ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------------------------------------------
HOÀNG PHÚ HIỆP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI
TRONG VI KHUẨN Echerichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên - 2008
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
Bảng viết tắt ............................................................................................................. 1
Danh mục các hình ................................................................................................... 2
Mở đầu .................................................................................................................... 3
Chương 1: Tổng quan tài liệu ............................................................................... 5
1.1. Bệnh tim mạch ............................................................................................. 5
1.2. Chất hoạt hóa plasminogen.......................................................................... 5
1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người ......................................................... 9
1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm
tan máu đông ............................................................................................. 12
1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô
người ......................................................................................................... 14
1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................... 18
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................ 19
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................ 19
2.1.1. Vật liệu ..................................................................................................... 19
2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 20
2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 20
2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose .................................................................. 20
2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide ................................................... 21
2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain
Reaction - PCR) ........................................................................................ 22
2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế ............................................................ 23
2.2.5. Ghép nối DNA .......................................................................................... 23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1
BẢNG VIẾT TẮT
Amp
Ampicillin
kb
Kilo base
Bp
Cặp bazơ (Base pair)
LB
Luria – Bertani
CIAP
Calf Intestinal Alkaline
Phosphatase
P
Vùng serine protease (Serine
protease)
ddNTP
Dideoxynucleoside
triphosphate
PA
Chất hoạt hóa plasmingen
(Plasminogen activator)
DNA
Deoxyribonucleic acid
PAI
Chất ức chế chất hoạt hóa
plasminogen (Plasminogen
activator inhibitor)
dNTP
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
GST
Glutathione S-transferase
SK
Streptokiase
h- tPA
Chất hoạt hóa plasminogen
mô người (Human tissue
plasminogen activator)
TAE
Tris-acetate- EDTA
IPTG
Isopropyl b-D thiogalactoside
tPA
Chất hoạt hóa plasminogen mô
(Tissue - type plasminogen
activator)
K1
Vùng Kringle 1
uPA
Chất hoạt hóa urokinase
(Urokinase - type plasminogen
activator)
K2
Vùng Kringle 2
v/p
Vòng/ phút
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2
Chọn dòng pGEX6p1
mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA)
34
3.4
Chọn dòng pET21a(+)
mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA)
35
3.5
Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA
bằng enzyme hạn chế
36
3.6
Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA
bằng kỹ thuật PCR
37
3.7
So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h-
tPA và pET21a(+)/h-tPA với NM_000930
42
3.8
Kiểm tra kiểm tra protein h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA p3
44
3.9
Kiểm tra protein h-tPA trong pET21a(+)/h-tPA p1
45
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp [39].
Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang
bắt đầu được tiếp cận. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa
plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh
học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất
phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã
hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của ngƣời trong vi khuẩn Escherichia coli”.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4
2. Mục tiêu nghiên cứu
Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector
và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli nhằm tiến tới sản xuất protein
h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp.
- Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli.
4. Những điểm mới của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm
tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược
phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở
nước ta.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh tim mạch
Bệnh tim mạch là các bệnh liên quan đến những rối loạn ảnh hưởng tới tim
và các mạch máu bao gồm bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh mạch máu
ngoại biên và tăng huyết áp. Bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong
trên thế giới. Mỗi năm, bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong cho 17,5 triệu
trong pha lỏng của huyết thanh. Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô
(tissue-type plasminogen activator, tPA), có khả năng tương tác với kháng thể chất
hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu. Loại thứ ba là streptokinase (SK). SK hoạt hóa
plasminogen bằng cơ chế trực tiếp. Cuối cùng là enzyme phân hủy tơ máu
(fibrinolysis) được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng
một số chất hoạt hóa vào thành mạch [18], [47].
