Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012
1
NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA CELLULASE
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
RESEARCH AND CLONING A GENE ENCODING CELLULASE FROM BACILLUS
SUBTILIS
SVTH: Đặng Thị Châu Thu
Lớp 07SH, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng
GVHD: Th.S Ngô Thái Bích Vân
Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng
TÓM TẮT
Enzyme cellulase được ứng dụng nhiều trong môi nông trường, nông nghiệp, công
nghiệp, y học,….Tuy nhiên tại Việt Nam việc sản xuất chế phẩm enzyme này vẫn chưa thực sự
hoàn thiện. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tạo dòng đoạn gen mã hóa endo-1,4-beta-
glucanase thuộc hệ enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Đoạn gen sau khi tạo dòng
thành công được bước đầu biểu hiện trong chủng E.coli BL21(DE3) cảm ứng bằng IPTG 1mM.
Hoạt tính của enzyme được kiểm tra bằng phương pháp thủy phân trên môi trường thạch chứa
CMC (carbo-metyl-cellulose) 1% và phương pháp đường khử Bermeld. Đồng thời chúng tôi kiểm
tra kích thước của enzyme mục tiêu bằng điện di SDS-PAGE. Kết quả này sẽ làm nền tảng cho
việc sản xuất chế phẩm enzyme cellulase phục vụ trong nhiều ngành công nghiệp sau này.
ABSTRACT
Cellulase enzyme plays a critical role in many fields such as agriculture, industry,
medicine, etc. However, production of this enzyme still haven't been completed. In this study, we
carried out cloning the gene endo-1,4-beta-glucanase which is coding for the biosynthesis of
cellulose on the Bacillus subtilis DNA. The cloning gene is represented on the expression system
of E.coli BL21(DE3) and induced with 1mM IPTG. The producing enzyme is test for activity on the
medium with CMC (carbo-metyl-cellulose) 1% and the reducing sugar Bermeld. As the same time,
we check the size of the target enzyme by SDS-PAGE. This result will base for the manufacturing
cellulase which is using for many industry application.
1. Đặt vấn đề
Enzyme cellulase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: nông nghiệp, công nghiệp,

C trong 5 phút, 94
0
C
trong 1 phút, 52
0
C trong 45 giây, 72
0
C trong 1 phút 30 giây, 72
0
C trong 10 phút (lặp lại 35
chu kì) để thu được hai đoạn gen có kích thước khoảng 900 bp, 700 bp. Phản ứng PCR thứ
hai sử dụng sản phẩm của hai phản ứng PCR đầu làm nguyên liệu (template) chạy với chu
trình nhiệt như trên 25 chu kì sau đó bổ sung mồi F1&R2 chạy tiếp tục 30 chu kì với mục
đích thu được đoạn gen có kích thước 1600 bp [2]. Mồi F1, R2 được thiết kế có vị trí cắt
của enzyme BamHI và XhoI tương ứng. Các kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel
agarose 1% như sau:

A B
Hình 2 Kết quả PCR đoạn gen endo-1,4-glucanase
Giếng M: Thang DNA 100bp (Biorad)
Giếng 1A: Đoạn gen thứ nhất 900 bp
Giếng 2A: Đoạn gen thứ hai 700 bp
Giếng 1B: Đoạn gen endo-1,4-betaglucanase 1600bp
Từ kết quả điện di cho thấy chúng tôi đã

A B C
Hình 3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào Escherichia Coli DH5α (hình A).
Kết quả biến nạp plasmid pET28a(+) vào Escherichia Coli DH5α – chứng dương (hình B).
Kết quả cấy trải Escherichia coli DH5α khả nạp – chứng âm (hình C).
Kết quả hình 3 cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công vector tái tổ hợp vào
chủng DH5α. Sau bước này, chúng tôi sẽ tiến hành sàng lọc các khuẩn lạc tại đĩa thạch
hình A để thu được chắc chắn dòng có chứa vector tái tổ hợp.
2.3.1. Kết quả sàng lọc chủng Escherichia coli DH5α có mang vector tái tổ hợp
pET28a(+)endo-1,4betaglucanase
Để chọn ra được khuẩn lạc có chứa vector tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-
betaglucanase. Chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng phương pháp tách chiết DNA tổng số
[3].

