Tổng quan tài liệu
- 3 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
CHƯƠNG I.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST
GROWTH FACTOR)
1.1.1. Giới thiệu chung
Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF đƣợc Armelin tìm thấy trong dịch chiết
tuyến yên vào năm 1973. Năm 1974, Gospodarowicz công bố nghiên cứu tìm thấy
nhân tố tăng trƣởng này trong dịch chiết não bò. Nghiên cứu này cũng tiến hành thử
nghiệm hoạt tính sinh học và kết luận protein đƣợc tìm thấy có tác dụng làm tăng sinh
các nguyên bào sợi. Sau đó, Gospodarowicz tinh chế phân đoạn dịch chiết đƣợc tìm
thấy ở pH acid và basic. Thí nghiệm đã cô lập đƣợc hai dạng FGF khác nhau tƣơng
ứng với mỗi phân đoạn pH. Nhân tố tăng trƣởng thu nhận đƣợc ở pH acid đƣợc gọi là
FGF-1 còn nhân tố tăng trƣởng thu nhận ở pH bazơ đƣợc gọi là FGF-2. Hai loại
protein có độ tƣơng đồng cao về trình tự amino acid. Hiện nay, trên 20 thành viên của
họ nhân tố tăng trƣởng FGF đã đƣợc tìm thấy và nghiên cứu về cấu trúc, hoạt tính…
để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau [5, 8].
Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi (FGF) đƣợc tìm thấy ở rất nhiều loài, từ giun tròn
đến con ngƣời. Ở động vật có xƣơng sống, trên 20 thành viên của họ nhân tố tăng
trƣởng FGF đã đƣợc tìm thấy với khối lƣợng phân tử từ 17 đến 34 kDa. Có 18 loại
nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi (FGF1–FGF10 and FGF16–FGF23) đƣợc phân
những con đƣờng riêng biệt độc lập nhau. Các họ FGFs có một vùng lõi tƣơng đồng
bao gồm 120 – 130 amino acids xếp trật tự tạo thành 12 phiến β không song song
(β1β12) nối với nhau bằng những đầu carboxyl và amino. Vị trí gắn của Heparan
sulphate glucosaminoglycan (HSGAG) gọi là các HBS nằm ở bên trong lõi FGF bao
Tổng quan tài liệu
- 5 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
gồm một vòng nối β1-β2 và phần cầu nối giữa β10-β12. Đối với những FGFs cận tiết,
những nhân tố hình thành các HBS là các bề mặt tích điện dƣơng và giáp nhau. Ngƣợc
lại, các HBS của phân họ FGF19, 21 và 23 chứa một trình tự hình thành bởi vòng nối
β1-β2 và phần cầu nối giữa β10-β12 làm hạn chế vùng HSGAG gắn lên lõi FGF, nên
những phân họ này đƣợc tạo ra theo cơ chế nội tiết [6].
Họ nhân tố tăng trƣởng FGF là một họ protein đa chức năng. Trong quá trình phát triển
phôi, FGF có nhiều vai trò trong điều hòa sự tăng sinh tế bào, di chuyển và biệt hóa.
Trong cơ thể trƣởng thành, họ protein FGF là các yếu tố cân bằng nội môi. Ngoài ra họ
protein này còn có chức năng sửa chữa các mô, đáp ứng với các tổn thƣơng. Một nhóm
nhỏ các protein thuộc họ FGF biểu hiện ở các mô trƣởng thành có vai trò quan trọng
trong dẫn truyền tín hiệu thần kinh trong hệ thần kinh trung ƣơng và ngoại vi. Tuy
nhiên, khi biểu hiện bất thƣờng, các nhân tố tăng trƣởng này có thể gây ung thƣ [5, 8].
Bảng 1.1. Các chức năng cơ bản của họ nhân tố FGF [34].
