- 1 -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

NGUYỄN HỮU QUÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TỰ NHIÊN
VÀ BIỂU HIỆN CHITINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG
NẤM LECANICILLIUM LECANII
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Có thể tìm hiểu luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái
Nguyên, Thư viện Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và
Thư viện Quốc gia Việt Nam. - 3 -
CÁC CÔNG TRÌNH
CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Huu Quan Nguyen, Dinh Thi Quyen, Sy Le Thanh Nguyen, Van Hanh Vu
(2015), “An extracellular antifungal chitinase from Lecanicillium lecanii:
purification, properties and application in biocontrol against plant
pathogenic fungi”, Turkish Journal of Biology, 39, tr. 6-14.
2. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi (2014), “Cloning and
expression of a gene encoding chitinase from Lecanicillium lecanii 43H
in Pichia pastoris”, In: the 3
rd
Academic conference on natural science
for master and PhD students from Asean countries, tr. 438-445.
3. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi, Phạm Thị Huyền
(2013), “Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ nấm
Lecanicillium lecanii 43H”, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn
quốc, Nxb Khoa học Tự nhiên & Công nghệ,1, tr. 426-430.
4. Vũ Văn Hạnh, Nguyễn Hữu Quân, Quyền Đình Thi (2012), “Nghiên cứu
độc tính của nấm kí sinh côn trùng trên rệp hại ngô Aphids maydis để sản
xuất thuốc trừ sâu sinh học”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 50(3D), tr. 1009-1015.
5. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2012), “Nghiên cứu
độc tính và đặc tính sinh học của chủng nấm Lecanicillium đối với rệp

Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như
tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease)
của nấm. Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme
càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh,
tiết kiệm được thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một
lượng lớn enzyme đặc biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất
cần thiết.
Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl
glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết
β-1,4-glucoside giữa C
1
và C
4
của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp
nhau trong chitin. Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông
nghiệp, y học. Từ thực tế trên, việc nghiên cứu đặc tính chitinase và qui
trình tạo ra chitinase cao góp phần làm tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử
nấm là rất cần thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận
án: “Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase
tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tinh sạch và phân tích được đặc tính hóa lý của chitinase chiết rút từ
nấm L. Lecanii và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong nấm men Pichia

- 5 -
pastoris X33 phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt rệp và nấm hại cây
trồng.
2.2. Mục tiêu cụ thể

cho hoạt tính cao. Tinh sạch được chitinase tái tổ hợp và đánh giá được một số

- 6 -
tính chất lý hóa cơ bản. (iii) Chứng minh được rChit có khả năng làm suy
giảm lớp vỏ chitin của rệp.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
5.1. Về khoa học
i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương
pháp tinh sạch chitinase, các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase và
khả năng diệt nấm bệnh của chitinase từ chủng nấm L. lecanii.
ii) Cung cấp những thông tin về gen mã hóa chitinase ở chủng nấm L.
lecanii 43H, chitinase tái tổ hợp và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính rChit
và khả năng thủy phân lớp vỏ rệp của rChit.
iii) Cung cấp thông tin về khả năng diệt rệp của bào tử và đặc điểm sinh học
của nấm L. lecanii.
5.2. Về thực tiễn
Những kết quả đánh giá toàn diện từ khâu lựa chọn điều kiện sinh tổng
hợp chitinase, tinh sạch và xác định tính chất lý hóa, khả năng diệt nấm bệnh
và rệp của chitinase, cũng như quá trình nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa
chitinase làm căn cứ để đánh giá và ứng dụng của chitinase với bào tử nấm
trong quá trình tạo chế phẩm sinh học diệt rệp của chủng nấm L. lecanii.
6. Cấu trúc luận án: Luận án có 114 trang (cả tài liệu tham khảo) được chia
thành các chương, phần: Mở đầu 3 trang, chương 1: Tổng quan tài liệu 27
trang; chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18 trang; chương 3: Kết
quả nghiên cứu và thảo luận 43 trang; kết luận và đề nghị 1 trang; các công
trình công bố liên quan đến luận án 1 trang; Tài liệu tham khảo 18 trang; phụ
lục 2 trang. Luận án có 12 bảng, 38 hình và tham khảo 151 tài liệu.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo 13 tài liệu tiếng Việt và 138 tài liệu tiếng Anh để

