Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch Streptokinase
tái tổ hợp từ chủng Streptococcus pyogenes
trong E. coli.

Nguyễn Thị Thƣơng

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học
Luận văn ThS Chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Quyền Đình Thi
Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Tổng quan các vấn đề cần nghiên cứu: chứng tắc nghẽn mạch máu;
Streptokinase; Streptococcus pyogenes. Trình bày vật liệu (nguyên liệu và thiết bị)
và phƣơng pháp nghiên cứu (phƣơng pháp vi sinh vật, sinh học phân tử; hóa sinh).
Đƣa ra một số kết quả nghiên cứu: Nhân dòng gên mã hóa mSK-nonhis; Thiết kế
plasmid biểu hiện mSK; Biểu hiện streptokinase nonhis; Tinh sạch streptokinase
nonhis; Hoạt hóa SK

Keywords: Vi sinh vật học; Sinh học; Chủng Streptococus pyogenes

Content
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong xã hội hiện đại, khi nền kinh tế ngày một phát triển cộng với áp lực về công việc và thời
gian khiến cho chế độ ăn của con ngƣời trở nên mất cân đối là một trong những nguyên nhân lớn
dẫn đến bệnh tim mạch, đặc biệt là ở các nƣớc phát triển. Bệnh tim mạch đang là nguyên nhân
gây tử vong số 1 trên thế giới [50]. Trong đó chứng tắc nghẽn mạch máu có thể dẫn tới đột quỵ,
nhồi máu cơ tim thƣờng để lại hậu quả nghiêm trọng hơn.
Trên thị trƣờng hiện nay có một số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu nhƣ Durakinase, Streptase,
Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên đây hầu hết là các sản phẩm của nƣớc ngoài với giá thành
rất đắt.

tính nhƣ tự nhiên với năng suất biểu hiện đạt 25% protein tổng số.
Năm 1995, Ko et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis. Tác giả thay thế trình tự peptide tín
hiệu của sk bằng tín hiệu ompA, sử dụng vector pKK223-3 biểu hiện trong E. coli JM109. Hoạt
tính thu đƣợc đạt 5000 U/ml dịch nuôi cấy sau 12 giờ cảm ứng bằng IPTG. Cũng năm 1995,
Kubo et al đã nghiên cứu hoạt hóa SK tái tổ hợp từ E. coli. Các tác giả xử lý bằng nhiệt độ để tái
cuộn xoắn cấu trúc SK bị biến tính bởi guanidine hydrochloride. Hoạt hóa ở 50°C làm tăng 10%
hoạt tính enzyme và 25% hoạt tính riêng, cao hơn xử lý ở 20°C.
Năm 1997, Avilan et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis và biểu hiện trong E. coli
JM105. SK thu đƣợc giống với dạng tự nhiên. Ba sản phẩm SK thu đƣợc có khối lƣợng phân tử
lần lƣợt tƣơng ứng là 47,5; 45 và 33 kDa.
Năm 1999, Johnsen et al. Nhân dòng sk từ chủng S. uberis NCTC 3858 và đọc trình tự cho thấy
SK này tƣơng đồng khoảng 26% với SK của S. pyogenes và S. equisimilis. Protein suy diễn có
286 amino acid, trong đó peptide tín hiệu dài 25 amino acid. Trình tự amino acid của SK này bị
thiếu các amino acid đầu C so với trình tự amino acid của SK từ chủng S. pyogenes và S.
equisimillis
Năm 1999, Caballero et al. sử dụng vector pQE30 để biểu hiện SK trong E. coli cho hoạt tính
tƣơng đƣơng với SK tự nhiên [10]. Đồng thời Pupo et al. đã biểu hiện nội bào đối với sk từ S.
equisimilis sử dụng vector biểu hiện pTrp. Hiệu suất biểu hiện đạt 15% protein tổng số (thấp hơn
của Estrada). Tuy nhiên SK tái tổ hợp ở dạng hòa tan nên tinh sạch dễ dàng hơn
Năm 2007, Reza et al. đã sử dụng vector pGEX để biểu hiện SK trong E. coli với năng suất biểu
hiện đạt 50% protein tổng số. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng 3 dòng tế bào E. coli BL21 để biểu
hiện là E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) plysS, E. coli BL21 CodonPlus. Các dòng tế
bào này thiếu hụt các sản phẩm gene protease trong bào tƣơng nhƣ Lon, OmpT, DegP và HtpR
với mục đích tạo năng suất biểu hiện cao cho protein hội nhập. Kết quả cho thấy tế bào E. coli
BL21 (DE3) physS cho năng suất cao nhất đạt 15000 U/ml dịch nuôi cấy.
Năm 2008, Babu et al. Tinh sạch SK đạt độ sạch là 99%. Các tác giả cũng nghiên cứu hoạt hóa
SK sau khi xƣ lý bằng guanidine. Theo đó một số chất hoạt động bề mặt không gây ion hóa nhƣ
Trixton X-100, Tween 20, Tween 80 có tác dụng hoạt hóa SK. Việc bổ sung 10% glycerol làm
tăng độ bền của enzyme
Năm 2009, Goyal et al. đã nghiên cứu phƣờng pháp nuôi lắc có bổ sung dƣỡng chất kết hợp với