Tăng sinh tế bào
FGF-1, FGF-2 FGF-4
FGF-7, FGF-10
FGF-18
Tế bào mỡ tiền thân
Tổng quan tài liệu
- 6 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
1.1.2. Nhân tố tăng trƣởng FGF-2
1.1.2.1. Cấu trúc của nhân tố tăng trƣởng FGF-2
Hình 1.2. Cấu trúc gene mã hóa protein FGF-2[17]
Gen mã hóa FGF-2 ngƣời nằm trên vùng q26-27 của nhiễm sắc thể số 4. Gen dài
khoảng 71kb gồm một vùng không dịch mã 5’UTR (Untranslated Region), 3 exon, 2
intron và vùng không dịch mã lớn 3’UTR (hình 1.2). Vùng không dịch mã 5’UTR và
3’UTR chứa các yếu tố điều hòa sự biểu hiện nhân tố tăng trƣởng FGF-2, mật độ tế
bào, các chất dẫn truyền thần kinh, con đƣờng truyền tín hiện thứ cấp…[17, 20].
Hình 1.3. Cấu trúc ba chiều của FGF-2[6].
FGF-2 có hình dạng gần giống với một hình chóp tam giác. Mỗi mặt bên hợp thành bởi
hai chuỗi β. Ba mặt bên của hình chóp hình thành một khoang trống do sáu chuỗi β
song song ngƣợc chiều nhau tạo thành. Phần đáy của hình chóp gồm thêm sáu chuỗi β.
Tổng quan tài liệu
- 7 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
Nhƣ vậy, toàn bộ phân tử FGF-2 đƣợc cấu tạo bởi 12 chuỗi β xếp song song ngƣợc
chiều nhau (hình 1.3). FGF-2 đƣợc tìm thấy lần đầu tiên là dạng protein có 146 amino
acid với trọng lƣợng phân tử khoảng 16,5kDa đƣợc phân lập từ tuyến yên. Khi cDNA
của FGF-2 đƣợc tạo dòng, codon AUG đƣợc xác định nhƣ là codon mở đầu cho quá
trình dịch mã cho protein gồm 155 amino acid. Ngoài ra không còn tìm thấy bất cứ
codon AUG nào khác ở thƣợng nguồn mRNA. Vì vậy, codon AUG đƣợc cho là codon
mở đầu cho quá trình dịch mã. Tuy nhiên, dựa vào trình tự cDNA tìm thấy trong não
lợn, não chuột, gan, phôi ngƣời, tuyến tiền liệt và một số tế bào đƣợc nuôi cấy khác,
này cũng giống nhau. Ngoài ra, các amino acid bảo tồn của họ protein FGF đƣợc tìm
thấy trong vùng lõi của FGF-2. Điều này củng cố thêm dự đoán rằng các thành viên
khác thuộc họ protein FGF sẽ có cấu trúc tƣơng tự với FGF-2 [6, 21].
Các vị trí tích điện dƣơng (Lys-138, Lys-134, Lys-128, Arg-129, Lys-144) trên
protein FGF-2 đƣợc xác định là vị trí gắn heparin của protein FGF. Vị trí gắn receptor
của protein đƣợc tạo thành nhờ đoạn peptide 115-124 (chứa Tyr-123 and Trp-124) trên
protein FGF-2. Trên cấu trúc không gian 3 chiều, phân tử FGF có hai gốc cysteine
(Cys-78 và Cys-96) đƣợc lộ ra ngoài và hai gốc cysteine khác (Cys-34 và Cys -101)
đƣợc quay vào phía bên trong lõi kị nƣớc. Do đó, bốn cysteine có thể tạo thành hai cầu
nối diusulfide. Tuy nhiên, khi phân tích cấu trúc tinh thể thì khoảng cách giữa hai cặp
cysteine này quá xa để có thể hình thành cầu nối bội phân tử nhƣng có khả năng hình
thành cầu nối liên phân tử [7, 19].
Phân tử FGF-2 tích điện dƣơng ở vị trí Lys (vị trí gắn với heparin), sinh ra năng lƣợng
trong phân tử, làm cấu trúc của protein không ổn định. Những phân tử tích điện âm
nhƣ heparin tƣơng tác với những vị trí này, làm cho FGF-2 trở nên ổn định hơn, bảo
vệ FGF-2 chống lại tác động của nhiệt độ, pH cũng nhƣ tác động của protease. Do đó,
có thể kết luận rằng, những gốc sulfate trên heparin giúp ổn định hoạt tính của FGF-2.
