LÊ THỊ NGỌC SƯƠNG N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
NC
C
Ứ
Ứ
U
U
H
HS
S
Ạ
Ạ
C
C
H
HP
P
H
H
Y
Y
T
T
A
A
S
S
E
E
N
N
Ấ
Ấ
M
MM
M
E
E
N
NP
P
I
I
C
C
H
H
I
I
A
A
Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 60 42 031
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH Thành phố Hồ Chí Minh – 2009
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy Hoàng Quốc Khánh,
trưởng Phòng Vi Sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa Học
LÊ THỊ NGỌC SƯƠNG
U
UN
N
H
H
Ậ
Ậ
N
NV
V
À
ÀT
T
I
I
N
N
H
H
I
IT
T
Ổ
ỔH
H
Ợ
Ợ
P
PT
T
Ừ
Ừ
N
N
Ấ
Ấ
S
S
T
T
O
O
R
R
I
I
S
SG
G
S
S
1
1
1
1
5
5 Chuyên ngành: Hóa Sinh
giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Em xin cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến, phòng Các Chất Có Hoạt tính Sinh
học, cùng quý thầy cô ở Viện Sinh học Nhiệt đới, đã tận tính hướng dẫn và
giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn
quý thầy cô.
Cảm ơn các em Trinh, Vân, Phi, Linh, Lan cũng như các bạn cùng lớp
đã luôn gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ mình trong thời gian qua.
Với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn, con xin chân thành cảm ơn
ông bà, cha mẹ hai bên đã luôn hết lòng yêu thương, chăm sóc, động viên,
giúp đở và tạo điều kiện để con có thể hoàn thành tốt luận văn cũng như
khóa học này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn ông xã, dù không phải lúc nào cũng ở gần
bên, nhưng anh luôn thương yêu, động viên, tạo mọi điều kiện để em hoàn
thành tốt luận văn cũng như khóa học này. Anh luôn là chỗ dựa vững chắc
cho em.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2009.
Xin chân thành cảm ơn
Lê Thị Ngọc Sương Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình và biểu đồ
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: Tổng quan tài liệu 3
1.1 Acid phytic 4
1.1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic 4
1.2.7.3 Nồng độ cơ chất 21
1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
enzym phytase 21
1.2.8.1 Nguồn cacbon 21
1.2.8.2 Nguồn nitơ 22
1.2.8.3 Vitamin và các nguyên tố vi lượng 22
1.2.8.4 Tỷ lệ cacbon/photpho 23
1.2.9 Ứng dụng của enzym phytase 23
1.2.9.1 Ứng dụng trong nghiệp chế biến thức ăn gia
súc, gia cầm 23
1.2.9.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 24
1.2.9.3 Ứng dụng trong công nghệ tổng hợp myo-
inositol phosphate 25
1.2.10 Các nghiên cứu về phytase ở Việt Nam 26
1.3 Nấm men Pichia pastoris 27
1.3.1 Phân loại và đặc điểm chung 27
1.3.2 Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 28
1.3.3 Biến dưỡng methanol ở P. pastoris 30
1.3.4 Sự tiết các protein ngoại lai 31
1.3.5 Biến đổi hậu dịch mã 32
1.3.6 Các chủng biểu hiện phổ biến 33
1.3.7 Các vector biểu hiện 34
1.3.8 Pichia pastoris GS115 đã biến nạp 35
Chương 2: Vật liệu & Phương pháp 38
2.1 Vật liệu 39
2.1.1 Nguyên vật liệu 39 Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
2.3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 63
2.3.5.2 Ảnh hưởng của pH 63
2.3.5.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại 64
2.3.5.4 Nhiệt độ tối ưu (t
opt
) của enzym phytase thu
nhận được 64 Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
2.3.6 Tinh sạch enzym phytase thu được bằng phương pháp
sắc ký lọc gel 64
2.3.7 Điện di SDS-PAGE 65
2.3.8 Khảo sát các đặc tính của phytase thu được sau khi
qua sắc ký lọc gel 65
2.3.8.1 Khảo sát nồng độ cơ chất theo thời gian để
tìm ra giá trị K
m
(hằng số Michaelis) của
enzym 65
2.3.8.2 Xác định K
m
65
2.4 Tóm tắt qui trình thu nhận phytase tái tổ hợp 66
Chương 3: Kết quả & Biện luận 67
3.1 Kiểm tra khả năng sinh phytase của các giống 68
3.2 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy
thu nhận phyase 69
3.2.1 Khảo sát tỷ lệ giống cấy 69
m
) 103
Chương 4: Kết luận & Đề nghị 107
4.1 Kết luận 108
4.1.1 Các điều kiện liên quan đến quá trình nuôi cấy 108
4.1.2 Tác nhân tủa 108
4.1.3 Hiệu quả thu nhận phytase tái tổ hợp 108
4.1.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 109
4.2 Đề nghị 109
TÀI LIỆU THAM KHẢO 111
Chương 5: Phụ lục
Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BMGY : Bufferred Glycerol-comlex Medium
BMMY : Bufferred Methanol-comlex Medium
CPE : Chế phẩm phytase tái tổ hợp thu nhận được
ĐC : Mẫu đối chứng
EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic acid
HđC : Hoạt độ chung của phytase
HđR : Hoạt độ riêng của phytase
