml chủng HAV sống và đã
bất hoạt (bằng formallin nồng độ 1/2000, nhiệt độ 37
o
C/96 giờ) vào ổ
bụng chuột 11-13gam, theo lịch 0-1-2 tuần. Nhóm chứng tiêm VXVGA
mẫu chuẩn iRHA 02 (với hàm lượng protein các mẫu như nhau). Lấy máu
chuột trước khi tiêm (huyết thanh 1) và 5 tuần sau tiêm mũi thứ nhất
(huyết thanh 2). Xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu bằng thử nghiệm
ELISA. Tiêu chuẩn chấp thuận của nghiên cứu: Hàm lượng kháng thể
kháng vi rút viêm gan A (anti-HAV) ≥ 20 mIU/ml.
2.2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất
hoạt trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm
- Các quy trình nghiên cứu: quy trình nuôi cấy vi rút, quy trình thu hoạch
vi rút bao gồm: Xác định liều gây nhiễm vi rút tối ưu; Xác định môi
trường nuôi cấy vi rút không chứa huyết thanh tối ưu; pH tối ưu của môi
trường này; Xác định thời gian và số lần thu hoạch vi rút.
- Các quy trình kế thừa thành công của quy trình tinh sạch vi rút VGA
trong sản xuất Havax từ tế bào thận khỉ của Công ty Vắc xin và Sinh
phẩm số 1 bao gồm: quy trình ly tâm, cô đặc thẩm tích hỗn dịch vi rút; bất
hoạt vi rút và quy trình pha vắc xin.
* Nuôi cấy và chuẩn bị tế bào MRC5
Nuôi cấy và cấy truyền tế bào theo hướng dẫn của ECACC từ đời p26 đến
đời p32. Khi tế bào một lớp mọc kín 80% bề mặt nuôi cấy, tiến hành gây
nhiễm vi rút với điều kiện nuôi cấy tối ưu.
* Gây nhiễm, nuôi cấy và thu hoạch vi rút
Khảo sát các môi trường không chứa huyết thanh; liều gây nhiễm; thời
gian gặt và pH môi trường duy trì, để lựa chọn điều kiện nuôi cấy vi rút
tối ưu cho sản xuất vắc xin dựa trên việc so sánh hiệu giá vi rút thu được
sau nuôi cấy.

trên tế bào.
* Kiểm tra bất hoạt vi rút: (Theo thường quy kiểm tra bất hoạt vi rút VGA
tại VABIOTECH). Tiêu chuẩn chấp thuận: Vi rút được bất hoạt hoàn toàn
khi hiệu giá vi rút bằng 0 PFU/ml.
2.2.3.2. Kiểm tra chất lượng vắc xin thành phẩm
* Các phương pháp kiểm tra sinh học
+ Kiểm tra vô khuẩn bằng phương pháp cấy trực tiếp trên môi trường
Thioglycolate và Soybean (Theo dược điển Việt Nam 4). Tiêu chuẩn chấp
thuận: Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm.
+ Kiểm tra an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang (Theo phụ lục
15.11–Dược điển Việt Nam 4).Tiêu chuẩn chấp thuận: 100% chuột khoẻ
mạnh, tăng trọng và không có dấu hiệu bệnh lý.
11
+ Kiểm tra chất gây sốt (Theo phụ lục 15.12- Dược điển Việt Nam 4).
Tiêu chuẩn chấp thuận: Tổng nhiệt độ tăng của 3 thỏ sau 3 giờ theo dõi 
1,3
o
C. Tổng nhiệt độ tăng của từng thỏ <0,6
o
C.
+ Kiểm tra công hiệu vắc xin VGA (Theo dược điển châu Âu) thực hiện
theo thường quy của VABIOTECH. Tiêu chuẩn chấp thuận: công hiệu
tương quan của vắc xin thử so với vắc xin chuẩn  1.
* Các phương pháp kiểm tra hóa lý
+ Xác định pH bằng máy đo với điện cực thủy tinh. Tiêu chuẩn chấp
thuận: pH của VXVGA trong khoảng 5,5- 7,5.
+ Xác định hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Lowry. Tiêu


