MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM 3
1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide 3
1.1.2. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng 4
1.1.3. Hàm lƣợng acrylamide trong một số thực phẩm 5
1.2. ASPARAGINASE 5
1.2.1. Asparaginase 5
1.2.2. Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide trong thực phẩm 6
1.2.3. Công nghệ sản xuất asparaginase 8
1.2.3.1. Sản xuất asparaginase từ chủng E. coli tái tổ hợp 8
1.2.3.2. Sản xuất asparaginase từ các chủng đã đƣợc chứng nhận an toàn
(chủng GRAS) tái tổ hợp 10
1.3. HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS 12
1.3.1. Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm men 12
1.3.2. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện nấm men 13
1.3.3. Hệ biểu hiện P. pastoris 14
1.3.3.1. Promoter AOX1 14
1.3.3.2. Chủng biểu hiện 15
1.3.3.3. Vector biểu hiện gen 17
1.3.3.4. Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris 18
1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris 19
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. VẬT LIỆU 21
2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid 21
2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị 21
2.1.3. Dung dịch và môi trƣờng sử dụng 22
2.1.3.1. Môi trƣờng và dung dịch sử dụng để biến nạp DNA plasmid vào tế

3.2.2 Giải trình tự gen asp1 45
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pPIC-ASP1 45
3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu hiện pPIC9 45
3.3.2. Kiểm tra gen asp1 trong plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 bằng PCR 47
3.3.3. Tách lƣợng lớn vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen asp1 48
3.4. TẠO CHỦNG NẤM MEN P. PASTORIS MANG ASP1 49
3.5. BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P. PASTORIS SMD1168
TRONG BÌNH TAM GIÁC 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ
Hình 1. Sơ đồ minh họa sự hình thành acrylamide trong chế biến thực phẩm 5
Hình 2. Sơ đồ minh họa cơ chế phản ứng của L-asparaginase 7
Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 ngoại lai trong nấm men P. pastoris. 18
Hình 4. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris tại locus his4 19
Hình 5. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện để biểu hiện gen asp1
trong tế bào nấm men P. pastoris SMD1168 35
Hình 6. Đồ thị dự đoán sự có mặt, vị trí và điểm cắt tín hiệu tiết có trong
asparaginase của A. oryzae. 36
Hình 7. Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến và biểu hiện trong nấm
men P. pastoris. 37
Hình 8. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp định
biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ mức độ phù hợp của các bộ mã trên asp so
với bộ mã trong chủng biểu hiện P. pastoris (B). 38
Hình 9. Đồ thị so sánh tần suất sử dụng của các codon trong hai chủng A. oryzae
(đỏ) và P. pastoris (đen) 39
Hình 10. So sánh trình tự protein đƣợc dịch mã từ gen asp và asp1 40
Hình 11. So sánh trình tự gen asp1 đã đƣợc cải biến và trình tự gen asp chƣa cải
biến 41
Hình 12. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp1 định

thông qua OD
600
theo thời gian lên men 52
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN
AOX
APS
ARN
ASP
Amp
BMGY
BMMY
bp
dNTP
EDTA
ETBr
E. coli
GRAS
kb
kDa
LB
MCS
MD