Hđmax : Hoạt độ tối đa
M : Trọng lượng phân tử
Phytase-PAI : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có
mang gen phyAI
Phytase-PB : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có
Bảng 2.2: Nồng độ của các dung dịch photphate chuẩn 46
Bảng 2.3: Các bước thực hiện phản ứng enzyme 47
Bảng 3.1: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo tỷ lệ giống 69
Bảng 3.2: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo thời gian nuôi cấy 71
Bảng 3.3: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo môi trường nuôi cấy 73
Bảng 3.4: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo lượng methanol bổ sung
mỗi 24 giờ 76
Bảng 3.5: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo nồng độ K
3
PO
4
bổ sung
vào môi trường nuôi cấy 78
Bảng 3.6: Sự biến đổi hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ
riêng của phytase-PAI và phytase-PB theo các tác nhân tủa 81
Bảng 3.7: Kết quả hiệu suất nuôi cấy của phytase-PAI và phytase-PB 84
Bảng 3.8: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PAI 85
Bảng 3.9: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PB 86
Bảng 3.10: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđmax của
phytase-PAI và phytase-PB theo sự đổi pH 88
Bảng 3.11: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđ đối
chứng của phytase-PAI tương ứng với các ion kim loại
khác nhau 90 Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc của axit phytic 4
Hình 1.2: Phức phytate trong tự nhiên. 5
Hình 1.3: Cơ chế xúc tác của phytase 19
Hình 1.4: Sự thủy phân acid phytic thành inositol và acid phosphoric
bằng phytase 20
Hình 1.5: Hình thái của nấm men Pichia pastoris 27
Hình 1.6: Biểu đồ chung cho vector biểu hiện của P. pastoris 31
Hình 2.1: Bộ điện di SDS-PAGE (Bio-Rad) 49
Hình 2.2: Hệ thống sắc ký lọc gel Biologic LP (Bio-Rad) 53
Hình 2.3: Đường cong của phương trình Michaelis Menten 56
Hình 2.4: Đường cong của phương trình Lineweaver Burk 57
Hình 3.1: Khảo sát khả năng sinh phytase của các giống
GS115/phyAI và GS115/phyB cấy trên môi trường MM-
canxi phytate. 68
Hình 3.2: Sự biến thiên hàm lượng protein, hoạt độ chung của
phytase-PAI theo tỷ lệ giống khác nhau. 70
Hình 3.3: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PB theo tỷ lệ giống khác nhau. 70
bổ sung vào môi trường 79
Hình 3.12: Sự biến thiên hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ
riêng của phytase-PAI theo các tác nhân tủa khác nhau. 81
Hình 3.13: Sự biến thiên hoạt độ chung và hoạt độ riêng của
phytase-PB theo các tác nhân tủa khác nhau. 81
Hình 3.14: Kết tủa phytase-PAI và phytase-PB với các tác nhân tủa
khác nhau được hòa vào đệm Natri acetate 0,2M, pH 5,5 82
Hình 3.15: Chế phẩm phytase-PAI và phytase-PB thu được sau khi tủa
bằng cồn 96
o
83
Hình 3.16: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PAI 85
Hình 3.17: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PB 86
Hình 3.18: Sự biến thiên % hoạt độ chung/Hđmax của phytase-PAI và
phytase-PB theo sự đổi pH 89
Hình 3.19: Sự biến thiên % hoạt độ chung/Hđmax của phytase-PAI và
phytase-PB theo các nhiệt độ khác nhau của phản ứng 93
Hình 3.20: Sắc ký đồ của phytase-PAI 94
Hình 3.21: Sắc ký đồ của phytase-PB 95
Hình 3.22: Sắc ký đồ của enzyme phytase-PAI đã loại muối 96
Hình 3.23: Sắc ký đồ của enzyme phytase-PB đã loại muối 97
Hình 3.24: SDS-PAGE của phytase-PAI và phytase-PB 100
Hình 3.25: Đường chuẩn trọng lượng phân tử của các protein chuẩn 103
Hình 3.26: Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk của phytase-PAI 106
Hình 3.27: Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk của phytase-PB 107 Luận Văn Thạc Sĩ Trang 1 Tổng quan tài liệu
và nitơ trong phân. Vì vậy, giá trị thương mại hóa của phytase vi sinh vật được ứng
dụng để bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm được chú ý nhiều hơn trong
những năm gần đây. Tuy nhiên nguồn phytase thu nhận từ vi sinh vật có nhiều
khuyết điểm như hoạt độ thấp, ít có khả năng chịu nhiệt,…. Do đó người ta đã bắt Luận Văn Thạc Sĩ Trang 2 Tổng quan tài liệu
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
đầu nghiên cứu để có thể thu nhận được nguồn phytase có hoạt độ cao hơn, có khả
năng chịu nhiệt, pH, và các đặc tính khác, đó là nguồn phytase tái tổ hợp. Trong
luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ
nấm men Pichia pastoris GS115 và xác định các đặc tính của enzyme này.