Biểu đồ 3.1. Hiệu giá vi rút ở các liều gây nhiễm
Xuất phát từ các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã công
bố. Chúng tôi khảo sát các liều gây nhiễm từ 0,005 đến 5 MOI qua 3
lần thử nghiệm. Lấy kết quả hiệu giá vi rút là thước đo để đánh giá
các liều gây nhiễm trên. Kết quả hiệu giá trung bình của vi rút VGA
đạt cao nhất ở cả 3 lần thử nghiệm với liều gây nhiễm 0,005 MOI
(biểu đồ 3.3), vì vậy liều gây nhiễm 0,005 MOI sẽ được lựa chọn cho
việc nghiên cứu các điều kiện tối ưu khác.

0.6
5
2
0
2
4
6
7 14 21
5 M OI
0,5 MOI
0,05 MOI
0,005 MOI
Hiệu giá vi rút (1.000.000
PFU/ml)
Thời gian sau gây nhiễm (ngày)
13
* Nhiệt độ nuôi cấy

sử dụng trong nuôi cấy vi rút VGA chủng HM175 trên tế bào thận khỉ tại
Việt Nam là 37
o
C. Do đó, nghiên cứu này khảo sát các nhiệt độ nuôi cấy
là 32
o
C, 35
o
C và 37
o
C (biểu đồ 3.3). Qua cả 3 lần thử nghiệm, kết quả cho
thấy nhiệt độ 35
o
C cho hiệu giá vi rút VGA cao nhất. Chọn nhiệt độ nuôi
cấy tối ưu 35
o
C. Thời điểm đạt hiệu giá vi rút cao nhất là ngày thứ 14 sau
gây nhiễm.
3.1.2. Kết quả cấy truyền thích ứng
Bảng 3.2. Hiệu giá vi rút qua các đời cấy truyền

(ND: Hiệu giá vi rút <10
4
)
Bảng 3.1 là kết quả thích ứng vi rút khi áp dụng các điều kiện nuôi
cấy tối ưu đã xác định. Kết quả cho thấy hiệu giá vi rút ở P1, P2 là 10
7

PFU/ml, từ P3 hiệu giá giảm. Chọn chủng vi rút giống gốc P0, chủng sản
xuất trên MRC5 tại P1 và sản xuất vắc xin ở P2 để đạt được sản lượng vi


1,0x10
7

0,5x10
7

1,0x10
7

0,7x10
7
P2 1,0x10
7
2,0x10
7
1,5x10
7
1,5x10
7

P3 5x10
6
2,0x10
6
0,5x10
7
4,0x10
6
P4 0,5x10

trong tế bào MRC5
- 248 bp- gen đặc hiệu HAV

- Trong tế bào MRC5 có
HAV hình cầu, 28 nm.
- 248 bp- gen đặc hiệu HAV
Vô khuẩn Không có vi khuẩn và nấm Không có vi khuẩn và nấm
Mycoplasma
- Nuôi cấy
- PCR

- Không có Mycoplasma
- Không có băng 270
bp của Mycoplasma

- Không có Mycoplasma
- Không có băng 270
bp của Mycoplasma
Hiệu giá vi rút 10
6
-10
8
(PFU/ml) 1x10
7
(PFU/ml)
Vi rút ngoại lai
trên 3 dòng tế bào
MRC5, Vero,
PMMK
- Không có vi rút ngoại

- 248 bp- gen đặc hiệu HAV

- Trong tế bào MRC5 có
HAV hình cầu, 28 nm.
-248 bp- gen đặc hiệu HAV
Vô khuẩn Không có vi khuẩn và nấm Không có vi khuẩn và nấm
Mycoplasma
- Nuôi cấy
- PCR

