Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 1

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Ý nghĩa
AIDS
Acquired Immunodeficiency Syndrome
Amp
Ampicillin
APS
Amonium persulphate
Bp
Base pair
BSA
Bovine Serum Albumin
CBB
Comassie Brillant Blue
DNA
Deoxyribonucleic acid
Dntp
2’-deoxyribonucleoside 5’-triphosphate
ĐC
Đường chạy
E.coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylen Diamin Tetraacetic Acid
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay

SDS
Sodium dodecyl sulphat
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphat-Polyacrylamide gel
electrophoresis
TAE
Tris-Acetate-EDTA
Taq
Thermus aquaticus
TBS
Tris Buffered Saline
TE
Tris-EDTA
TEMED
N,N,N’,N’ – Tetramethylenediamine
TTBS
Tween-Tris Buffered Saline
Trx
Thioredoxin
v/p
Vòng/phút
v/v
Thể tích/thể tích
w/v
Trọng lượng/thể tích
X-Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D
galactopyranosite
và không chủ động sản xuất để sử dụng trên diện rộng với hàng triệu mẫu máu
cần kiểm tra. Để phù hợp với các phân type HIV lưu hành tại Việt Nam, cần
nghiên cứu sản xuất các kit chẩn đoán dựa trên type virus tại nước ta.
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 4

Với đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên gp120 của
virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam”; chúng tôi hi vọng có thể phục
vụ cho việc sản xuất các kit chẩn đoán HIV cho bệnh nhân tại Việt Nam có độ
chính xác tuyệt đối và độ nhạy cao.
Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện
Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 5

3
máu, dù chưa có triệu chứng lâm sàng. Thời gian trung bình từ
khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS là khoảng 12 - 13 năm. Một khi đã
bị AIDS, nạn nhân thường chết sau 18-24 tháng [4].
1.1.2. Sự xuất hiện của HIV/AIDS
Năm 1959, tại Zaize - châu Phi, lần đầu tiên phát hiện HIV dương tính trong
mẫu máu của bệnh nhân. Tháng 3/1981 nhiều trường hợp ung thư da Kaposi
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 6

được báo cáo ở New York; nguyên nhân của tình trạng này lúc đó chưa được
biết. Tháng 6/1983, Luc Montagnien và Barré Sinousi đã phân lập được virus
gây bệnh và đặt tên là LAV (Lymphadenopathy asoociated virus – virus liên
quan đến bệnh hạch). Năm 1984, Robert Gallot đã phân lập được 1 virus có ái
tính với Lympho T của người nên đặt tên là HTLV type III (Human
lymphotrophic virus type III). Cùng năm đó Levy đã phân lập được 1 virus có
liên quan đến hội chứng suy giảm miễn dịch và đặt tên là ARV (AIDS related
virus). Đến năm 1986, cả 3 được thống nhất gọi là virus gây bệnh suy giảm miễn
dịch trên người, viết tắt là HIV-1. Năm 1985, Barin và cộng sự phân lập được
HIV thứ 2 ở Tây Phi, đặt tên là HIV-2. HIV-2 có những đặc tính rất giống với
virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ viết tắt là SIV cũng ở Tây Phi [12][24].
Trên huyết thanh cất giữ và nay khi thử lại với HIV-1, HIV-2 thì huyết thanh
của người mắc bệnh ở Zaire cất giữ từ năm 1959 đã dương tính với HIV-1. HIV-
1 cũng đã được phân lập trên 1 bệnh phẩm của bệnh nhân ở Zaire cất giữ từ năm
1976. Trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ học thì HIV-2 có thể đã có ở Tây Phi từ năm
1966. Như vậy, có thể giả định HIV đã xuất hiện từ những năm 60 của thế kỷ
này hoặc trước đó vài trục năm. Nhưng đến thập kỉ 80 mới bùng phát thành đại
dịch HIV/AIDS [12][20].
1.1.3. Tình hình dịch bệnh

Hình 1.2 : Sơ đồ số lượng người đang sống chung với HIV từ năm 1990-2009
trên thế giới