Tris-acetate-EDTA
Tris-EDTA

1 MỞ ĐẦU
Hiện nay tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ ngày càng tăng. Một trong các yếu tố
dẫn đến bệnh ung thƣ là do chế độ ăn uống. Những thực phẩm chứa nhiều mỡ, ƣớp
muối, hun khói đƣợc coi là những thực phẩm có thể dẫn đến căn bệnh chết ngƣời
này. Tuy vậy, rất ít ngƣời dân nhận thức đƣợc rằng các thực phẩm tƣởng chừng vô
hại nhƣ các loại bánh nƣớng lại chứa acrylamide, một chất có khả năng gây ung thƣ.
Năm 2002 các nhà khoa học Thụy Điển đã tìm ra chất này trong các sản phẩm thực
phẩm nhƣ khoai tây chiên, bánh mỳ, bánh quy, ngũ cốc [10].
Acrylamide hình thành khi các thực phẩm giàu tinh bột đƣợc chiên rán ở
nhiệt độ trên 120
o
C. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ cao, asparagine trong bột làm
bánh phản ứng với đƣờng khử tạo thành hợp chất có màu vàng nâu chứa acrylamide
[29]. Các nhà khoa học trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng
asparaginase để làm giảm lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc
loại bỏ asparagine. Enzyme asparaginase sẽ xúc tác thủy phân asparagine thành axit
aspartic và ammonia, không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình
thành acrylamide [8].
Trên thế giới hiện nay hãng Novozymes A/S Denmark đã sản xuất và thƣơng
mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A. oryzae ứng dụng
trong công nghiệp thực phẩm với tên thƣơng mại là Acrylaway®L (2007) [24].
Trong dƣợc phẩm asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với
tên thƣơng mại Elspar [11]. Hiện nay giá thành asparaginase trên thị trƣờng rất cao
nên việc ứng dụng enzyme để làm giảm acrylamide trong quá trình chế biến các

3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM
1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide
Các nhà khoa học trên thế giới đã từng cảnh báo ngƣời tiêu dùng về nguy cơ
ung thƣ do ăn khoai tây chiên. Trên thực tế, nhiều loại thực phẩm tƣởng nhƣ vô hại
khác nhƣ cà phê, bánh mì, bánh quy cũng có thể dẫn đến ung thƣ. Nguyên nhân
chính là do các thực phẩm trên có acrylamide. Ngay sau khi ăn, acrylamide trong
thực phẩm sẽ nhanh chóng chuyển đi khắp cơ quan trong cơ thể thông qua hệ tuần
hoàn. Nó đƣợc phát hiện trên gan, tim, não, thận, tuyến ức và thậm chí là cả trong
sữa mẹ. Acrylamide chuyển hoá thành glycidamide ở trong gan thông qua
cytochrome P540. Khi nồng độ của acrylamide và glycidamide tăng cao, chúng có
thể tƣơng tác với các đại phân tử nhƣ DNA, hemoglobin và các enzyme gây đột
biến DNA hoặc làm ảnh hƣởng tới chức năng sinh học của hệ enzyme trong cơ thể
[16].
Những nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh acrylamide có ảnh hƣởng xấu đến
sức khoẻ con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và ảnh hƣởng đến hệ thần kinh [38]. Thông
thƣờng chỉ ở nồng độ cao nó mới ảnh hƣởng đến hệ thần kinh (liều không độc ≤ 0,5
mg/kg trọng lƣợng cơ thể/ngày), tuy nhiên nồng độ này thƣờng khó đạt đƣợc thông
qua ăn uống. Ngƣợc lại, khả năng gây ung thƣ và đột biến gen của acrylamide và
glycidamide đã đƣợc công bố ở nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng nhƣ trên
động vật. Nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào cho thấy acrylamide và glycidamide có
thể làm gãy nhiễm sắc thể và gây đột biến điểm dẫn đến sự khác thƣờng trên nhiễm
sắc thể nên phá vỡ quá trình nguyên phân, tạo thể bội không chỉnh. Những nghiên
cứu trên tế bào chuột và ngƣời đƣợc xử lý bằng acrylamide cho thấy, acrylamide