Hơn nữa, khi có những ion sulfate tồn tại trong dung dịch, nó cũng gắn vào các vị trí
lysine trên FGF và đóng vai trò giúp ổn định hoạt tính của protein này giống nhƣ
heparin. Tuy nhiên, cả ion sulfate và heparin đều không ngăn đƣợc việc hình thành cầu
nối disulfide nội/ngoại phân tử của các cystein tự do trong protein. Ngoài ra, cũng do
có khả năng tƣơng tác đặc hiệu với heparin nên chất này thƣờng đƣợc sử dụng để tinh
chế FGF-2 bằng phƣơng pháp sắc kí ái lực [25, 32].
Sự tƣơng tác giữa heparin và FGF-2 còn làm các phân tử này gắn lại với nhau tạo các
cấu trúc dimer và tetramer. Cơ chế heparin đóng góp vào việc hoạt hóa các receptor
của FGF-2 vẫn chƣa đƣợc biết rõ. Sự dimer hóa của FGF-2 là điều kiện cần thiết để
FGF-2 gắn và hoạt hóa các receptor của chúng. Heparin là một phân tử
glycoaminoglycan đƣợc sulfate hóa. Một đơn vị heparin disaccharide cơ bản của chuỗi
heparin bao gồm phân tử L-iduronic acid (Idu) và D-glucosamine (GlcN) nối với nhau
bởi cầu nối α(1-4) glycoside (hình 1.5). Một đơn vị heparin disaccharide có 3 nhóm
Luận văn thạc sĩ sinh học
nguyên bào xƣơng, tế bào thần kinh, tế bào nội mô, tế bào sừng…. Trong phôi sớm,
FGF-2 có vai trò biệt hóa các mô ngoại phôi bì thành các mô trung phôi, duy trì tính đa
năng của tế bào. FGF-2 cũng có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành mạch
máu nhờ khả năng tăng sinh các tế bào nội mô mạch máu, chữa lành vết thƣơng và sửa
chữa mô. FGF-2 là một chất kích thích phân bào mạnh trên nhiều loại tế bào có nguồn
gốc từ trung phôi bì và thần kinh ngoại bì. Ở cấp độ hệ cơ quan, FGF-2 cũng đóng vai
trò quan trọng trong sự phát triển các hệ cơ quan khác nhau (bảng 1.2). FGF2 kích
thích các nguyên bào sợi tăng sinh tạo mô hạt lấp đầy khoảng trống do vết thƣơng gây
ra trong quá trình làm lành vết thƣơng. FGF-2 tiết ra bởi những tế bào nội mô lót bên
trong thành mạch tác động theo cơ chế autocrine kích thích tế bào nội mô thành mạch
phân bào, tổ chức các tế bào mới tạo thành theo cấu trúc dạng hình ống và đóng vai trò
là chất hóa hƣớng động giúp hình thành mạch máu mới [4, 11, 34].
Gần đây, đã tìm thấy nhiều chất kích thích tế bào nội mô phân bào với khối lƣợng phân
tử 13-18kDa, có ái lực cao với heparin và điểm đẳng điện basic. Những chất kích thích
phân bào đó bao gồm nhân tố tăng trƣởng tế bào hình sao, nhân tố tăng trƣởng gắn β
heparin và các nhân tố tăng trƣởng từ tế bào máu, sụn, võng mạc, đại thực bào, vùng
dƣới đồi… đều là các dạng của FGF-2, chỉ khác nhau ở đầu N. Quá trình xử lý nhân tố
tăng trƣởng FGF-2 ở các mô khác nhau với các dạng protease đặc trƣng cho từng mô
đã tạo nên nhiều dạng FGF-2 nhƣ đã liệt kê ở trên. Tuy chức năng của FGF-2 trong
môi trƣờng invivo vẫn chƣa đƣợc biết rõ nhƣng những tính chất của FGF-2 trong điều
kiện nghiên cứu in vitro cho thấy FGF-2 có vai trò quan trọng trong hình thành mạch
máu mới, làm lành vết thƣơng và có khả năng gây ung thƣ nếu biểu hiện bất thƣờng
[26, 29, 33].