- Không có Mycoplasma
- Không có băng 270
bp của Mycoplasma

- Không có Mycoplasma
- Không có băng 270
bp của Mycoplasma
Hiệu giá vi rút 10
6
-10
8
(PFU/ml) 1x10
7
(PFU/ml)
Vi rút ngoại lai
trên 03 dòng tế bào
MRC5, Vero,
PMMK
- Không có vi rút ngoại
lai gây hủy hoại tế bào
3.2. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt
trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm
3.2.1. Kết quả nuôi cấy và chuẩn bị tế bào MRC5
Hình thái tế bào ổn định qua 7 đời cấy chuyển từ đời p26 đến đời p32.
Gregersen J.P thích ứng vi rút VGA trên dòng tế bào MRC5 cho thấy hiệu giá
vi rút đạt cao ở đời tế bào p25 đến p38.

3.2.2. Kết quả gây nhiễm, nuôi cấy và thu hoạch vi rút
* Kết quả xác định môi trường nuôi cấy tối ưu
Bảng 3.8. Hiệu giá vi rút ở các môi trường duy trìHiệu giá vi rút trung bình ở các môi trường duy trì (PFU/ml)

Thời gian
sau gây
nhiễm
(ngày)

MEM

DMEM

LH3E

MEM-
hep


0,8 x 10
6
1,0 x 10
6

17 1,0 x 10
6
0,5 x 10
6

1,5 x 10
6

0,2 x 10
6
0,4 x 10
6
0,25 x 10
6

24 0,5 x 10
6
0,5 x 10
6

0,8 x 10
6

0,05 x 10
6

Môi trường duy trì tế bào sau khi gây nhiễm vi rút cũng là một vấn
đề cần bàn luận. Một số tác giả dùng MEM có 2-5% FBS (FBS-huyết
thanh bê bào thai) và trong quá trình tinh chế cần loại bỏ protein của FBS
để tránh các phản ứng phụ. Nghiên cứu này đã xác định được một môi
trường (LH3E) không chứa huyết thanh cho hiệu giá vi rút chấp nhận
được để đưa vào sản xuất. Môi trường không chứa huyết thanh sẽ có giá
thành thấp hơn, dễ tinh khiết vi rút hơn và hạn chế được các nguy cơ lây
nhiễm bởi các tác nhân vi sinh vật so với các môi trường duy trì tế bào có
huyết thanh. Như vậy sẽ tiết kiệm được nguyên liệu, giảm giá thành của
sản phẩm.
16
* Kết quả xác định liều gây nhiễm tối ưu ở môi trường không có huyết
thanh
Bảng 3.9. Hiệu giá vi rút ở các liều gây nhiễm khác nhau trên môi trường LH3E
Hiệu giá vi rút (PFU/ml) ở các liều gây nhiễm
Thời gian sau gây

Nhiễm (ngày)
0,5 MOI 0,1 MOI 0,05 MOI
1 10
5
6x10
4
2x10
4
2 5x10
5

7 3,5 x10
6
1,5 x10
6
5 x10
5

8 3 x10
6
2,5 x10
6
4 x10
5

9 3 x10
6
3 x10
6
0,5 x10
6

10** 5 x10
6

4,5 x10
6

2 x10
6


6
2 x10
5

16 0,5 x10
6
3 x10
6
0,3 x10
6

17** 0,5 x10
6

3 x10
6

1,5 x10
6

18 6 x10
4
ND

ND

19 3 x10
5
7 x10
4

24 4 x10
5

1 x10
6

1 x10
6

Tổng hiệu giá
3 lần gặt
5,7 x 10
6
10,0 x 10
6
4,5 x 10
6

(ND): hiệu giá vi rút < 10
3

(*) Rửa tế bào bằng Hank’s, thay môi trường LH3E không chứa huyết thanh.
(**) Thay môi trường LH3E; Gặt vi rút các ngày thứ 10, 17 và 22 sau gây nhiễm vi rút.
Nhân nuôi vi rút trên MRC5 ở môi trường không có huyết thanh
LH3E, liều gây nhiễm 0,1MOI cho tổng hiệu giá vi rút cao nhất (10,0 x
10
6
PFU/ml) và thu được 3 mẻ gặt đơn đạt yêu cầu. Khoảng thời gian nuôi
cấy cho mỗi mẻ gặt đơn vi rút và thay môi trường để duy trì tế bào thích
hợp nhất vào ngày thứ 10, 17, 22 sau gây nhiễm và số lần thu hoạch tối đa