1
1
:
:
T
T
Ổ
Ổ
N
N
G
GQ
Q
U
U
A
A
N
NT
T
hexadihydrogenphosphate (IUPAC-IUB, 1977). Muối của acid phytic là phytate.
Chính xác hơn, phytate là dạng phức của Natri, Magiê, Canxi với acid phytic, tồn
tại như dạng gọng kìm trong các hạt ngũ cốc, các loại đậu và hạt cây có dầu.[31]
1.1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic
Cấu trúc của acid phytic được tìm ra bằng phương pháp phân tích X-
ray (Blank và cộng sự, 1971) và
31
P-NMR ( Johnson và Tate, 1969). Johnson
và Tate đề nghị rằng nhóm photphat số 2 nằm ở vị trí đối xứng qua trục, còn
các nhóm photphat còn lại nằm ở vị trí bất đối xứng. Ngược lại, theo Blank và
cộng sự, (1971) thì kết luận rằng các nhóm photphat 1,3,4,5 và 6 nằm ở vị trí
đối xứng qua trục, còn nhóm photphat số 2 nằm ở vị trí bất đối xứng. Đối với
dữ liệu của Costello và cộng sự, (1976) thì ủng hộ thông tin của Johnson và
Tate, (1969) đã đề nghị.
Axit phytic có công thức tổng quát của là C
6
H
8
O
24
P
6
, tồn tại ở hai dạng
cấu trúc lập thể khác nhau, cấu trúc đối xứng và bất đối xứng. [31]
Hình 1.1. Cấu trúc của axit phytic [51] Luận Văn Thạc Sĩ Trang 5 Tổng quan tài liệu
hydroxit sắt chuyển động từ rễ. Sự hiện diện của acid phytic được xem là có
tác động đến việc chống lại sự tăng trưởng của tế bào ung thư trong bệnh ung
thư biểu mô vú và ruột kết ở các loài động vật. (Dvorakova, 1998).
Những nghiên cứu ở cuối thập niên 80 và đầu những năm thập niên 90,
đã xác định inositol photphat giữ vai trò trung gian trong sự vận chuyển của
các chất khoáng vào trong tế bào. Vai trò của chúng đặc biệt là inositol 3-
photphat trong sự truyền tín hiệu và sự điều chỉnh chức năng của các tế bào
thực vật và động vật. Vấn đề này được nhiều nhà nghiên cứu chú ý đến.
(Wodzinski and Ullah,1996).[44]
1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng của acid phytic trong tự nhiên
Acid phytic được tìm thấy đầu tiên như là các muối của các ion dương
hóa trị 1 và 2 (như muối kali, magiê trong gạo và muối canxi, magiê trong đậu
nành, trong những vùng riêng rẽ của các loại hạt ngũ cốc, cây họ đậu). Nó tích
lũy trong các loại ngũ cốc, các loại đậu trong suốt quá trình chín của hạt, cùng
với các cơ chất dự trữ khác như tinh bột và chất béo. Trong các hạt ngũ cốc và
hạt đậu acid phytic tích lũy trong các hạt nhỏ alơron và các tinh thể hình cầu
tách biệt (Reddy và cộng sự, 1989).
Nội nhũ của phôi lúa mì và lúa thì hầu như không có phytate. Nó dường
như tập trung trong mầm và các lớp hạt alơron của các tế bào phôi.
Ferguson và Bollard, (1976) đã tìm ra rằng 99% phytat trong đậu là
nằm trong các lớp tế bào mầm.
Lượng phytate lớn nhất ở ngũ cốc được tìm thấy là ở ngô (0.33-2.22) và
ở các loại đậu là ở đậu dolique (5.92-9.15), (Reddy và cộng sự, 1989). Luận Văn Thạc Sĩ Trang 7 Tổng quan tài liệu
để phóng thích photpho vô cơ.[24],[45].
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 8 Tổng quan tài liệu
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
1.2.2 Lịch sử các nghiên cứu về phytase [45]
1903 – Posternak: mô tả về acid phytic.
1907 – Suzuki và cộng sự: mô tả và tách chiết phytase từ cám gạo.