1.1.3.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
Tính đến ngày 31/12/2010, đại diện Cục Phòng chống HIV/AIDS Việt Nam
cho biết: Số trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống là 183.938 người. Số bệnh nhân
AIDS hiện tại là 44.938 người. Số người nhiễm HIV đã tử vong là 49.477 trường
hợp [37]. Tính riêng trong 9 tháng đầu năm 2010, toàn quốc đã phát hiện được
9.128 người nhiễm HIV, 3.841 bệnh nhân AIDS và 1.498 người tử vong do AIDS.
Việt Nam ước tính đến năm 2011 có khoảng 311.500 người bị nhiễm căn bệnh thế
kỷ này [33].
Số lượng người nhiễm HIV/AIDS tập trung chủ yếu ở các thành phố lớn và điển
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 9

hình là thành phố Hồ Chí Minh với 42.454 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống,
tiếp theo là Hà Nội với 16.830 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Thái Nguyên
với 5.206 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống….[1] [2]. Cho đến hết 11/2010, đã
có trên 74% số xã, phường và 97,8% số quận/huyện trong toàn quốc đã có số người
nhiễm HIV/AIDS [3].
Phương thức lây truyền HIV ở nước ta chủ yếu là qua đường tình dục và tiêm
chích ma túy. Phân tích hình thái nguy cơ lây nhiễm cho thấy, trong số những
người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 9 tháng đầu năm 2010 có 49% bị
nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10%
không rõ đường lây [2][3].

Hình 1.3: Ước tính số trường hợp nhiễm HIV/AIDS tại TP.HCM và Việt Nam từ
2006-2010
1.1.4. Dịch tễ học

vậy dẫn đến suy giảm miễn dịch bao gồm cả miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch
thể. Các rối loạn chính trong đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS
gồm:
- Giảm tế bào lympho T toàn phần, đặc biệt là CD4 giảm nặng, tỷ lệ
CD4/CD8 giảm (< 1).
- Giảm chức năng các tế bào miễn dịch: giảm hoặc mất đáp ứng da, giảm khả
năng tăng sinh tế bào đối với các chất gây phân bào và kháng nguyên, giảm
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 11

đáp ứng độc tế bào do giảm chức năng tế bào CD8 và tế bào NK (tế bào giết
tự nhiên).
- Tăng gamma globulin
- Tăng phức hợp miễn dịch, tăng các tự kháng thể và một số protein khác
trong huyết thanh.
- Giảm đáp ứng kháng thể nguyên phát đối với các kháng nguyên mới tiếp xúc
lần đầu.
- Giảm gamma interferon [5].
Hậu quả của các rối loạn đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS là
bệnh nhân bị các bệnh nhiễm trùng cơ hội (thường do các vi khuẩn, virus, nấm, ký
sinh trùng sinh sản trong tế bào) hoặc mắc các loại ung thư đặc biệt (Sarcoma
Kaposi). Thời gian trung bình từ khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS
khoảng 10 – 12 năm. Sự tiến triển rất khác nhau giữa các bệnh nhân, phụ thuộc vào
cơ thể bệnh nhân, yếu tố virus và tác dụng của điều trị. Mỗi giai đoạn bệnh liên
quan chặt chẽ đến số lượng tế bào CD4 [5].
Bảng 1.1: Số lượng tế bào T
CD4+
trong máu ở các giai đoạn nhiễm bệnh
Giai đoạn

Phức hợp cận AIDS và AIDS thực sự.
1.2. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immune deficiency virus –
HIV)
1.2.1. Nguồn gốc HIV
Hiện nay, hầu hết các nhà khoa học cho rằng virus HIV có nguồn gốc từ virus
SIV (virus gây nội dịch không kèm triệu chứng ở nhiều loài khỉ tại Châu Phi).
Khảo sát tiến hành năm 1999 tại Đại học Alabama nhận thấy rằng HIV-1 rất giống
SIV tinh tinh (SIVcpz); và virus này đã có lúc vượt qua được giới hạn loài để đi từ
tinh tinh sang người. Họ đưa ra kết luận rằng tinh tinh hoang dã đã bị nhiễm cùng
lúc 2 chủng SIV khác nhau, 2 chủng này “giao phối “ và sinh ra 1 chủng virus thứ
3, chủng tứ 3 này có thể đã được lây sang những con tinh tinh khác, và điều đáng
chú ý hơn, là chủng này có khả năng gây nhiễm cho người và gây ra AIDS [32].
Sau 17 năm nghiên cứu thực địa tại các vùng Đông, Tây, Xích đạo châu Phi, các
nhà khoa học đã chứng minh có ít nhất có 40 loài khỉ khác nhau bị nhiễm với 40
type SIV khác nhau; 3 nhóm HIV-1 và 8 phân type HIV-2 khác nhau là kết quả của
11 biến cố nhảy sang loài khác, trong đó có sự tham gia của 8 loài khỉ mặt xanh và
3 tinh tinh đối với tất cả các trường hợp gây nhiễm ở người. Họ cũng kết luận rằng
3 nhóm HIV-1 (M, N và O) đều phát xuất từ SIV tìm thấy ở loài tinh tinh
chimpanzee, và mỗi nhóm đại diện cho 1 biến cố "nhảy" (crossover) riêng rẽ từ loài
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 13