gói. Quá trình nƣớng trải qua ba giai đoạn với nhiệt độ nƣớng là 160
o
C, 190
o
C và
trên 225
o
C từ 10 đến 20 phút tùy theo yêu cầu về màu sắc và độ giòn [24].
Tuy nhiên, nghiên cứu của các nhà khoa học Na Uy , Thụy Sĩ, Anh và Mỹ đã
cho thấy các loại thực phâ
̉
m có nguồn gốc thực vâ
̣
t giàu carbohydrate khi đƣợc chế
biến bằng các phƣơng pháp đòi hỏi nhiê
̣
t đô
̣
cao (>120
o
C) đều sản sinh acrylamide
[16, 30, 41]. Nguyên nhân là trong sản xuất bánh nƣớng, sự tạo thành màu vàng sau
khi nƣớng là do các axit amin phản ứng với đƣờng glucose (phản ứng Maillard) tạo
thành hợp chất có màu vàng nâu. Tuy nhiên, chỉ có asparagine là tiền chất chủ yếu
tạo thành acrylamide. Những loại đƣờng khử tham gia tạo thành acrylamide mạnh
mẽ nhất là glucose, fructose [16, 30]. Hàm lƣợng asparagine tự do trong các loại bột
5 mỳ rất khác nhau, dao động từ 0,14-0,4 g/kg [28].
hydrophila, Erwinia amylovora, Xanthomonas campestris, Bacillus subtilis,
Streptomyces griseus, Corynebacterium glutamicum [22, 33, 34]. Nấm mốc và nấm
men cũng có khả năng sinh asparaginase nhƣ Aspergillus niger, A. oryzae, A.
tamarri, A. terreus, Penicillium granulatum, P. digitatum, Fusarium solani, F.
oxysporum, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae [22, 33, 34] .
Asparaginase có thể đƣợc tổng hợp nội bào hoặc ngoại bào, hầu hết các chủng
sản sinh asparaginase ngoại bào thuộc nấm sợi. Asparaginase sinh ra từ vi sinh vật
khác nhau có khối lƣợng phân tử khác nhau: từ 40 đến gần 200 kDa. Tính chịu nhiệt
của các asparaginase khác nhau thƣờng khác nhau. Asparaginase của một số vi
khuẩn nhƣ là P. aeruginosa 50071, P. stutzeri MB-405, Erwinia carotovoca và
Staphylococcus hoạt động tối ƣu ở 37
o
C, trong khi asparaginase của
Chrombacteriaceae có nhiệt độ tối ƣu chỉ là 20
o
C [20] . Asparaginase từ A. oryzae
hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 70
o
C, đạt cực đại ở 60
o
C. Tính bền
của asparaginase từ A. oryzae đạt đƣợc 2 giờ ở 37
o
C, pH 4-8, hầu nhƣ không bị bất
hoạt ở nồng độ muối cao [24]. Asparaginase từ A. niger có hoạt tính trong dải nhiệt
độ từ 20-65
o
C, nhiệt độ tối ƣu khoảng 50

acrylamide trong vỏ bánh mỳ giảm từ 36% đến 75%. Ngoài ra sự hình thành
acrylamide từ các sản phẩm bánh quy, bánh nƣớng, bánh đậu phộng đã giảm tới
trên 80% sau khi bổ sung asparaginase vào bột nguyên liệu trƣớc khi nƣớng bánh.
Hơn thế nữa, các sản phẩm từ bột khoai tây đã đƣợc phát hiện có hàm lƣợng
acrylamide rất cao, lên tới 2500 ppb, nhƣng sau khi bổ sung asparaginase vào bột
khoai tây ƣớt đã làm giảm trên 80% lƣợng L-asparagine tự do. Sau quá trình nƣớng,
asparaginase bị mất hoàn toàn hoạt tính, dƣ lƣợng chất rắn hữu cơ trong sản phẩm
thực phẩm sau cùng là từ 2-13 mg/kg (0,0002-0,0013%) đối với bánh mỳ; 0,2-30
mg/kg (0,00002-0,0030%) đối với các sản phẩm bánh có nguồn gốc từ ngũ cốc; 4-
562 mg/kg (0,0004-0,0562%) đối với các sản phẩm từ khoai tây và 3-5 mg/kg
(0,0003-0,0005%) đối với các sản phẩm gia vị. Asparaginase có mặt trong thực
8 phẩm ở hàm lƣợng thấp đƣợc xem nhƣ là các protein không hoạt động và không
gây hại cho ngƣời sử dụng [42].
1.2.3. Công nghệ sản xuất asparaginase
Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp asparaginase kể trên thì E.
coli, Ewinia carotovora, Serratia marcescens, S. cerevisiae, A. oryzae và A. niger đã
đƣợc sử dụng để sản xuất asparaginase ở quy mô công nghiệp ứng dụng vào trong y
tế và thực phẩm [20, 33]. Rất nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần
môi trƣờng, pH và nhiệt độ lên men nhằm thu đƣợc lƣợng asparaginase tối đa.
Baskar và Renganathan (2011) cho rằng ammonium chloride là nguồn nitơ tốt nhất
đối với Aspergillus terreus MTCC1782, trong khi đó Sarquis và cộng sự (2004) lại
cho rằng môi trƣờng bổ sung 2% proline phù hợp với A. terreus IOC 217 và A.
tamari IOC 186 [36]. Nhƣng đối với chủng E. coli thì nguồn cazein thủy phân 0,2%
hoặc cao men 0,1% hoặc tryptone 1% đƣợc sử dụng nhƣ là nguồn nitơ thích hợp
nhất cho sản lƣợng asparaginase cao.
Hầu hết các chủng tự nhiên này thƣờng chỉ sản xuất asparaginase ở một lƣợng
rất thấp nhƣ E. coli 0-225 U/g (đơn vị/g tế bào khô), E. carotovora 40-450 U/g, S.