Hình 4 Kết quả sàng lọc chủng DH5α mang vector tái tổ hợp
Giếng M: Marker 100 bp (Biorad)
Giếng 1,3,4,5: Các dòng DH5α mang plasmid pET28a(+)
Giếng 2: Dòng DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase
2.3.2. Kết quả quy trình tách thu plasmid tái tổ hợp và kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ
Qua kết quả điện di ở trên, tại giếng 2 là dòng có
mang plasmid tái tổ hợp vì kích thước plasmid tái tổ hợp
khoảng 7 kb do vậy sẽ nằm ở trên so với vạch plasmid
bình thường có kích thước 5,4 kb. Từ đó chúng tôi sẽ thu
nhận được dòng cần tìm tại giếng số 2. Dòng này sau đó sẽ
được nuôi tăng sinh trên môi trường LB/Kanamycin để
tiến hành tách thu nhận plasmid tái tổ hợp.

Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012
4
hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase:
Sau khi đã xác định chính xác dòng DH5α có mang vector tái tổ hợp. Chúng tôi

540nm
ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi xây dựng được đồ thị thể hiện sự tương quan
giữa nồng độ glucose và giá trị OD
540nm
Như vậy plasmid sau khi xử lý bằng enzyme cho hai
vạch tương ứng với vạch phía trên là plasmid pET28a(+) có
kích thước 5,4 kb, vạch ở dưới là đoạn chèn có kích thước
khoảng 1600 bp. So với plasmid pET28a(+) đã được cắt mở
vòng ở giếng 3 thì vạch plasmid sau khi cắt ở giếng 2 có kích
thước tương đương. Điều đó chứng tỏ gen mục tiêu đã được gắn
chèn vào plasmid pET28a(+).

Từ kết quả thu được chúng tôi kết luận vector
tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase khi biến
nạp vào chủng E.coliBL21(DE3) có hoạt tính cellulase.
Chúng tôi sẽ tiếp tục sử dụng chủng này để thực hiện
các thử nghiệm kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase.

Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012
5

Hình 7 Đồ thị thể hiện tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và giá trị mật độ quang 540nm Từ kết quả OD của mẫu thử có enzyme cellulase (OD
540nm
= 0,306), mẫu thử không
có enzyme (OD
540nm
= 0,015) và đường chuẩn, chúng tôi nhận thấy hoạt độ của enzyme

hợp các cDNA mã hóa hai enzyme endoglucanase 1,2 của Trichoderma Reesei bằng
phương pháp overlap extension PCR (OE-PCR)”, Trung tâm Công nghệ sinh học
thành phố Hồ Chí Minh.
[2] Heckman, K.L and L.R Pease (2007), “Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven
overlap extension”, Nat Protoc, 2(4):924-32
[3] GUO Xu-Dong, MAO Shu-Yan, HOU Dong-Xia, BOU Shorgan, “A rapid method for
Preparation of plasmid DNA for secreening recombinant clones”, Chinese jounarl of
Biotechnology, (2007) 23(1), 176-178.
[4] Wang Li, Wei-Wei Zhang, Ming-Ming Zang, Yu-Lin Chen, “Cloning of
Thermostable Cellulase Gene from newly isolated Bacillus subtilis and its expression
in Escherichia coli”, Mol Biotechnol, (2008) 40:195-201
[5] Deliang Yang, Haibo Weng, Minge Wang, Weihua Xu, Yaozhao Li, Huiling Yang,
“Cloning and expression of a novel thermostable cellulose from newly isolated
Bacillus subtilis strain I15”, Mol Biol Rep, (2010)37:1923-1929 DOI 10.1007/s11033-
009-9635-y.