1.000.000 (PFU/ml)
ngày 22
ngày 17
ngày 10

Biểu đồ 3.4. Hiệu giá vi rút trong môi trường LH3E với các pH khác nhau
Biểu đồ 3.4 cho thấy tổng hiệu giá vi rút thu được ở các điều kiện pH
7,4 và 7,6 đạt cao lần lượt là 10,5 x10
6
và 11,5 x10
6
PFU/ml. Do đó pH 7,4
– 7,6 sẽ được lựa chọn để nuôi cấy vi rút cho sản xuất VXVGA.
Từ các kết quả thử nghiệm về điều kiện nuôi cấy ở trên, một quy trình
nuôi cấy vi rút cho sản xuất tổng thể đã được xác định bao gồm: Liều gây
nhiễm tối ưu: 0,1 MOI; Môi trường duy trì không huyết thanh LH3E với
pH 7,4-7,6 ; Thời điểm gặt vi rút ở các ngày 10, 17 và 22 sau gây nhiễm.
Áp dụng các điều kiện nuôi cấy tối ưu trên 3 loạt nuôi cấy trong chai 1 lớp
(loạt 0109, 0209, 0309).
Bảng
3.10. Hiệu giá vi rút trên MRC5 ở môi trường không chứa huyết thanh
Hiệu giá vi rút (PFU/ml)
Thời gian sau
gây nhiễm
(ngày)
Loạt 0109 Loạt 0209 Loạt 0309
10 6,5 x10
6
1,0 x10
7
Qui trình sản xuất Vắc xin VGA trên nuôi cấy tế bào MRC5
Chủng gốc giống HAV – HM175 (MSV)

Chủng sản xuất HAV – HM175 (WSV)

1- Nuôi cấy tế bào MRC5 một lớp qua 6
cấy truyền từ p26 đến p32, tế bào kín 80% 2- Gây nhiễm HAV HM175 vào tế bào MRC5
MOI 0,1; ủ 35
0
C/2h/Hank
,
s, 15-20 phút láng 1 lần

3- Bỏ Hank
,
s, thêm MEM 2%FBS, ủ trong 3 ngày/35
0
C

4- Rửa tế bào bằng Hank
,
s, cho LH3E không serum
pH 7,4-7,6; Nuôi cấy ở 35
0
C

- Vô khuẩn
- Hiệu giá vi rút
- Hiệu giá vi rút

- Kiểm tra bất hoạt
- Hàm lượng protein
- Vô khuẩn
- Vô khuẩn
- Công hiệu
- An toàn chung
- Chất gây sốt
- Các thành phần hóa học
19
3.3. Kết quả sản xuất thử nghiệm và kiểm tra chất lượng trong quá
trình sản xuất và vắc xin thành phẩm
Sử dụng các quy trình nuôi cấy tế bào, gây nhiễm nuôi cấy và thu
hoạch vi rút trên tế bào MRC5 được xây dựng trong đề tài này để sản xuất
03 loạt vắc xin VGA thử nghiệm. Dưới đây là các kết quả kiểm định trong
quá trình sản xuất và vắc xin thành phẩm.
3.3.1. Kết quả kiểm tra trong quá trình sản xuất
* Kết quả hiệu giá vi rút trên các loạt sản xuất thử nghiệm
Bảng 3.12. Hiệu giá vi rút của 3 loạt sản xuất thử nghiệm
Hiệu giá vi rút (PFU/ml)
Thời gian sau gây
nhiễm (ngày)
Loạt 0110 Loạt 0210 Loạt 0310
10 1,0 x10