Chất hoạt hóa plasminogen urokinase là sản phẩm chính của thận, tồn tại
dưới dạng phân tử chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type
plasminogen activator - scuPA) không hoạt động. Chất hoạt hóa plasminogen
urokinase được phân lập có hai dạng: dạng có trọng lượng phân tử cao (khối lượng
54,7kDa) và dạng có trọng lượng phân tử thấp (khối lượng 31,5kDa) [18]. Chúng có
hai chức năng: chức năng chính là tham gia trong phân giải protein mô liên kết và
chức năng thứ hai được biết đến với vai trò điều khiển của tPA như chất hoạt động
sinh lý trong máu [30]. Sự hoạt hóa của scuPA do sự phân hủy xung quanh bởi
plasmin trong cấu trúc hai sợi dẫn tới việc tăng hoạt tính của plasminogen lên.
Thông qua quá trình này, một số lượng nhỏ của plasmin có thể xúc tác sản phẩm
uPA hoạt động, ảnh hưởng tới hình dạng của nhiều plasmin. Chất hoạt hóa
plasminogen urokinase có thể chỉ hoạt hóa plasminogen với sự có mặt của fibrin.
Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin. Trong huyết
tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7ng/ml. Giá trị cao nhất thường được
tìm thấy trong bệnh nhân gan mãn tính và ung thư gan [9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Gen mã hóa tPA và protein này đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới
nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y- dược [31], [40]. Những nghiên cứu gần
đây cho thấy tPA còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh [49], [56]. Ở
người và các động vật khác, tPA đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hủy
fibrin [53], [54]. Đối với các trường hợp mắc bệnh huyết khối, sau khi tPA được
đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình
loại thuốc tan huyết khối được phép lưu hành: Alteplase tương ứng với chất hoạt hóa
plasminogen mô, có nguồn gốc từ DNA tái tổ hợp do hãng Genentech sản xuất [8];
Streptase tương ứng với streptokinase có nguồn gốc từ cầu khuẩn tan máu beta được sản
xuất bởi hãng Aventis Pharma; Urokinase biết đến với tên là Abbokinase được sản
xuất bởi hãng ImaRx Therapeutics, urokinase có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận
người; phức chất hoạt hóa Streptokinase plasminogen anisoylat hóa (APSAC); và
Tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hóa hóa plasminogen mô người gắn với fibrin
và làm biến đổi plasminogen thành plasmin. Tất cả các dạng thuốc này được dùng để
điều trị nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch.
Tuy nhiên, tùy từng trường hợp, các loại thuốc khác nhau được sử dụng để điều trị
một cách hiệu quả và ít tốn kém nhất. Ví dụ, Streptase là thuốc rẻ nhất nhưng chỉ
được dùng cho những trường hợp đặc biệt vì nhiều lý do như thiếu tính đặc hiệu với
sợi huyết, hiệu quả thấp, thời gian dùng thuốc kéo dài... Còn Alteplase được sử
dụng nhiều hơn trong điều trị nghẽn động mạch phổi lớn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9
1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô ngƣời
Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động
nội sinh của plasminogen trong máu. Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế
bào thành mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải
thoát một cách nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào
thành mạch máu [39]. Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết
khối về phương diện lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng
nhồi máu cơ tim [9], [27], [46]. Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA
hoạt động dưới dạng sợi đơn, đặc biệt khi có mặt của fibrin hoặc fibrinogen.
Ở người, gen mã hóa h-tPA là một gen đơn bản có vị trí ở 8p12 nằm trên
nhiễm sắc thể số 8 [20]. Ở chuột, gen này cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có vị
trí 24p22. Cấu trúc và chức năng của gen mã hóa cho h-tPA được xác định bằng kết
hợp nhân bản invitro của DNA hồng cầu từ những cá thể riêng biệt và phân lập
được các dòng từ thư viện gen người. Những dòng này được xác định bằng bản đồ
vùng nối ngắn. Các vùng này góp phần tạo nên các đặc tính sinh học đặc hiệu của cả
phân tử. Vùng F đóng vai trò chủ yếu tạo nên tính ái lực cao với tơ máu. Hoạt tính này
thể hiện tính đặc hiệu cao của h-tPA trong quá trình phân giải các khối máu đông giàu
tơ máu. Vùng EGF thể hiện hoạt tính gắn h-tPA với bề mặt tế bào, chức năng này được
Hình1.2. Các vùng của tPA
Formatted: Font: 13 pt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11
bảo thủ trong rất nhiều protein tPA ở động vật có vú. Vùng EGF chứa 6 cysteine, đây
là thành phần tạo nên cầu disulfide trong domain. Vùng kringle trong protease serine
rất quan trọng trong mối tương tác protein-protein trong quá trình hoạt hóa
plasminogen và phân giải tơ máu, hoặc quá trình chuyển đổi prothrombin-thrombin.