Khushoo và cộng sự (2005) đã tạo đƣợc chủng E. coli tái tổ hợp tiết E. coli L-
asparaginase II ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy nên enzyme ít bị protease phân hủy
hơn, thƣờng ở dạng hòa tan và hoạt động, nhờ thế mà hiệu suất thu hồi enzyme tăng
lên đáng kể, đạt 86% và sản lƣợng enzym thu đƣợc tăng gấp 8 lần, ứng với 95 mg/l,
hoạt tính enzyme đạt đƣợc 20950 IU/l. Tiếp đến, nhiều tổ hợp chủng vector biểu
hiện đƣợc thử nghiệm nhằm tìm ra chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện tốt nhất E. coli
Lasparaginase II ra ngoài môi trƣờng. E. coli asparaginase biểu hiện khi lên men ở
quy mô lớn hơn đạt đƣợc sản lƣợng rất cao, tới 5,24 g/l với hoạt tính enzyme là
870000 IU/l, ứng với 80% hoạt tính của asparaginase tự nhiên [27].
E. coli là cơ thể vật chủ đƣợc sử dụng thƣờng xuyên cho biểu hiện protein tái
tổ hợp do chúng dễ nuôi cấy, phân chia tế bào nhanh và chấp nhận nhiều loại
vector. Tuy nhiên asparaginase đƣợc sản xuất từ vi khuẩn thƣờng gây ra những tác
dụng phụ khi thử nghiệm ở ngƣời cũng nhƣ ứng dụng vào trong công nghệ thực
phẩm và dƣợc phẩm, nhƣ gây ra các phản ứng dị ứng và sốc phản vệ. Asparaginase
tổng hợp từ E. coli đã đƣợc thử trên một loạt các động vật thí nghiệm (thỏ, chuột,
chó) và gây ra những ảnh hƣởng bất lợi cho động vật nhƣ giảm cân nặng, giảm khả
10 năng tiêu thụ thức ăn, dị ứng [42]. Do đó, các nhà khoa học đã tiến hành tìm những
nguồn sản xuất asparaginase mới an toàn hơn.
1.2.3.2. Sản xuất asparaginase từ các chủng đã đƣợc chứng nhận an toàn
(chủng GRAS) tái tổ hợp
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris và Aspergilus spp là những chủng
đã đƣợc chứng nhận là an toàn đƣợc dùng để sản xuất nhiều loại protein dùng trong
y tế. Cũng giống nhƣ E. coli, S. cerevisiae cũng tổng hợp hai loại asparaginase khác
nhau: asparaginase I đƣợc tổng hợp thƣờng xuyên trong tế bào và đƣợc mã hóa bởi
gen ASP I, còn asparaginase II thì đƣợc tổng hợp ở một lƣợng rất ít dƣới sự điều
hòa của nguồn nitơ và đƣợc tiết ra ngoài tế bào. Asparaginas II từ S. cerevisiae
đƣợc mã hóa bởi gen ASP3 và đạt hoạt tính cao nhất ở pH 6,8 và nhiệt độ 65