Bảng 1.2. Chức năng của FGF-2 ở các hệ cơ quan khác nhau [4].
Não Duy trì và biệt hóa tế bào thần kinh
Mạch máu Hình thành mạch, tăng sinh tế bào cơ trơn
Hạn chế xơ vựa động mạch và điều hòa huyết áp
Phổi Phân nhánh hình thái, ngăn ngừa xơ hóa
tác động của dạng FGF-2 này đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu. Đối với các FGF-2
không gắn thêm các trình tự tín hiệu sẽ đƣợc tiết ra ngoài tế bào và tƣơng tác với các
thụ thể giúp tế bào gốc phôi ngƣời tăng sinh trong tình trạng không biệt hóa.
Hiện nay, cách nuôi tế bào gốc phôi trên môi trƣờng xác định trong đó có bổ sung
các nhân tố tăng trƣởng đƣợc ƣu tiên sử dụng hơn khi nuôi tế bào dùng cho các ứng
dụng trong y học vì tránh đƣợc nguy cơ nhiễm chéo mầm bệnh từ lớp tế bào đồng nuôi
cấy. Các nghiên cứu cho thấy việc kết hợp giữa FGF-2 với các nhân tố tăng trƣởng
khác noggin, activin A… giúp duy trì trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc phôi khi
nuôi cấy tế bào gốc phôi trong khoảng thời gian dài [4, 34].
Nhƣ vậy, trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc ngƣời đƣợc duy trì nhờ nhân
tố tăng trƣởng FGF-2. Cơ chế duy trì trạng thái không biệt hóa của FGF-2 trên tế bào
gốc phôi ngƣời cần đƣợc nghiên cứu cụ thể để có thể tối ƣu hóa quy trình nuôi loại tế
bào gốc này [4, 34].
b) Trong y học
Tổng quan tài liệu
- 12 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
- Ngăn ngừa hình thành sẹo lồi
Sự hình thành sẹo lồi đƣợc cho là do tình trạng tăng sinh quá mức của nguyên
bào sợi cơ và mô đàn hồi của da tại lớp trung bì trong quá trình làm lành các tổn
thƣơng trên da hoặc do đƣờng khâu của vết mổ. Những nghiên cứu gần đây cho thấy
việc sử dụng FGF-2 có khả năng ngăn ngừa sẹo hiệu quả do tác dụng ức chế quá trình
chuyển nguyên bào sợi thành tế bào cơ trơn. Ngoài ra, FGF-2 còn thúc đẩy quá trình
lành vết thƣơng, giảm khả năng tạo sẹo bằng cách điều chỉnh sự cân bằng chất nền
ngoại bào. Do đó, FGF-2 đƣợc ứng dụng trong xử lý, ngăn ngừa sự hình thành sẹo lồi
trên da do phẫu thuật [33, 34].
- Điều trị bỏng
Việc điều trị những tổn thƣơng do bỏng gây ra gặp rất nhiều khó khăn so với
những tổn thƣơng khác. Những vết thƣơng do bỏng thƣờng bị nhiễm trùng do vi
tác. Ngoài ra, các yếu tố gây stress của môi trƣờng bên ngoài nhƣ ô nhiễm, tia tử
ngoại… làm đẩy nhanh quá trình lão hóa của da. Sự tác động của tuổi tác và môi
trƣờng dẫn đến làn da bị khô ráp, nhăn nheo cũng nhƣ thay đổi sắc tố. Về mặt mô học,
theo thời gian lƣợng collagen trong da sẽ suy giảm, da sẽ mất dần các nguyên bào sợi
và mạng lƣới mạch máu. Để ngăn ngừa ngừa hiện tƣợng đó, FGF-2 đã đƣợc chứng
minh là có khả năng thúc đẩy sự phát triển của các nguyên bào sợi, hỗ trợ quá trình
tổng hợp collagen, hình thành mạch máu giúp ngăn ngừa và đẩy lùi tiến trình lão hóa
của da [4, 34].
Nhờ có khả năng ngăn ngừa sự lão hóa da mà hiện nay FGF-2 đƣợc ứng dụng rất
nhiều trong công nghệ mỹ phẩm. Một số sản phẩm đã đƣợc thƣơng mại chứa FGF-2
đã đƣợc đƣa ra thị trƣờng chăm sóc sắc đẹp và nhận đƣợc những phản hồi tích cực.