Vùng kringle 2 của h-tPA cũng liên quan chặt chẽ với quá trình gắn tơ máu và có khả
năng kích thích hoạt tính h-tPA đối với fibrin nên có vai trò quan trọng trong sự kết
hợp giữa h-tPA và tơ máu [16], [55]. Vùng kringle 1 không được xem như có liên quan
đến trong đặc tính kết hợp với tơ máu của h-tPA mặc dù trình tự amino acid của kringle
1 và kringle 2 có tính tương đồng cao [52]. Vùng P đảm nhiệm chức năng phân cắt
plasminogen bằng enzyme để tạo ra plasmin [37].
Protein h-tPA được tổng hợp và tồn tại trong tế bào màng trong mạch dưới
dạng chuỗi polypeptide sợi đơn, tuy nhiên h-tPA trưởng thành là một sợi đơn
glycoprotein có 530 amino acid; 32 amino acid trình tự đầu sẽ được cắt khỏi h-tPA
Hình 1.3. Cấu trúc h-tPA [38]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12
trước khi h-tPA được đưa ra bên ngoài tế bào. Plasmin, kallikrein huyết tương, hoặc
nhân tố Xa hoạt hóa h-tPA bằng cách cắt h-tPA ở vị trí Arg 275- Ile 276 thành hai
sợi (A và B), hai sợi này liên kết với nhau bởi cầu disulfide [15], [20], [28], [34],
thành mạch và chuyển một số tiền hormone và tiền cytokine thành dạng hoạt động
của chúng. Plasmin thường liên quan đến sự di căn của bệnh ung thư. Sự phát sinh
của plasmin xảy ra trước tiên trên bề mặt tơ máu, thường có điểm kết hợp cho
plasminogen và yếu tố cơ bản hoạt hóa của nó trong máu, tPA [59].
Quá trình làm giảm
và phân hủy tơ máu sẽ
được cân bằng trong quá
trình sửa chữa thành mạch
máu bị tổn thương. Tế bào
thành mạch máu bị tổn
thương sẽ giải phóng chất
hoạt hoá plasminogen
(tPA, uPA), hoạt hóa hệ
Hình 1.4. Quá trình phân hủy huyết khối [9]
Hình1.5. Con đƣờng phân giải tơ máu (Fibrin) [58]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14
thống phân giải tơ máu. Chất hoạt hóa plasminogen cắt plasminogen tạo thành
plasmin, là chất phân hủy huyết khối.
Nguyên tắc phân hủy tơ máu: bản thân quá trình phân hủy tơ máu được điều
hòa bởi các chất ức chế chất hoạt hoá plasminogen (plasminogen activator
inhibitors - PAIs) và chất ức chế plasmin (α2-antiplasmin), đây là những chất làm
chậm quá trình phân giải tơ máu. PAI-1, một chất quan trọng của PAI, làm cho tPA
và uPA không hoạt động và được giải thoát khỏi tế bào thành mạch và hoạt hóa tiểu
cầu. Chất ức chế tiền plasmin là α2-antiplasmin, rất nhanh giải phóng plasmin tự do
không hoạt hóa thoát khỏi huyết khối. Một vài α2- antiplasmin thường liên kết với
nhân tố XIIIa với tơ máu trong quá trình hình thành cục máu đông, nó có thể ngăn
ngừa quá mức plasmin hoạt động trong cục máu. Cả tPA và uPA đều nhanh chóng
sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn, và cụ thể hơn là từ E. coli, rất được quan tâm
nghiên cứu [23], [40].