chitinase trong thực vật giúp cây trồng có khả năng chống lại được một số
nấm bệnh.
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và hóa chất
Nấm L. lecanii do Phòng Các chất chức năng Sinh học, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
Vi khuẩn E. coli DH5α được sử dụng để nhân dòng gen và tế bào nấm
men P. pastoris X33 dùng để biểu hiện gen. Vector pJET1.2/blunt để nhân
dòng và pPICZαA được dùng để biểu hiện gen Chit.
Rệp (Myzus persicae) được thu thập từ ruộng cải ở khu vực thuộc thành
phố Thái Nguyên.
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm đều mới, hiện đại và có độ
chính xác cao thuộc Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hóa chất trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết. Các dung dịch và đệm
dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm
chuẩn. - 8 -

2.2. Phương pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các nhóm phương pháp nghiên cứu như: (1) Phương
pháp nuôi cấy; (2) Xác định hoạt tính chitinase; (3) Tinh sạch và nghiên cứu
ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ bền của chitinase tự
nhiên và tái tổ hợp; (4) Phương pháp sinh học phân tử; (5) Phương pháp thử
nghiệm khả năng ức chế rệp, nấm bệnh của chitinase và bào tử; (6) Phương
pháp phân tích, xử lý số liệu.
2.2.1. Nhóm các phương pháp nuôi cấy
Hoạt hóa chủng nấm; nuôi cấy nấm thu sinh khối; nuôi cấy vi khuẩn E. coli,

2.2.6. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel và chương trình DNAStar.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc, kiểm tra và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ
nấm L. lecanii
3.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao
Trong tự nhiên, khả năng sinh tổng hợp chitinase từ các chủng nấm trong
cùng một loài là khác nhau. Do đó, quá trình sàng lọc, lựa chọn ra một
chủng nấm L. lecanii có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất là rất cần
thiết.
Kết quả khảo sát các chủng nấm L. lecanii nhận thấy, hoạt tính chitinase
từ chủng 43H sinh ra là cao nhất (đạt 0,449 U/ml), tiếp theo là chủng 1039
(đạt 0,381 U/ml) và chủng 1036 cho hoạt tính thấp nhất (đạt 0,300 U/ml).
Chủng nấm L. lecanii 43H được chọn để tổng hợp, tinh sạch, đánh giá tính
chất của chitinase tự nhiên và nhân dòng, biểu hiện chitinase tái tổ hợp.
3.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA
Trong bảo quản và giữ giống, chủng nấm L. lecanii 43H rất dễ bị nhiễm
các loài nấm khác có hình dạng và màu sắc tương tự. Để khảng định chắc
chắn chủng nấm này chính là L. lecanii, chúng tôi đã sử dụng đoạn gen 28S
rRNA để kiểm tra sự thuần khiết của chủng giống phục vụ cho các nghiên
cứu tiếp theo. Đoạn gen 28S rRNA của chủng nấm L. lecanii 43H đã được
chúng tôi phân lập bằng PCR từ DNA hệ gen sử dụng cặp mồi NL1 và NL4.
Sau khi điện di kiểm tra, sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 600
bp (Hình 3.2A). Sản phẩm PCR sau đó được gắn trực tiếp vào vector
pJET1.2/blunt hình thành plasmid tái tổ hợp pJ28S và biến nạp vào tế bào vi
khuẩn E. coli DH5. Các dòng biến nạp được nuôi cấy để tách plasmid.
Plasmid tái tổ hợp pJ28S có kích thước lớn hơn đối chứng (Hình 3.2B).
Plasmid tái tổ hợp được chọn lọc và cắt kiểm tra bằng XhoI và XbaI. Sản
phẩm cắt kiểm tra trên gel agarose 0,8% có 2 băng DNA kích thước khoảng
3 kb tương ứng với vector pJET1.2/blunt và băng còn lại có kích thước