1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli
1.2.1. Giới thiệu chung
Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã thành
công ở vi khuẩn nhƣ hormon somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao ứng
dụng trong công nghiệp dƣợc phẩm và công nghệ sinh học. Hiện nay, Escherichia coli
là chủng chủ đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp do có
những ƣu thế nổi bật về tốc độ tăng trƣởng nhanh chóng, đạt đƣợc mật độ tế bào cao,
phát triển trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền, các đặc tính di truyền đƣợc hiểu biết rõ,
sản lƣợng protein sản xuất cao (có thể lên đến 50%), có nhiều chủng đột biến, nhiều
vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng [22, 30].
Bảng 1.3. Các chủng E. coli thường được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp[9]. AD494
Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất
BL21(DE3)
Bất hoạt protease lon và ompT
BL21 trxB
Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất
bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào. Trong đó, sản xuất protein tái tổ hợp trong
nội bào là chiến lƣợc đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Protein tái tổ hợp tạo ra có thể ở
dạng tan hay không tan (thể vùi), do đó khuyết điểm chủ yếu của chiến lƣợc này là
hình thành protein ở dạng thể vùi không có hoạt tính, đặc biệt là khi biểu hiện vƣợt
mức. Protein mục tiêu sau khi thu nhận phải đƣợc tái gấp cuộn để có hoạt tính. Nhiều
cải tiến đã đƣợc tiến hành nhƣ nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thấp, thay thế các acid
amin, sử dụng các chủng E. coli khác nhau(bảng 1.3), đồng biểu hiện với chaperone
gấp cuộn, thay đổi pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở điều kiện stress…[9].
Vật liệu – Phương pháp
- 28 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
Một khía cạnh khác cần đƣợc quan tâm là sản xuất các protein có cầu nối disulfide
trong tế bào chất của E. coli. Do tế bào chất của E. coli là môi trƣờng có tính
oxy hoá khử thấp, thiếu hệ thống protein DsbA và DsbB để hình thành cầu nối
disulfide hay có cơ chế ngăn chặn sự hình thành cầu nối này nên protein mục tiêu có
thể không có cầu nối disulfide hay có nhƣng cấu hình sai. Hƣớng giải quyết là đồng
biểu hiện DsbA và DsbB giúp tăng khả năng hình thành cầu nối disulfide [9, 30].
1.2.2. Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp
1.2.2.1. Biểu hiện ở tế bào chất
Hầu hết protein đƣợc biểu hiện ở E. coli đều đƣợc thiết kế biểu hiện ở tế bào chất
của tế bào. Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli gặp nhiều khó
khăn nhƣ protein thƣờng đƣợc tạo ra ở dạng không tan, không có hoạt tính sinh học
gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E. coli không có cơ chế thúc đẩy sự hình
thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, hiện nay việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế
bào chất của E. coli vẫn là phƣơng án đƣợc sử dụng phổ biến nhất do mức độ biểu
hiện cao hơn so với các vị trí khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng đơn giản
hơn. Ngoài ra, hiện nay ngƣời ta cũng phát triển nhiều phƣơng pháp nhằm cải thiện
tính tan của protein trong tể bào chất nhƣ đồng biểu hiện các phân tử chapreron; sử
dụng các chủng E.coli đột biến gen trx…[9, 30, 31].
khuyết điểm lớn, lactose vừa là chất cảm ứng vừa là cơ chất cho -galactosidase nên
lƣợng lactose sẽ bị hao hụt dẫn đến phải bổ sung trong quá trình cảm ứng. Ngƣời ta đã
sử dụng các đồng đẳng của lactose để thay thế là IPTG (Isopropyl-β-D-
thiogalactoside). Do không phải là cơ chất của -galactosidase, nên IPTG vẫn đƣợc
duy trì trong quá trình điều hoà. Nhƣ vậy, IPTG là phân tử có khả năng thay thế
lactose trong sự điều hoà operon lac.