học và có khả năng sinh tổng hợp hàm lƣợng protein, vitamin rất lớn, có giá trị dinh
dƣỡng cao nên thƣờng đƣợc bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho ngƣời và động vật.
Tuy nhiên, protein ngoại lai đƣợc tiết từ S. cerevisiae thƣờng thấp, chỉ đạt 0,1- 5
mg/l. Có thể đây cũng là lý do cho tới thời điểm này vẫn chƣa có một công bố
nghiên cứu nào về việc biểu hiện asparaginase tái tổ hợp trong S. cerevisiae.
Hãng Novozymes A/S Denmark và DSM đã sản xuất và thƣơng mại hóa thành
công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tƣơng ứng A. oryzae
và A. Niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhằm làm giảm sự hình
thành acrylamide trong thực phẩm. Tên thƣơng mại của sản phẩm asparaginase từ
A. oryzae là Acrylaway®L, còn asparaginase từ A. niger là PreventASe
TM
M,
PreventASe
TM
W (dạng bột) và PreventASe
TM
L (dạng lỏng). Asparaginase từ A.
oryzae có hoạt tính trong dải pH từ 2-11, đạt cực đại ở pH 6-7; bền ở pH 4-8; hoạt
động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 70
o
C, đạt cực đại ở 60
o
C. Tính bền của A.
oryzae asparaginase đạt đƣợc 2 giờ ở 37
o
C, pH 4-8, không bị bất hoạt ở nồng độ
muối cao [24]. Novozymes A/S đã thiết kế thành công vector biểu hiện
asparaginase từ A. oryzae trong chủng biến đổi gen A. oryzae. Asparaginase tái tổ
hợp đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng ở quy mô nhỏ với hoạt tính enzym là 14280 IU/g,
còn ở quy mô công nghiệp là 3500 IU/g. Asparaginase từ A. niger có hoạt tính trong

hợp protein ngoại lai trong nấm men đó là [35]: Promoter hệ đƣờng phân, ví dụ nhƣ
promoter của gen mã hóa cho alcohol dehydrogenase I (ADHI); Promoter điều hòa
quá trình trao đổi chất galactose, đây là một promoter đƣợc điều khiển chặt chẽ có
liên quan đến chuyển hóa galactose; Promoter điều hòa quá trình hoạt động của nhóm
photphat nhƣ promoter POH5; Promoter bị ức chế bởi glucose, ví dụ nhƣ ADH2.
Vector biểu hiện trong nấm men gồm có hai nhóm: Nhóm không có khả
năng tự sao chép trong tế bào (YIp- Yeast integrating plasmid) là nhóm plasmid
tích hợp bằng cách trao đổi chéo vào gen của nấm men ở những vùng tƣơng đồng
và nhóm có khả năng tự sao chép trong tế bào. Nhóm có khả năng tự sao chép trong
tế bào đƣợc chia thành ba nhóm nhỏ: Nhóm plasmid episom YEp (YEp- Yeast
13 episomal plasmid), nhóm plasmid tái bản YRp (YRp- Yeast replicating plasmid) và
nhóm plasmid chứa tâm động YCp (YCp- Yeast centromere plasmid) [36].
Tất cả các plasmid này chỉ có khả năng mang các đoạn gen ngoại lai có kích
thƣớc tối đa là 20 kb. Hầu hết các plasmid tự sao chép đều là dạng plasmid con thoi,
chúng có trình tự mang các dấu chuẩn chọn lọc để phù hợp cho sinh trƣởng và chọn
lọc trong cả tế bào E. coli và nấm men. Thông thƣờng các vector nấm men đều chứa
tâm sao chép của E. coli là vùng Ori, vùng này có tác dụng làm tăng số bản sao
trong E. coli và đồng thời chứa các dấu chuẩn chọn lọc trong E. coli nhƣ chứa gen
kháng kháng sinh: Gen kháng Ampicillin kí hiệu là amp (Amp
R
), gen kháng
tetracycline kí hiệu tet (Tet
R
). Các vector nấm men thƣờng chứa các gen URA3, HIS
3, LEU 2, TRP 1, LYS 2. Đây chính là các dấu chuẩn chọn lọc trong các dòng nấm
men tái tổ hợp, chúng có khả năng bổ sung cho những đột biến khuyết dƣỡng tƣơng
ứng [35].