Năm 2006, Sriraman et al biểu hiện SK trong L. lactic với promoter P170. SK thu đƣợc bị thủy
phân do tác động của môi trƣờng nuôi cấy. Ở môi trƣờng nuôi cấy có pH thấp, có glucose, acid
lactic sẽ tích tụ gây đáp ứng kháng acid cho tế bào làm giảm khả năng sản xuất streptokinase.
Khi cải thiện môi trƣờng nuôi cấy, tăng pH và nồng độ phosphate ban đầu làm tăng khả năng
tổng hợp SK lên 2,5 lần
Tại Việt Nam
Năm 2001-2002, Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã thực hiện một nhiệm vụ nghiên
cứu khoa học và phát triển công nghệ hằng năm của Sở Khoa học, mã số 240: “Nghiên cứu ứng
dụng điều trị bệnh nhồi máu cơ tim cấp bằng Streptokinase tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng”
(Sở khoa học và Công nghệ Hải Phòng).
Năm 2003, Lê Văn Nam và Lê Thị Cẩm Dung đã nghiên cứu cách điều trị khối huyết trong tai
biến mạch máu não. Các tác giả đã đƣa ra công thức và phác đồ điều trị khối huyết. Các thuốc
làm phân hủy huyết khối đƣợc thành lập trong lòng mạch máu, các thuốc này đa số hoạt động
theo cở chế kích hoạt plasmin, plasmin sẽ phân giải huyết khối. Các thuốc làm tan huyết khối
gồm streptokinase, urokinase, scu-PA, rTPA.
Năm 2004, Trần Minh Tâm et al. đã thực hiện đề tài nghiên cứu:“Điều trị tiêu sợi huyết bằng
streptokinase trong nhồi máu cơ tim thấp”. Tác giả nên nhận xét bƣớc đầu về sử dụng thuốc
streptokinase để điều trị tiêu sợi huyết cho 27 ca bị nhồi máu cơ tim ở Bệnh viện đa khoa tỉnh
Phú Yên từ 5/2001 đến 12/2004 cho tỷ lệ thành công là 63%. Theo dõi trong 30 ngày, bệnh nhân
phục hồi tốt, ít biến chứng, chi phí điều trị chấp nhận đƣợc.
Các nghiên cứu về các chất có bản chất tƣơng tự nhƣ nattokinase, lumbrokinase cũng rất hạn
chế.
II. PHƢƠNG PHÁP
- Các phƣơng pháp vi sinh vật.
- Các phƣơng pháp sinh học phân tử.
- Các phƣơng pháp hóa sinh.
IV. KẾT QUẢ.
1. Nhân dòng thành công gene mã hóa streptokinase nonhis từ DNA tổng số
của chủng Streptococcus pyogenes DT7.
2. Biểu hiện gene msk-nonhis với vector biểu hiện pET21a(+) trong tế bào E.

8. Bajaj AP and FJ Castellano, Activation of human plasminogen by equimolar levels of
streptokinase. J Biol Chem, 1977. 252: p. 492–498.
9. Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-254.
10. Burket MW, MR Smith, TE Walsh, PS Brewster, and TD Fraker, Relation of effectiveness of
intracoronary thrombolysis in acute myocardial infarction to systemic thrombolytic state. Am
J Cardiol, 1985. 55: p. 1453-8.
11. Caballero AR, R Lottenberg, and K Johnston, Cloning, expression, sequence analysis, and
characterization of streptokinase secreted by porcine and equine isolates of Streptococcus
equisimilis. Infect Immun, 1999. 67(12): p. 6478-6486.
12. Christensen LR, Streptococcal fibrinolysin: a proteolytic reaction due to serum enzyme
activated by stretococcal fibrinolysin. J Gen Physiol, 1945. 28: p. 363-383.
13. Colin DM and L Dejan, Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to
2030. PloS Med, 2006. 3(11): p. 442.
14. Craven LL, Acetylsalicylic acid: possible preventive of coronary thrombosis. Ann West Med
Surg, 1950. 4: p. 95-99.
15. Dao ML and JJ Ferretti, Streptococcus Escherichia coli shuttle vector pSA3 and its use in the
cloning of streptococcal genes. Appl Environ Microbiol, 1985. 49(1): p. 115-119.
16. Estrada MP, L Hernandez, A Perez, P Rodriguez, R Serrano, R Rubiera, A Pedraza, G
Padron, W Antuch, DLJ Fuente, and L Herrera, High level expression of streptokinase in
Escherichia coli. Bio Technology, 1992. 10: p. 1138-1142.
17. Fletcher AP, N Alkjaersig, A Davies, M Lewis, J Brooks, W Hardin, W Landau, and ME
Raichle, Blood coagulation and plasma fibrinolytic enzyme system pathophysiology in
stroke. Stroke, 1976. 7: p. 337-348.
18. Fletcher AP, N Alkjaersig, and S Sherry, The maintenance of a sustained thrombolytic state
in man. I. Induction and effects. Clin Invest J 1959. 38: p. 1096-1110.
19. Fletcher AP, N Alkjaersig, FE Smyrniotis, and S Sherry, Treatment of patients suffering
from early myocardial infarction with massive and prolonged streptokinase therapy. Trans
Assoc Am Physicians, 1958. 71: p. 287-296.
20. Fletcher AP, S Sherry, N Alkjaersig, FE Smyrniotis, and S Jick, The maintenance of a