Hệ thống cảm ứng bằng IPTG hiện nay rất phổ biến trong sản xuất protein tái tổ hợp
do chất cảm ứng IPTG ổn định, có nhiều loại chủng chủ cũng nhƣ hệ thống vector
đƣợc thiết kế thích hợp cho cảm ứng IPTG. Chủng chủ E. coli BL21(DE3) và hệ thống
vector pET là hệ thống biểu hiện đƣợc sử dụng phổ biến trong biểu hiện protein tái tổ
hợp [3, 24, 31].
Vật liệu – Phương pháp
- 30 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
b. Hệ thống vector pET
Các vector pET đƣợc xây dựng đầu tiên bởi Studier và cộng sự. Những vector pET
hiện nay đƣợc bổ sung thêm nhiều đặc tính mới giúp việc tạo dòng, phát hiện và tinh
chế protein mục tiêu trở nên dễ dàng hơn. Việc lựa chọn một loại vector pET phù hợp
để biểu hiện protein mục tiêu phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trong đó, ba yếu tố quan
trọng cần xét đến là mục tiêu ứng dụng của protein đích, các đặc tính sinh học về
protein này và chiến lƣợc tạo dòng.
Hệ thống vector pET thƣờng đƣợc sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp
trong E. coli. Vector có vùng MCS chứa các enzyme cắt giới hạn giúp tạo dòng gen
mục tiêu vào vector. Vùng MCS đƣợc thiết kế nằm ở vùng hạ lƣu của T7 promoter.
Khi tế bào chủ tạo ra enzyme T7 RNA polymerase và gắn vào T7 promoter gen mục
tiêu nằm ở vùng hạ lƣu của promoter sẽ đƣợc phiên mã, dịch mã và tạo protein tái tổ
hợp tƣơng ứng.
Vì T7 promoter chỉ gắn đặc hiệu với enzyme T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ
thực khuẩn thể nên protein mục tiêu đƣợc điều hòa biểu hiện một cách hiệu quả. Mặt
Gen mục tiêu sẽ đƣợc thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS để đƣợc kiểm soát biểu
hiện bởi T7 promoter. Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trí lac operator và gen lacI
mã hóa cho lac repressor để kiểm soát sự biểu hiện của T7 promoter.
Khi có sự hiện diện của IPTG, IPTG sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí allosteric, làm
protein này thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator. Nhờ đó lac promoter
đƣợc hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 polymerase đƣợc biểu hiện tạo T7 polymerase.
IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET khỏi sự kiểm soát của lac
repressor. Enzyme T7 polymerase tạo thành sẽ gắn vào T7 promoter đã đƣợc hoạt hóa
giúp biểu hiện gen mục tiêu đã đƣợc tạo dòng vào vector (hình 1.8) [3, 16, 24, 31].
1.2.3.2. Hệ thống cảm ứng bởi L - arabinose
Promoter đƣợc sử dụng là p
BAD
với nhân tố kích hoạt AraC. Khi môi trƣờng có
arabinose thì có sự điều hoà dƣơng, ngƣợc lại khi chỉ có glucose thì sự biểu hiện của
operon bị ức chế. Protein AraC hoạt động ở dạng dimer gắn vào 3 vị trí của operon
arabinose là O1, O2, và I. Khi vắng mặt arabinose thì dimer AraC sẽ tiếp xúc với vị trí
O2 nằm trong vùng gen araC, cách promoter araBAD khoảng 210 cặp base. Phần kia
của dimer sẽ tiếp xúc với vị trí O1 trong vùng promoter, do đó hình thành DNA dạng
vòng. Sự phiên mã của promoter AraBAD và araC sẽ bị ức chế bởi cấu hình vòng này.
Khi có mặt arabinose thì chính arabinose sẽ gắn vào dimer araC làm dimer này thay
đổi cấu hình, lúc đó dimer không gắn vào vị trí O2 nữa mà gắn vào vị trí I, nhờ đó
RNA polymerase bắt đầu hoạt động phiên mã.
Đây là một hệ thống điều hoà mạnh, với chất cảm ứng không đắt tiền, trong quá trình
lên men với hàm lƣợng cảm ứng 1% có thể đạt đƣợc sự biểu hiện tối ƣu [31].