protein tiết ra rất thấp, có nghĩa là trong số protein đƣợc vật chủ tiết ra môi trƣờng
ngoại bào thì chủ yếu là protein ngoại lai [43]. Điều này rất thuận lợi cho quá trình
thu hồi sản phẩm mà không cần quá trình tách protein ngoại lai khỏi tế bào.
1.3.3.1. Promoter AOX1
Việc biểu hiện các gen ngoại lai trong P. pastoris đƣợc điều khiển hiệu quả
và chặt chẽ bởi promoter AOX1. Promoter này đƣợc kiểm soát ở mức độ cao trong
tế bào sinh trƣởng trên môi trƣờng glucose, glycerol và một số nguồn carbon khác,
nhƣng đƣợc cảm ứng mạnh mẽ bởi methanol [13]. Bƣớc đầu tiên trong quá trình
trao đổi methanol ở P. pastoris là sự oxy hóa methanol nhờ alcohol oxidase (AOX),
sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử và tạo thành hydrogenperoxid (H
2
O
2
) và
formaldehyde. Để tránh độc tố của H
2
O
2
, sự trao đổi methanol diễn ra bên trong
một bào quan chuyên biệt của tế bào là peroxisome, do đó peroxisome cô lập sản
phẩm độc khỏi phần khác của tế bào [44].
15 Hệ gen của P. pastoris chứa 2 gen alcohol oxidase là aox1 vào
aox2. Các vùng mã hóa protein của 2 gen này chiếm 92% gen và chúng tƣơng đồng
nhau đến 97% nucleotide. Tuy nhiên, gen aox1 chịu trách nhiệm chủ yếu về hoạt
tính AOX trong tế bào (gần 85%) [40]. Sự biểu hiện AOX1 đƣợc điều hòa chặt chẽ
ở mức độ dịch mã và đƣợc kiểm soát bởi cả cơ chế tiêu cực/tích cực và cảm ứng.
Enzyme AOX1 có ái lực thấp với oxy, nhƣng bù vào đó là promoter AOX1 vận

(Methanol utilization slow), ví dụ chủng KM71 (his4 aox1
∆::ARG4). Chủng bị loại bỏ hoàn toàn cả 2 gen aox1 và aox2 không có khả năng
sinh trƣởng trên môi trƣờng methanol có kiểu hình là Mut
-
, ví dụ chủng MC 100-3
16 (his4 arg4 aox1 ∆::ARG4 aopx2∆::Phis4). Tất cả các chủng này vẫn có khả năng
biểu hiện protein tái tổ hợp tốt nhờ có promoter AOX1. Tuy nhiên, các chủng Mut
-