Chủng L. lecanii 43H bắt đầu sinh chitinase sau 48 giờ nuôi (hoạt tính
đạt 0,323 U/ml), hoạt tính tăng khi tăng thời gian lên men và đạt cực đại sau
144 giờ, hoạt tính đạt 0,416 U/ml. Khi thời gian tiếp tục tăng thì sinh tổng
hợp enzyme lại giảm, hoạt tính còn 0,247 U/ml sau 240 giờ (Hình 3.4A).
A B- 11 -
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian (A) và nhiệt độ (B) nuôi cấy
đến khả năng sinh tổng hợp chitinase

3.1.3.2. Nhiệt độ nuôi cấy
Chủng nấm L. lecanii 43H sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở 28°C (đạt
0,433 U/ml) khi khảo sát nhiệt độ lên men từ 28-37°C (Hình 3.4B).
3.1.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
A
B
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù (A) và nguồn nitơ (B)
đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
PT: pepton, CT: cao thịt, CS: casein, BĐT: bột đậu tương, UR: urê, Na:
NaNO
3
, KN: KNO
3
, NO: (NH
4
)
2
SO
4

B

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A) và pH nuôi cấy (B) lên
khả năng sinh tổng hợp chitinase
Glu: glucose, BN: bột ngô, LN: lõi ngô, BM: bã mía, VL: vỏ lạc, VCP: vỏ cà
phê, TC: trấu cám, CMC: cacborxyl methyl cellulose, VQ: vỏ quýt, TB: tinh
bột, BS: bã sắn, CNM: cao nấm men, BĐT: bột đậu tương
3.1.3.7. Môi trường thay thế
Từ những kết quả trên, chúng tôi lựa chọn môi trường từ các nguyên liệu
có sẵn trong tự nhiên bằng cách giữ nguyên các thành phần khoáng trong
môi trường MT, thay cao nấm men bằng bột ngô với nồng độ 0,5%, nồng độ
chitin huyền phù là 0,75%. Khả năng sinh tổng hợp chitinase trong môi
trường thay thế tăng 1,63 lần so với môi trường MT.
3.2. Tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L.
Lecanii 43H
3.2.1. Tinh sạch chitinase
Hoạt tính chitinase đạt 92,11 U/mg protein sau khi tủa với muối
ammonium sulphate 65%, độ sạch 1,4 lần và hiệu suất thu hồi đạt 15,7%.
Chitinase sau khi tủa với muối ammonium sulphate được đưa qua cột
DEAE-Sephadex A-50. Chitinase đã được tinh sạch với độ sạch 2,5 lần và
hiệu suất thu hồi đạt 1,9%. Enzyme tinh sạch này có hoạt tính riêng đạt
167,5 U/mg (Bảng 3.1) và chỉ ra một băng protein duy nhất trên bản gel khi
nhuộm bằng AgNO
3
0,1%, khối lượng phân tử của protein này khoảng 33
kDa (Hình 3.7A). Dịch chitinase trước tinh sạch và các phân đoạn qua cột
có hoạt tính được định tính trên đĩa thạch có chứa chitin huyền phù 0,5%,

- 13 -
các giếng đều xuất hiện vòng phân giải chitin màu trắng sau khi nhuộm bằng