1.2.3.3. Hệ thống cảm ứng bởi muối
Vật liệu – Phương pháp
- 32 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
Cảm ứng bởi muối là phƣơng pháp mới đơn giản, hiệu quả có thể áp dụng cho sản xuất
đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (Ion Exchange Chromagraphy), sắc ký ái lực dựa
vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (Affinity Chromagraphy) và sắc ký
tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction chromatography, HIC) dựa vào mức độ
kị nƣớc của protein ở các nồng độ muối khác nhau.
Vật liệu – Phương pháp
- 33 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
Xây dựng một quy trình tinh chế hiệu quả là một trong những yếu tố quyết định thành
công của việc sản xuất protein. Tùy theo yêu cầu về độ tinh sạch, sự cần thiết phải duy
trì hoạt tính protein cũng nhƣ mức độ tạp trong nguồn mẫu ban đầu, các phƣơng pháp
đƣợc sử dụng để tinh chế và sự phối hợp giữa các phƣơng pháp này sẽ khác nhau.
Thông thƣờng, đối với một protein đƣợc sử dụng làm thuốc, quá trình tinh chế đầy đủ
gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn bắt giữ: Đây là bƣớc cô lập nhanh protein mục tiêu khỏi vật liệu
thô ban đầu. Đồng thời, protein đƣợc cô đặc và chuyển qua dung dịch giúp duy trì hoạt
tính protein. Ở bƣớc này, protein thƣờng đƣợc phân tách theo nhóm bằng cách sử dụng
sắc ký ái lực hoặc sắc ký trao đổi ion.
- Giai đoạn tinh chế trung gian: giai đoạn này tập trung vào mục đích phân
tách protein mục tiêu khỏi các thành phần tạp lớn nhƣ nucleic acid, endotoxin, virus và
các protein khác. Giai đoạn này không cần phải tiến hành nhanh do các thành phần tạp
gây ra sự phân hủy và thủy giải protein đã bị loại đi trong giai đoạn trƣớc đó. Tuy nhiên,
các kỹ thuật tinh chế đƣợc sử dụng trong giai đoạn này cần phải có khả năng phân tách
cao. Do vậy, cần phải lựa chọn biện pháp dung ly protein hiệu quả, nhƣ sử dụng gradient
nồng độ hoặc dung ly nhiều bƣớc.
- Giai đoạn tinh chế cuối: Mục đích của giai đoạn này là loại những thành
phần tạp nồng độ thấp và điều chỉnh pH, nồng độ muối cũng nhƣ bổ sung các chất hỗ
trợ để bảo quản protein. Trong giai đoạn này cần phải sử dụng những kỹ thuật tinh chế
có độ phân tách cao để đạt đến độ tinh sạch cần thiết.
Đây là quy trình tinh chế protein đầy đủ, điều đó không có nghĩa là bất cứ protein nào
thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch dung ly bởi vì ion natri sẽ tranh
bám vào cột với các protein có điện tích dƣơng, do đó, những protein mang điện tích
dƣơng đƣợc phóng thích ra ngoài cột lần lƣợt theo độ lớn về điện tích. Trong một số
trƣờng hợp đặc biệt, protein đƣợc dung ly bằng cách thay đổi pH của dung dịch [15,
28].
Hình 1.9. Minh họa sắc ký trao đổi ion [15].
Vật liệu – Phương pháp
- 35 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
1.3.3.2. Sắc ký ái lực (Affinitive chromatography, AC)
Sắc ký ái lực là phƣơng pháp rất hiệu quả, đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc tinh
sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực của protein với một số nhóm hóa học chuyên
biệt. Khi nạp hỗn hợp protein vào cột, protein có khả năng nhận biết một nhóm X hay
dẫn xuất của nó đƣợc gắn trên cột bằng nối cộng hóa trị. Sau đó cột đƣợc rửa để loại
bỏ những protein không tạo đƣợc nối hoặc nối không đặc hiệu, cuối cùng là dung ly
protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hoặc thay đổi điều kiện để làm
giảm lực liên kết (hình 1.10). Kỹ thuật này có thể đƣợc sử dụng trong pha bắt giữ hoặc
tinh chế trung gian. AC có tính đặc hiệu protein nên đây là kỹ thuật tinh chế có độ phân
tách và hiệu suất cao.