tinh tinh sang người [32]. HIV-2 tương ứng với SIVsm, là 1 chủng của SIV tìm
thấy ở loài khỉ mặt xanh (sooty mangabey), là loài khỉ bản địa vùng Tây Phi. Type
HIV-1, có độc lực mạnh hơn, gây đại dịch nhiều hơn. Tuy nhiên, chủng virus này
vẫn còn có một số khác biệt với HIV ở nhiều điểm quan trọng [12][18].

Hình1.4: Nguồn gốc các type HIV
1.2.2. Vài nét về virus HIV

8 phân type; bao gồm: A, B, C, D, E, F, G, H.
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 15

Cả 2 type đều lây truyền qua quan hệ tình dục, qua đường máu, và từ mẹ sang
con; đều gây bệnh cảnh lâm sàng AIDS khá giống nhau và khó phân biệt. Tuy
nhiên, HIV-2 không dễ lây như HIV-1, và thời gian kể từ lúc mới bắt đầu nhiễm
cho đến khi xuất hiện bệnh ngắn hơn trường hợp HIV-1. HIV-1 gây nên đại dịch
trên toàn thế giới; khi nhắc đến HIV mà không đề cập đến loại virus, thì chỉ chung
HIV-1 [21].
Các chủng HIV-1 có thể được phân thành 4 nhóm: nhóm “M” (major= chính);
nhóm “O” (outlier= ngoài rìa); nhóm “N” (new= mới hoặc non- M non- O); và
nhóm P (một chủng mới, có quan hệ rất gần với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ
được phát hiện ở người phụ nữ Cameroon vào năm 2009). Nhóm O dường như chỉ
xuất hiện tại vùng Tây Phi, còn nhóm N cực kỳ hiếm, chỉ mới được phát hiện năm
1998 tại Cameroon. Trên 90% các trường hợp nhiễm HIV-1 đều thuộc nhóm M.
Trong HIV-1 nhóm M, có ít nhất là 9 phân type (subtype hoặc clade). Những phân
type đó là A, B, C, D, F, G, H, J và K [12] [22].
Đôi khi 2 virus thuộc 2 phân type khác nhau cùng hiện diện trong tế bào của
người nhiễm và chúng hoà trộn các chất liệu di truyền để tạo thành 1 virus lai
(hybrid) mới. Những chủng nào gây nhiễm được cho người khác sẽ được gọi là
CRFs (các thể tái tổ hợp lưu thông = circulating recombinant forms). Hiện nay đã
phát hiện có đến 30 CRF [22].
Các phân type HIV -1, CRF được phân bố không đều trên thế giới, trong đó các
phân type B và C phân bố rộng rãi nhất. Phân type C chủ yếu gặp tại miền đông và
Nam Châu Phi, Ấn độ và Nepal và gây ra các vụ dịch HIV nặng nề nhất; khoảng
một nửa các trường hợp nhiễm hiện nay là do phân chủng này.
Khóa luận tốt nghiệp


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 18 Hình 1.8: Vị trí các protein trong virus HIV
1.2.4.2. Cấu trúc gen và chức năng
Vật chất di truyền của HIV là sợi 2 RNA đơn (+) giống nhau. Mỗi sợi dài 8,5 –
9,5 kb; có khoảng 9200 cặp bazơ với hai nhóm gen: nhóm gen cấu trúc và nhóm
gen điều hòa sinh trưởng [10].