B
Hình 3.7. Hình ảnh
điện di SDS-PAGE của
chitinase từ chủng nấm
L. lecanii 43H (A) và
hoạt tính chitinase của
các phân đoạn trên đĩa
thạch có bổ sung chitin
huyền phù 0,5% (B)
Giếng 1: enzyme thô, giếng 2 và 4: enzyme tủa bằng muối ammonium
sulphate 65%, giếng 3; 5-9 ứng với các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex
A-50, M: chỉ thị phân tử.
3.2.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H
3.2.2.1. Xác định nhiệt độ và pH thích hợp
Chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H hoạt động ở dải nhiệt độ rộng từ
20-70C. Hoạt tính chitinase tăng dần từ 185,1 U/mg ở 20°C đến tối đa
663,9 U/mg ở 40°C và giảm dần đến 64,5 U/mg ở 70°C (Hình 3.8A).
Chitinase này cũng hoạt động ở dải pH rộng từ 3,5 đến 8,0. Hoạt tính
chitinase tăng dần từ 61,7 U/mg ở pH 3,5 đến tối đa 568,2 U/mg ở pH 6,0 và
giảm xuống đến 436,4 U/mg ở pH 7,5 (Hình 3.8B).
A B- 14 -
Hình 3.8. Biểu đồ nhiệt độ (A) và pH tối ưu (B) của chitinase
3.2.2.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase
Chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H bền ở nhiệt độ 30, 37 và 40C sau
khi ủ trong 8 giờ và hoạt tính enzyme duy trì trên 80%. Hoạt tính chitinase
duy trì trên 40% sau khi ủ trong 60 giờ ở 30C và cao hơn ở 37 và 40C.
Hoạt tính chitinase giảm đáng kể sau khi ủ trong 84 giờ và mất hoạt tính ở

2+
ở nồng độ 5 và 15 mM
làm tăng hoạt tính chitinase từ 44-126%. Trong khi việc bổ sung Ag
+
, Hg
2+
,
Al
3+
ở 3 nồng độ khảo sát làm giảm mạnh hoạt tính chitinase xuống còn một
nửa so với hoạt tính ban đầu (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính chitinase
% hoạt tính tương đối của chitinase ở các nồng độ Ion kim loại và
EDTA
5 mM 10 mM 15 mM
Ag
+
72,0 ± 2,3 56,0 ± 0,0 58,0 ± 1,4
Al
3+
62,0 ± 1,6 67,0 ± 4,0 56,0 ± 0,0
Ba
2+
113,0 ± 0,1 122,0 ± 4,6 156,0 ± 18,7
Ca
2+
115,0 ± 2,5 98,0 ± 4,8 166,0 ± 6,1
Cu
2+
130,0 ± 0,7 142,0 ± 8,7 156,0 ± 14,1

tăng hoạt tính chitinase lên tới 25%. Trong khi, những chất tẩy rửa còn lại ở
các nồng độ khác làm giảm hoạt tính chitinase so với đối chứng. Đặc biệt,
việc bổ sung SDS 0,5-1,5% làm giảm đến một phần ba hoạt tính và ở nồng
độ cao hơn 2,0% hoạt tính chitinase bị ức chế hoàn toàn (Hình 3.10A).
A B
Hình 3.10. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của chất tẩy rửa (A) và dung môi hữu
cơ (B) của chitinase
CT: đối chứng; TW80: Tween 80, TW20: Tween 20, TX100: Triton X100,
TX114: Triton X114; MeOH: methanol, IsOH: isopropanol, EtOH: ethanol,
Acet: acetone, BtOH: n-butanol.

3.2.2.5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính chitinase
Các dung môi hữu cơ đã được sử dụng cho việc hòa tan các chất kị nước
trong phản ứng enzyme, do đó chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của các
dung môi hữu cơ khác nhau đối với enzyme. Việc bổ sung các dung môi
hữu cơ methanol, acetone ở nồng độ từ 10-30% làm ức chế nhẹ hoạt tính
chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H, hoạt tính chitinase duy trì từ 89-95%.
Hoạt tính chitinase giảm mạnh khi ủ chitinase với các dung môi hữu cơ

- 16 -
isopropanol, ethanol và butanol ở nồng độ từ 10-30%, đặc biệt là n-butanol
ở nồng độ 20% làm hoạt tính chỉ duy trì 37% so với đối chứng (Hình
3.10B).
3.2.2.6. Động học của phản ứng enzyme
Để đánh giá tính đặc hiệu của chitinase với cơ chất, hoạt tính chitinase
được xác định với chitin huyền phù ở các nồng độ khác nhau, và mối quan
hệ giữa 1/[S] và 1/V được thiết lập để tính giá trị K
m
và V
max