Vi khuẩn E. coli: Gen mã hóa h-tPA đã được nghiên cứu và biểu hiện trên vi
khuẩn E. coli từ những năm 1983 [23], [40]. Trong nghiên cứu của Pennica và đồng
tác giả (đtg), lượng h-tPA thu được chỉ đạt khoảng 50- 80 µg/l dịch nuôi, tương
đương với 1500- 2400 phân tử h-tPA có hoạt tính/ tế bào [40]. Đến năm 1998, sau khi
tinh sạch, hàm lượng protein h-tPA thu được vào khoảng 180 µg/l dịch nuôi [42].
Gần đây, Zhu và đtg đã biểu hiện thành công protein h-tPA trong vi khuẩn E. coli với
hàm lượng protein h-tPA chiếm 30% tổng số protein của vi khuẩn [57].
Nấm men: Để khắc phục những nhược điểm của vi khuẩn nói chung và E.
coli nói riêng, người ta cũng có thể dùng hệ thống biểu hiện là các sinh vật nhân
chuẩn bậc thấp làm vật chủ tách dòng, như nấm men (ví dụ, Saccharomyces
cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) hay tảo. Ưu điểm của nấm
men là chúng có thể tiến hành rất nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống
như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá
đơn giản, không sản sinh nội độc tố và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy
mô lớn. S. cerevisiae là nấm men được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các
protein tái tổ hợp. Hiện nay, nấm P. pastoris cũng được sử dụng rộng rãi, hơn 120
protein tái tổ hợp đã được biểu hiện ở tế bào chủ này trong đó rất nhiều gen có
nguồn gốc từ người và động vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16
Chất hoạt hóa plasminogen mô người là một trong những protein động vật
được tổng hợp trên nấm Aspergillus nidulans [51], S. cerevisiae [35] và Aspergillus
niger. Đối với nấm A. niger, hàm lượng h-tPA được tổng hợp khoảng 0,07mg/g
sinh khối và tăng lên 1,9mg khi bổ sung peptone. Chất hoạt hóa plasminogen mô
người được tạo ra trong A. niger bị cắt thành dạng hai sợi có trọng lượng phân tử
giống với dạng h-tPA hai sợi của khối u người, dạng hai sợi này thường xuất hiện
sau 16h nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, thông thường chỉ dưới 1% sản phẩm h-tPA tạo
ra trong A. niger có hoạt tính, và dạng h-tPA hoạt hoá không bị mất khỏi dịch trong
các dịch thể dễ thu nhận như sữa (bò, cừu, dê...). Người ta đã tính toán và thấy
rằng sử dụng các động vật biến đổi gen để tổng hợp các protein trị liệu tái tổ
hợp sẽ có thể rẻ hơn bốn đến năm lần so với sử dụng các tế bào động vật có vú
nuôi cấy. Bên cạnh đó, thực vật, đặc biệt là ngô, cũng đã được nghiên cứu về
khả năng sản xuất các protein tái tổ hợp. Từ năm 1990, protein tái tổ hợp được
sản xuất từ cây thuốc lá và khoai tây chuyển gen để phục vụ cho y- dược đã bắt
đầu được thương mại hóa. Mười lăm năm tiếp theo, các loại DNA tái tổ hợp
được chuyển vào thực vật để thu nhận protein chữa bệnh như kháng sinh, sản
phẩm máu, cytokine, hormone sinh trưởng, enzyme tái tổ hợp, vaccine người và
động vật… [33]. Thực vật có nhiều ưu điểm hơn so với động vật trong việc tạo
ra các protein tái tổ hợp. Giống như nấm men, thực vật có khả năng tự thực
hiện nhiều khâu để tạo ra các protein phức tạp với chi phí cho trồng trọt khá
thấp. Sử dụng thực vật biến đổi gen không phát sinh các tranh cãi về đạo đức,
cũng như có thể tránh được các nguy cơ liên quan đến các virus, động vật, các
chất độc vi khuẩn. Tuy nhiên, hệ thống biểu hiện là thực vật biến đổi gen vẫn
còn một vài hạn chế. Thứ nhất, sản lượng protein tái tổ hợp do hệ thống biểu