7x10
78 x10
77x10
7

Thể tích (ml) 282 274 285
Sau cô đặc, hàm lượng vi rút tăng cao và ổn định về hiệu giá từ
7x10
7
– 8x10
7
PFU/ml.
* Kết quả bất hoạt vi rút
Kiểm tra các mẫu sau bất hoạt (0, 24, 48, 72 và 96 giờ) trên nuôi tế
bào và chuẩn độ hiệu giá vi rút của 03 loạt sản xuất thử nghiệm. Kết quả
cho thấy: Hiệu giá vi rút sau bất hoạt đều bằng 0 PFU/ml trên thử nghiệm
tạo đám hoại tử, chứng minh vi rút đã hoàn toàn bị bất hoạt. Để bất hoạt vi
rút VGA, các nhà sản xuất VXVGA đều sử dụng formalin. Cả 03 loạt sản
xuất thử nghiệm đều đạt yêu cầu về thử nghiệm bất hoạt.điều đó chứng tỏ
quy trình bất hoạt vi rút 1/2000 ở 37
o
C trong 96 giờ là đảm bảo an toàn.
* Kết quả pha vắc xin của các loạt sản xuất
Vắc xin được pha về hàm lượng protein 50 g/ml. Kết quả pha vắc xin

khuẩn khó tính) cũng như các loại nấm.

* Kết quả kiểm tra chất gây sốt
Bảng 3.17. Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của vắc xin viêm gan A

Thử nghiệm này để phát hiện có hay không tác nhân gây sốt trong vắc
xin. Theo WHO, thử nghiệm này có thể được thực hiện trên thỏ hoặc bằng
thuốc thử lysat. Thử nghiệm chất gây sốt trên thỏ được thực hiện dựa trên
nguyên tắc so sánh sự tăng thân nhiệt của hai nhóm thỏ trước và sau khi
tiêm vắc xin vào tĩnh mạch tai thỏ trong vòng 3 giờ. Nếu vắc xin không an
toàn, phản ứng đầu tiên là sốt và nhiệt độ thỏ được đo qua hậu môn trước
và sau khi tiêm 1, 2, 3 giờ. Tính tổng nhiệt độ tăng so với tiêu chuẩn để
đánh giá. Đây là phương pháp thử nghiệm thường dùng trong kiểm định
chất gây sốt được quy định tại Dược điển Việt Nam. Kết quả bảng 3.9
cho thấy tất cả 3 loạt vắc xin đạt yêu cầu về chất gây sốt ≤ 1,3
o
C. Nhiệt độ tăng của từng thỏ

Loạt vắc xin
Thỏ 1 Thỏ 2 Thỏ 3

Tổng nhiệt

độ tăng

Kết
luận

0310 5/5 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý
110,5 Đạt
Tiêu chuẩn 100% khỏe mạnh, tăng trọng 100 Đạt Bảng 3.19. Kết quả kiểm tra an toàn chung của vắc xin trên chuột lang
Loạt
vắcxin
Tình trạng chuột sau 7 ngày
theo dõi
Trung bình
tăng trọng (%)
Kết
luận
0110 2/2 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý.
118,8 Đạt
0210 2/2 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý.
117,0 Đạt
0310 2/2 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý.
119,5 Đạt
Tiêu chuẩn 100% khỏe mạnh, tăng trọng 100 Đạt

Tất cả các chuột được thử nghiệm 3 loạt vắc xin đều khỏe mạnh và
tăng trọng từ 110,5% - 151,7%, đạt tiêu chuẩn chấp thuận của WHO. Cả 3
loạt vắc xin đạt yêu cầu về an toàn chung trên chuột và chất gây sốt trên
thỏ, cho thấy VXVGA đạt yêu cầu về tính an toàn khi kiểm tra trên động