- 17 -
nấm L. lecanii trên GenBank cho thấy gen mã hóa Chit từ nấm L. lecanii
43H có chứa 3 đoạn intron xen kẽ 4 đoạn exon. Kích thước của 4 đoạn exon
lần lượt là 140, 99, 50 và 980 pb và 3 đoạn intron lần lượt là 57, 51 và 52
bp. Trình tự gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H được đăng kí
trong GenBank với mã số JX665045. Trình tự đoạn gen Chit từ DNA của
chủng nấm L. lecanii 43H có độ tương đồng 99,9% so với nấm V. lecanii
(mã số GenBank là DQ412944.1).

Hình 3.12. Kết quả nhân dòng
gen Chit từ DNA hệ gen
Giếng M: marker, giếng 1: sản
phẩm PCR từ khuôn DNA,
giếng 2: pJET1.2/blunt, giếng 3:
pJEChit, giếng 4: sản phẩm căt
pJEChit bằng EcoRI và XbaI.

Để loại bỏ các intron trước khi đưa vào vector biểu hiện, gen Chit được
khuếch đại sau phản ứng RT-PCR từ mRNA. RNA tổng số của chủng nấm
L. lecanii 43H được dùng làm khuôn thực hiện phản ứng RT-PCR tạo
cDNA. Sản phẩm PCR từ khuôn cDNA được điện di trên gel agarose, có
kích thước ~1,3 kb đúng như lý thuyết. Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp
vào vector pJET1.2/blunt tạo plasmid tái tổ hợp pJEChit1 và biến nạp vào E.
coli DH5. Plasmid pJEChit1 thu được có kích thước lớn hơn đối chứng.
Sản phẩm cắt pJEChit1 cho 2 băng tương ứng với cDNA gen Chit1 (~1,3
kb) và pJET1.2/blunt (~3 kb) (Hình 3.15).
Trình tự cDNA gen Chit sau khi được giải trình tự có chiều dài 1269
nucleotide tổng đúng bằng kích thước của 3 đoạn exon từ gen DNA hệ gen.
Như vậy, cDNA gen Chit mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii dài
1269 nucleotide (bao gồm cả mã mở đầu và kết thúc), thuộc họ glycosyl

sốc nhiệt. Plasmid pPIChit có kích thước lớn hơn, nên nằm cao hơn so với
pPICZαA (Hình 3.17A). Plasmid pPIChit tinh sạch được cắt bằng enzyme
EcoRI và XbaI cho hai băng là vector pPICZαA (~3,6 kb) và cDNA gen
Chit (1269 bp) (Hình 3.17B).

Hình 3.17. Kết quả thiết kế cấu
trúc vector biểu hiện pPChit
Plasmid pPIChit (1), plasmid
pPICZαA (ĐC), sản phẩm cắt
pPIChit với EcoRI và XbaI (2),
sản phẩm cắt pPIChit với PmeI
(3), Marker 1kb (M)- 19 -
Plasmid pPIChit được đọc trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu hiện trước
khi biến nạp và biểu hiện ở nấm men P. pastoris X33. Kết quả đọc trình tự
cho thấy cấu trúc của vector biểu hiện đúng khung đọc, cDNAgen Chit chèn
vào đúng vị trí mong muốn, đủ điều kiện để đưa vào biểu hiện trong nấm
men P. pastoris X33.
3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris
3.4.2.1. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris X33/pPChit
Plasmid tái tổ hợp pPIChit được cắt mở vòng bằng PmeI thu được 1 băng
có kích thước ~5,0 kb (ứng với kích thước của vecor pPICZαA và cDNA
gen Chit) (Hình 3.17C), sau đó được biến nạp vào genome của nấm men P.
pastoris X33 với mục đích tạo được chủng tái tổ hợp biểu hiện rChit hiệu
quả, bền và ổn định đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
Các dòng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường YPG bổ sung zeocin
qua đêm, tách DNA, sau đó PCR với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra. Một số
khuẩn lạc (1-4, 6-11) (Hình 3.18) có kích thước tương ứng với cDNA gen

hợp rChit của chủng tái tổ hợp
khi được cảm ứng ở các nồng
độ methanol khác nhau
A. Hoạt tính rChit và động thái
sinh trưởng