hiện này sinh ra còn tương đối thấp. Thứ hai, tác dụng trị liệu của cùng một sản
phẩm protein có nguồn gốc thực vật và động vật là khác nhau. Ví dụ, nhiều
protein của người thường bị glycosyl hóa, nghĩa là sau khi được tạo ra, các
protein thường được gắn thêm một số gốc đường đặc trưng để giúp chúng kiểm
soát hoạt động chức năng một cách bình thường. Các nhà nghiên cứu đã thao
tác để vượt qua được hàng rào này bằng cách tạo ra các thực vật biến đổi gen
có thể tiến hành quá trình glycosyl hóa protein. Các thực vật biến đổi gen này
mang các gen của người mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình gắn các phân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18
tử đường vào protein. Một nhóm nghiên cứu ở Hà Lan đã tiến hành biến đổi vật
chất di truyền của một cây thuốc lá và sau đó lai cây thuốc lá biến đổi gen này
với một cây được thiết kế để sinh ra một loại kháng thể của chuột. Kết quả là
kháng thể này cũng có dạng glycosyl hóa, rất giống với kháng thể sinh ra bởi
h-tPA đã được chọn dòng trong vector pUC18 (pUC18/ h-tPA) trong nghiên cứu
trước đây [10].
Vector biểu hiện gồm hai loại: pET21a(+) được mua từ Hãng Novagen (Mỹ)
và pGEX6p1 được mua từ Hãng Pharmacia.
Bản đồ hai vector được trình bày trong hình 2.1:
Hình 2.1. Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1 Chủng E.coli DH5α được mua từ Hãng Invitrogen (Mỹ) và chủng E.coli
BL21(DE3) pLysS Competent Cells từ Hãng Promega (Mỹ).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ nhiều hãng khác
nhau. Danh sách các hóa chất cần thiết, các dung dịch sử dụng và trình tự mồi được
trình bày tương ứng ở các Bảng 1, 3 và 4 trong phần Phụ lục.
2.1.3. Các thiết bị
Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Gen và phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam được mua từ nhiều hãng khác nhau. Các thiết bị
thường sử dụng được liệt kê ở Bảng 2 phần Phụ lục.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose
Mục đích: Điện di giúp phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau,
từ đó xác định được sự có mặt các đoạn DNA quan tâm.
Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên đặc tính tích điện của
protein thường được tiến hành trên chất mang ở dạng gel là lưới polymer. Lưới
polymer làm chậm tốc độ di chuyển các phân tử protein theo khối lượng, kích
thước, độ mang điện của chúng.
Phương pháp điện di protein trên gen polyacrylamit có chứa SDS được tiến
hành theo phương pháp của Laemmli [29]. Thành phần gel được trình bày ở Bảng
11 phần Phụ lục. Quy trình điện di như sau:
- Pha mẫu với Protein Sample Buffer 4X và biến tính mẫu ở 95
o
C trong 5
phút. Dùng 10 l mẫu tra vào từng giếng và tiến hành điện di trên gel
polyacrylamide 10% gồm gel cô 4% và gen tách 10%.
- Đổ dung dịch chạy (Running buffer) SDS- Page 1x và chạy điện di: Chạy
ở hiệu điện thế 110V trong 2- 3 giờ. Theo dõi đến khi thấy màu dung dịch đệm mẫu
bắt đầu thoát ra ngoài dung dịch đệm chạy thì kết thúc.
- Bản gel được nhuộm trong dung dịch nhuộm (Comasive Brilliant Blue
R250) trong khoảng từ 30 phút đến 1 giờ.
- Tẩy gel bằng cách ngâm bản gel đã nhuộm vào dung dịch tẩy (acid acetic
7%, metanol 20%) đến khi bản gel màu trắng thì kết thúc quá trình tẩy. Thời gian
tẩy khoảng 30 phút. Sau đó gel được bảo quản và chụp ảnh.
Copyright: Tài liệu đại học ©