1911 – Dox và Golden: tìm được phytase trong aspergilli.
1913 – Plimmer và Anderson: xác định được các phức hợp photpho hữu
cơ trong nguyên liệu thực vật.
1914 – Anderson: xác định được cấu trúc của acid phytic.
1959 – Casida: tìm ra được 20 chủng nấm mốc từ đất có hoạt tính
phytase.
1962-1971: Tổ chức Khoáng sản và hóa học quốc tế, bước đầu thử
nghiệm thương mại hóa phytase.
1967 – Ware và Shieh: nhận bằng phát minh về acid phytic.
1968 – Ware và Shieh: phân lập được hơn 2000 chủng có hoạt tính
phytase. Phân lập Aspergilluc niger NRRL 3135 và A. ficuum và
đã thu nhận gen phyA và phyB có hiệu suất cao nhất so với các báo
cáo trước đó, trong chủng có biến đổi không phải do di truyền.
1971 – Nelson và cộng sự: cho ăn bổ sung trực tiếp phytase từ A. niger
NRRL3135 đối với gà trong các bữa ăn thử nghiệm và có hàm
lượng nhất định.
1984 – Dịch vụ nghiên cứu nông nghiệp của Trung tâm nghiên cứu phía
nam, bộ phận nông nghiệp Hoa Kỳ, bắt đầu nghiên cứu cơ bản về
phytase.
1988 – Ullah: tinh sạch, mô tả và xác định thành phần, trình tự amino
thành D-myo-Ins-1,2,3,4,5-pentakisphosphate và orthophosphate. Các
liên kết ester còn lại trong cơ chất được thủy phân ở các tỷ lệ khác
nhau.[30]
1.2.3.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin
Dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin thì enzyme
phytase được chia thành hai lớp:[32]
- Histidine acid phytase – HAP (phytaseA, phytaseB,
phytaseC).
- Alkaline phytase (PhytaseD). Luận Văn Thạc Sĩ Trang 10 Tổng quan tài liệu
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Tất cả các thành viên của nhóm HAPs đều có trung tâm hoạt
động là RHGXRXP.
1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme phytase
1.2.4.1 Phytase từ động vật
Phytase trong mô động vật được phát hiện đầu tiên ở gan và
máu bê (McCollum và Hart, 1908). Tuy nhiên, việc nghiên cứu sâu hơn
để tìm phytase trong máu động vật hữu nhũ thì không thành công.
Phytase được tìm thấy trong máu của động vật có xương sống bậc thấp
hơn như chim, bò sát, cá và rùa biển (Rapoport và cộng sự, 1941). Năm
1937, Patwardhan là người đầu tiên ghi nhận có sự thủy giải phytate
trong ruột chuột. Hoạt động của phytase cũng được quan sát ở ruột heo,
cừu và bò (Spitzer và Phillips, 1972). Động vật nhai lại có khả năng tiêu
hóa phytate hoàn toàn nhờ hệ vi sinh vật có trong ruột, Photphate vô cơ
giải phóng ra sẽ được vi sinh vật và cả động vật chủ sử dụng.[22]
Phytase được tìm thấy có nhiều ở động vật có dạ dày đơn
(Bitar và Reinhold, 1972; Copper và Gowing, 1983, Yang và cộng sự,
Ngũ cốc Hoạt tính
phytase
(U/kg)
Phụ phẩm lúa mì Hoạt tính
phytase
(U/kg)
Lúa mạch 582 Cám 2957
Lúa mạch đen
5130 Cám ép viên 2573
Triticale 1688 Tấm 4381
Lúa mì 1193 Bột mì làm thức ăn gia súc
3305
Nhiệt độ tối ưu của phytase thực vật từ 45
o
C – 60
o
C
(Wodzinski và Ullah, 1996). Phytase thực vật bị bất hoạt một phần hay
hoàn toàn khi gia nhiệt ở nhiệt độ cao (Ravindran và cộng sự, 1995).
Phillippy, (1999), cũng chứng minh rằng phytase lúa mì mất hoạt tính
đáng kể khi có mặt pepsin. Khả năng chịu nhiệt của phytase thực vật
không tốt và đây là trở ngại đầu tiên trong chế biến thức ăn cho gia súc,
gia cầm.
1982), Klebsiella sp. (Shah và Parekh, 1990), B. subtilis (Shimizu,
1992), Escherichia coli (Greiner và cộng sự, 1993), Enterobacter sp. 4
(Yoon và cộng sự, 1996) và Bacillus sp. DS 11 (sau đó được xác định là
B. amyloliquefaciens) (Kim và cộng sự, 1998a). Trong đó, chỉ có giống
Bacillus và Enterobacter sản xuất phytase ngoại bào.
Copyright: Tài liệu đại học ©