B. Điện di đồ kiểm tra protein
trong dịch ngoại bào
Giếng M: marker, giếng 1-5
ứng với nồng độ methanol lần
lượt là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5
3.4.2.5. Lựa chọn thời gian nuôi biểu hiện
Hoạt tính rChit cao nhất sau 96 giờ nuôi (đạt 1,11 U/ml) và giảm dần ở
120 giờ (đạt 1,05 U/ml) (Hình 3.20A). Trên điện di đồ protein tổng số, băng
45 kDa đậm dần theo thời gian nuôi (Hình 3.20B).A B

Hình 3.20. Khả năng sinh tổng
hợp rChit ở các khoảng thời
gian khác nhau
A. Hoạt tính rChit và động thái
sinh trưởng
B. Điện di đồ kiểm tra protein
trong dịch ngoại bào
Giếng M: marker, giếng 1-5
ứng với thời gian 24; 48; 72; 96
và 120 giờ
3.4.3. Tinh sạch rChit
Hình 3.21. Hình ảnh điện di SDS-
PAGE của rChit tinh sạch từ nấm
men P. pastoris X33
Giếng DN: dịch nổi, giếng LC: dịch
lên cột DEAE-Sephadex A50,
giếng 11-14, 16-18: ứng với các
phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex
A50 có hoạt tính chitinase lần lượt
là 11-14, 16-18. giếng M: marker.

3.4.4. Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P. pastoris X33
3.4.4.1. Xác định nhiệt độ và pH thích hợp của rChit
rChit từ nấm P. pastoris X33 hoạt động ở dải nhiệt độ rộng từ 20-65°C.
Hoạt tính chitinase tăng dần từ 15,79 U/mg protein ở 20°C đến tối đa 23,85
U/mg ở 40°C và giảm dần xuống 9,24 U/mg protein ở 65°C (Hình 3.22A). Ở
dải pH khảo sát, rChit bị mất hoạt tính hoàn toàn ở pH 3,5-4,0. Hoạt tính
chitinase tăng dần từ 12,53 U/mg protein ở pH 4,5 đến tối đa 18,78 U/mg
protein ở pH 5,5 và giảm xuống đến 11,85 U/mg protein ở pH 8,0 (Hình 3.22B).
A B

- 22 -
Hình 3.22. Đồ thị nhiệt độ tối ưu (A) và pH tối ưu (B) của rChit
3.4.4.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit
Hoạt tính rChit giảm không đáng kể ở 30 và 35°C sau 20 giờ ủ, hoạt tính
duy trì trên 90%. Trong khi ở 40°C, hoạt tính rChit chỉ còn 40% (Hình
3.23A). Ở pH 6,0 hoạt tính rChit còn 80% sau16 giờ ủ. Trong khi, ở dải pH
7,0-8,0 hoạt tính rChit mất hoàn toàn sau 4 giờ ủ (Hình 3.23B). Như vậy,
rChit bền ở dải nhiệt độ dưới 35°C và pH 6,0.

2+
và
EDTA ở cả 3 nồng độ khảo sát đều làm giảm hoạt tính rChit, hoạt tính giảm
mạnh ở nồng độ 15 mM (hoạt tính chỉ còn 27%) (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit
% hoạt tính tương đối của chitinase ở nồng độ
Ion kim loại và
EDTA
5 mM 10 mM 15 mM
K
+
99,0 ± 0,2 99,0 ± 0,2 100,0 ± 0,2
Zn
2+
99,0 ± 2,7 99,0 ± 2,7 96,0 ± 0,4
Ni
2+
99,0 ± 1,9 99,0 ± 1,9 87,0 ± 2,1
Ca
2+
99,0 ± 2,0 99,0 ± 2,0 121,0 ± 9,0
Ba
2+
96,0 ± 0,9 96,0 ± 0,9 102,0 ± 3,1
Mg
2+
79,0 ± 5,0 73,0 ± 4,3 59,0 ± 4,4
Mn
2+
85,0 ± 3,1 101,0 ± 7,0 105,0 ± 1,9

ở nồng độ 15 mM lại xúc tác hoạt
tính rChit, cao hơn so với ở nồng độ 5 mM.