synthesis of fluorescence energy transfer dye-labeled primers and their application for DNA
sequencing and analysis. Anal Biochem, 1995. 231(1): p. 131-40.
33. Klessen C and H Malke, Expression of the streptokinase gene from Streptococcus equisimilis
in Bacillus subtilis. J Basic Microbiol, 1986. 26(2): p. 75-81.
34. Ko JH, DK Park, IIC Kim, SH Lee, and SM Byun, High level expression and secretion of
streptokinase in Escherichia coli. Biotechnol Lett 1995. 17: p. 1019-1024.
35. Kubo M and A Nishi, Improved method for prourokinase refolding with inclusion body from
recombinant Escherichia coli. J Ferment Bioeng, 1995. 80(6): p. 622-624.
36. Kumar R and J Singh, Expression and secretion of a prokaryotic protein streptokinase
without glycosylation and degradation in Schizosaccharomyces pombe. Yeast, 2004. 21(16):
p. 1343-1358.
37. Kunamneni A, TT Abdelghani, and P Ellaiah, Streptokinase the drug of choice for
thrombolytic therapy. J. Thromb Thrombolysis, 2007. 23: p. 9-23.
38. Kuppusamy M, VK Srinivas, S Lahiri, K Ella, and GS Khatri, Recombinant streptokinase,
2006, Bharat Biotech International, Ltd.: USA. p. 1-14.
39. Lizano S and KH Johnston, Structural diversity of streptokinase and activation of human
plasminogen. Infect Immun, 2005. 73(7): p. 4451-4453.
40. Malke H and JJ Ferretti, Streptokinase: cloning, expression and excretion by Escherichia
coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1984. 81: p. 3557-3561.
41. Mathers CD, T Boerma, and DM Fat, Global and regional causes of death. Br Med Bull.,
2009. 92: p. 7-32.
42. Nikhil S and B Amit, A history of streptokinase use in acute myocardial infarction. Tex
Heart Inst J, 2007. 34(3): p. 318-27.
43. Pratap J, G Rajamohan, and KL Dikshit, Characteristics of glycosylated streptokinase
secreted from Pichia pastoris: enhanced resistance of SK to proteolysis by glycosylation.
Appl Microbiol Biotechnol, 2000. 53(4): p. 469-475.
44. Pupo E, BA Baghbaderani, V Lugo, J Fernandez, R Paez, and I Torrens, Two streptokinase
genes are expressed with different solubility in Escherichia coli W3110. Biotechnol Lett,
1999. 21: p. 1119-1123.
45. Reddy KN, Streptokinase-biochemistry and clinical application. Enzyme, 1988. 40: p. 79-89.

58. Tillett WS, AJ Johnson, and WR McCarty, The intravenous infusion of the streptococcal f
ibrinolytic principle (streptokinase) into patients. J Clin Invest, 1955. 34: p. 169-185.
59. Tollefsen D, Blood coagulation. http://tollefsen.wustl.edu/projects/ coagulation, 2009.
60. Vellanki RN, R Potumarthi, and LN Mangamoori, Constitutive expression and optimization
of nutrients for streptokinase production by Pichia pastoris using statistical methods. Appl
Biochem Biotechnol, 2009. 158(1): p. 25-40.
61. Vermeer F, ML Simoons, FW Bar, JGv Tijssen, RT Domburg, PW Serruys, and e al., Which
patients benef it most from early thrombolytic therapy with intracoronary streptokinase.
Circulation, 1986. 74: p. 1379-1389.
62. Wakeham N, S Terzyan, P Zhai, LA Loy, J Tang, and XC Zhang, Effects of deletion of
streptokinase residues 48-59 on plasminogen activation. Protein Eng, 2002. 15: p. 753-761.
63. Walley T, Y Dundar, R Hill, and R Dickson, Superiority and equivalence in thrombolytic
drugs: an interpretation. QJM, 2003. 96(2): p. 155-160.
64. Walter F, M Siegel, and H Malke, Nucleotide sequence of the streptokinase gene from a
group-G Streptococcus. Nucleic Acids Res, 1989. 17(3): p. 1261-1262.
65. Wang X, J Tang, B Hunter, and XC Zhang, Crystal structure of streptokinase beta-domain.
FEBS Lett, 1999. 459: p. 85-89.
66. Wong SL, R Ye, and S Nathoo, Engineering and production of streptokinase in a Bacillus
subtilis expression-secretion system. Appl Environ Microbiol, 1994. 60(2): p. 517-523.