Trong kỹ thuật này, protein mục tiêu đƣợc gắn đặc hiệu và thuận nghịch với
ligand tƣơng ứng. Ban đầu, mẫu đƣợc nạp vào dƣới điều kiện cho phép sự gắn đặc
hiệu xảy ra. Những protein không gắn đƣợc với ligand thì bị rửa đi sau đó. Cuối cùng,
protein mục tiêu đƣợc tách ra dƣới điều kiện chuyên biệt bằng cách sử dụng chất gắn
cạnh tranh, hoặc đƣợc tách ra dƣới điều kiện không chuyên biệt bằng cách thay đổi pH
hoặc lực ion. Sau quá trình tinh chế bằng AC, protein thu đƣợc có độ tinh sạch cao và
đƣợc cô đặc [15, 28].
- Erlen 100ml, 250ml, 1000ml, ống đong, bercher, đĩa petri
- Đèn cồn, que cấy, bình tia chứa cồn, nƣớc cất
- Bộ chuyển màng lai (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech)
- Bộ điện di ngang DNA (HORIZON
®
58, Life Technology™, Mỹ) và hộp đèn soi
UV (Hoefer, Mỹ)
- Bộ điện di protein (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech) và bộ nguồn
(Amersham Biosciences)
- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ)
- Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)
- Cột tinh chế Hitrap SP FF 5ml, Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare)
Vật liệu – Phương pháp
- 38 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
- Hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX GX-05-12302 và các thiết bị phụ
trợ nhƣ: máy nén khí, hệ thống nƣớc giải nhiệt…
- Hệ thống tinh chế AKTA (GE Healthcare)
- Máy chụp hình gel (Amersham Biosciences)
- Máy đo nồng độ DNA Nanodrop
- Máy điều nhiệt theo chu kỳ Eppendorf Mastercycler Personal
- Máy đo quang phổ chuyên dụng GeneQuantpro (Amersham Biosciences) dùng
cho DNA, RNA và protein
- Máy đo pH (ORION, Anh)
- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh)
- Máy lắc nƣớc Grant GLS400 (Cambridge, Anh) và thiết bị làm lạnh đi kèm
- Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Nhật)
- Máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator S150 (Stuard Scientific, Anh)
- Máy phá tế bào Model M-110EH-30 Microfluidizer Processor và hệ thống làm
10X(Fermentas, Đức)
b) Dung dịch tách plasmid bằng phương pháp SDS- kiềm
- Dung dịch I: Tris-HCl 25mM; EDTA 10mM; glucose 50mM, pH 8
- Dung dịch II: NaOH 0,2N; SDS 1% (pha trƣớc khi dùng)
- Dung dịch III: CH
3
COOK 3M, pH 4,8
- Chloroform
- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM; EDTA 1M, pH 8,0
- Ethanol 70% và ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Isopropanol lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)
- Sodium acetate 3M (pH 4,8)
c) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt và nối -
Enzyme BamHI, NdeI (Fermentas, Đức)
- Buffer Tango 10X (Fermentas, Đức)
- Buffer ligation 10X (Fermentas, Đức)
- T4 DNA ligase (Fermentas, Đức)
- Nƣớc cất MiliQ
d) Hóa chất tinh chế sản phẩm PCR và sản phẩm cắt
- Chloroform
- Ethanol 70% và ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Isopropanol lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Tris - HCl 0,5M pH 6,8 (giữ ở 4
o
C) - SDS 10%
- 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ ở 4
o
C)
- Ammonium persulphate (APS) (giữ ở 4
o
C)
- TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylene diamine) (giữ ở 4
o
C)
Thành phần gel phân tích (15%) và gel gom đƣợc trình bày nhƣ bảng 2.1.
Bảng 2.1. Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS-PAGE Gel phân tách
Gel gom
Nƣớc cất
2,52ml
1,3ml
Tris-HCl 1,5M pH 8,8
1,75ml
0 ml
Tris-HCl 0,5M pH 6,8
0 ml
0,505ml
Copyright: Tài liệu đại học ©