3.4.4.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ
Việc bổ sung acetone 10% làm tăng mạnh hoạt tính rChit lên đến 20%.
Trong khi, bổ sung methanol, isopropanol, ethanol 10% và n-butanol 20%
cho thấy một sự thay đổi nhỏ lên hoạt tính ban đầu. Đặc biệt, hoạt tính rChit
chỉ còn lại 38-60% so với hoạt tính ban đầu khi rChit được xử lý với các
dung môi hữu cơ ở nồng độ 30% (Hình 3.24A).

3.4.4.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa
Các chất tẩy rửa Tween 80; Tween 20 0,5-2,0% và Triton X114 0,5%
làm tăng hoạt tính rChit so với đối chứng, cao nhất là Tween 80 1,0% làm
tăng hoạt tính lên 13%. Trong khi, bổ sung Triton X100 0,5-2,0% và Triton
X114 1,0-2,0% làm giảm nhẹ hoạt tính rChit so với đối chứng. Đặc biệt, khi
bổ sung SDS 0,5-2,0%, hoạt tính rChit bị ức chế mạnh, hoạt tính duy trì từ
27-40% so với ban đầu (Hình 3.24B).
A B

Hình 3.24. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ (A) và chất tẩy rửa (B) lên hoạt
tính rChit
CT: đối chứng; TW80: Tween 80, TW20: Tween 20, TX100: Triton X100,
TX114: Triton X114; MeOH: methanol, IsOH: isopropanol, EtOH: ethanol,

- 24 -
Acet: acetone, BtOH: n-butanol
3.4.4.6. Động học của rChit
Giá trị Km và Vmax của rChit tinh sạch từ nấm men P. pastoris X33 là
0,77 mg chitin huyền phù/ml và 1,33 U/mg protein.
3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và bào

của rệp. Lượng đường N-acetyl glucosamine giải phóng khi xử lý rệp với
chitinase được xác định là 32,5 μg/ml. Quan sát dưới kính hiển vi ở độ
phóng đại 160× cho thấy, sự thủy phân lớp vỏ chitin của rệp bởi chitinase đi
kèm với sự giải phóng các khối chitin riêng lẻ, trong khi rệp được xử lý với
nước vẫn duy trì hình dạng của lớp vỏ chitin (Hình 3.27).
A B
Hình 3.27. Hỗn hợp
chitin của rệp được
xử lý với nước (A) và
rChit từ nấm men P.
pastoris X33 (B)
(phóng đại 160 lần)
3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới tốc độ phát triển sợi nấm của đa số các loài
nấm. Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy, ở 25°C chủng nấm L. lecanii 43H
cho đường kính phát triển sợi nấm đạt 12,8 mm/ngày cao hơn so với ở nhiệt
độ 30°C (đường kính đạt 7,22 mm/ngày). Như vậy, tốc độ phát triển sợi nấm
của chủng nấm L. lecanii 43H phụ thuộc đáng kể vào nhiệt độ và thích hợp
ở dải nhiệt độ dưới 30°C.
3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm
Kết quả cho thấy, chủng nấm L. lecanii 43H cho tỉ lệ bào tử nảy mầm
cao nhất ở nhiệt độ 25°C (đạt khoảng 92%) sau 12 giờ ủ. Sau 24 giờ ủ ở cả 3
nhiệt độ khảo sát, hầu hết bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H đều nảy
mầm, tỉ lệ đạt 98% (Hình 3.28).

Hình 3.28.
Ảnh hưởng của
nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm
của bào tử nấm L. lecanii
43H