rất mẫn cảm với nồng độ methanol dƣ thừa cao. Do vậy, sự thay đổi đột ngột các
mức độ methanol dƣ thừa thƣờng dẫn đến mất hoạt tính AOX và thậm chí tế bào có
thể chết. Để khắc phục nhƣợc điểm này, các chủng Mut
-
có thể đƣợc nuôi cấy theo
mẻ (fed-batch), hoặc sử dụng chủng Mut
s
không mẫn cảm với nồng độ methanol dƣ
thừa cao bởi vì tốc độ tiêu thụ methanol của chúng thấp. Ngoài ra, nồng độ các chất
khác của tế bào nhƣ proteinase cũng sẽ tăng theo mật độ tế bào. Điều này đặc biệt
ảnh hƣởng đến các protein tiết trong nuôi cấy tế bào mật độ cao, bởi vì sự phân hủy
tế bào sẽ giải phóng proteinase vào môi trƣờng nuôi cấy dẫn đến các protein tiết sẽ
bị phân hủy nhanh chóng. Do vậy, sử dụng chủng biểu hiện bị loại bỏ bớt gen mã
hóa các proteinase sẽ giảm sự phân hủy protein tiết. Chủng SMD1163 (his4 pep4
prb4),SMD1165 (his4 prb1) và chủng SMD1168 (his4 pep4) là các chủng khuyết
proteinase có thể đƣợc sử dụng để biểu hiện một số loại protein tiết nhất định
(Bảng1) [14].
Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ

1 kb, cho phép protein đƣợc biểu hiện mạnh trong Pichia và định hƣớng plasmid
tích hợp với hệ gen nấm men tại locus AOX1. Ngoài ra còn có trình tự nằm sau trình
tự kết thúc phiên mã ở đầu 3’ của gen aox1 cũng có tác dụng định hƣớng plasmid
tích hợp với hệ gen nấm men tại vị trí locus aox1.
(2) Một hoặc nhiều vị trí đa nối (MCS) cho phép chèn gen mong muốn vào
vector biểu hiện.
(3) Trình tự kết thúc dịch mã có nguồn gốc từ gen aox1 của P. pastoris (TT)
là trình tự dài khoảng 260 bp, cho phép kết thúc quá trình dịch mã và sự thêm đuôi
poly A ở mARN hiệu quả.
(4) Gen chỉ thị chọn lọc (his4) là một gen nguyên vẹn của Pichia mã hóa cho
histidinol dehydrogenase, dài khoảng 2,4 kb và đƣợc sử dụng để bổ sung cho các
chủng Pichia bị đột biến gen HIS4.
(5) Một trình tự cần thiết cho sự sao chép và tồn tại của plasmid trong vi
khuẩn (Ampicillin và ColE1 origin). Amp là gen kháng ampicillin cho phép chọn
lọc tế bào mang vector tái tổ hợp. ColE1 cho phép plasmid tái tổ hợp sao chép và
tồn tại trong tế bào vi khuẩn.
Ngoài ra, vector biểu hiện còn có trình tự chuyên biệt kích thích tiết protein
tái tổ hợp ra môi trƣờng nuôi cấy nhƣ trình tự PHO1 của gen mã hóa cho
phosphatase trong P. pastoris hoặc trình tự của gen mã hóa cho nhân tố giới tính α
(α factor prepro peptide) của S. cerevisiae đã đƣợc sử dụng thành công [15].
Để sử dụng promoter P
AOX1
cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp, có 4 vector
biểu hiện phổ biến là pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-S1 và pPIC9. Vector pHIL-D2 và
18 pPIC3.5 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein nội bào, còn pHIL-S1 và pPIC9 đƣợc sử
dụng để biểu hiện protein tiết. Trong đó, vector pPIC9 đƣợc sử dụng rộng rãi để
biểu hiện các protein.

Gen kháng Ampicillin: nucleotide 713-6853

Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9
ngoại lai trong nấm men P. pastoris [43]

19 aox1:: ARG4 không liên quan đến sự tái tổ hợp này nên kiểu hình Mut
+
của chủng
sau khi tái tổ hợp xảy ra giống với kiểu hình trƣớc khi tái tổ hợp.
Hình 4. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris tại locus his4 [43]
1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris
Các protein sau khi đƣợc tổng hợp ra thƣờng trải qua quá trình biến đổi sau
dịch mã. Trong quá trình này, các protein đƣợc hoàn thiện về mặt cấu trúc, hình
thành các trung tâm hoạt động và tạo nên cấu trúc bền vững của protein. Các protein
tạo ra sau quá trình chế biến có thể đƣợc giữ lại trong tế bào chất hoặc đƣợc tiết ra