Hình 1.9: Cấu trúc genome của virus HIV-1
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 19

Nhóm gen cấu trúc
 gag (group-specific antigen): mã hóa các kháng nguyên đặc hiệu nhóm gồm
các protein cấu trúc bên trong : p17 (protein nền MA, tương tác với gp41);
p24 (protein lõi CA); p6 (protein lõi, gắn với Vpr); p7 (nucleocapsit NC,
gắn với ARN p1 và p2) [10].
 pol (polymerase): mã hóa cho các enzyme: protease (p10: phân cắt
polyprotein Gag và Gag-Pol), Reverse transcriptase (p66 và p51: có bản chất
là DNA polymerase phụ thuộc RNA và protein p66 có hoạt tính Rnase H) và
Integrase (cài xen provirus vào nhiễm sắc thể tế bào chủ) [10].
 env (envelope): mã hóa cho các protein vỏ gp120 (protein vỏ SU, giúp virus
gắn xâm nhập vào tế bào chủ); gp41 (protein xuyên màng TM, đóng vai trò
chính trong quá trình dung hợp tế bào) [10].
Nhóm gen điều hòa
 tat: mã hóa cho protein tat (Trans Acivator of Transcription – yếu tố hoạt

chức lympho ngoại vi, tại đây virus nhân lên nhanh chóng. Quá trình này diễn ra
qua các giai đoạn theo sơ đồ vòng đời của virus HIV (Hình 1.10), bao gồm các giai
đoạn:
Giai đoạn bám và gắn kết vào mặt tế bào: HIV bám vào bề mặt tế bào cảm thụ
nhờ sự phù hợp giữa thụ thể đặc hiệu tế bào gp120 của virus. Trong đa số các
trường hợp, các thụ thể này là các phân tử CD4 của tế bào lympho T hỗ trợ hoặc
một số tế bào khác như bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào dòng
lympho [10][12].
Giai đoạn xâm nhập và chui vào tế bào: Nhờ phân tử CD4 và các đồng thụ thể
CCR5 với đại thực bào và CXCR4 với tế bào lympho T, virus được hòa màng vỏ
của HIV với màng tế bào và xâm nhập vào tế bào chủ [10].
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 21 Hình 1.10: Vòng đời của virus HIV
Giai đoạn cởi bỏ vỏ và tiến hành sao chép ngược: Enzyme Reverse Transcriptase
sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA kép từ khuôn RNA genome virus. DNA
kép được tạo ra từ sự phiên mã ngược (provirus-tiền virus) dài hơn RNA genome.
Mỗi đầu có trình tự U3-R-U5, được gọi là đoạn lặp dài ở đầu chuỗi (LTR: long
terminal repeat). LTR chứa hầu hết các tín hiệu điều hòa phiên mã, chứa một
promoter, một đoạn tăng cường (enhancer), các tín hiệu kết thúc phiên mã và tín
hiệu gắn đuôi polyA. Quá trình sao chép ngược này có thể bị lỗi và dẫn đến xuất
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 22

hiện các đột biến. Những đột biến như vậy có thể gây ra sự kháng thuốc [10][12].
Giai đoạn nhân lên: Nhờ các tín hiệu định vị nhân, DNA chuỗi kép chui vào nhân

Gp120 là tên của các glycoprotein hình thành các gai nhô ra khỏi một hạt virus
HIV; và có 3 chức năng: Tìm các thụ thể thích hợp cho sự xâm nhập của virus; gắn
hạt virus với tế bào; trợ giúp và chỉ dẫn sự tiêm các vật liệu virus, trong đó chức
năng chính là liên kết với thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào người [15].
Gp120 có kích thước khoảng 1500 nucleotide (1,5kb), và được tổng hợp từ
khoảng 500 acid amin. 3 phân tử gp 120 kết hợp như các heterdimer với một phân
tử glycoprotein xuyên màng (gp 41), tạo thành một cấu trúc trimer để hình thành
gai vỏ. Vị trí liên kết CD4 của gp 120 bao gồm 400-430 acid amin [15].

Hình 1.11: Mô hình 1 gai trên bề mặt virus HIV
GP 120 có bản chất glycoprotein, được mã hóa bởi gen vỏ env. Gen env được
dịch mã trong màng lưới nội chất có hạt từ các mRNA đã được cắt nối thành một
polyprotein (gp 160). Tại đây, phân tử polyprotein mới hình thành được glycosyl
hóa một phần và được vận chuyển đến bộ máy Golgi, nơi chúng sẽ bị protease của
tế bào chủ (furin) cắt ra thành các phân tử SU (gp120) và TM (gp41) [12].
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 24 Hình1.12: Quá trình tổng hợp gp120 trong tế bào
Glycoprotein gp120 không có domain xuyên màng. Trình tự mã hoá gp120 ở
những chủng HIV khác nhau có biến đổi cao. Sự biến đổi này có thể do biến đổi
sắp xếp ở 5 domain siêu biến (V1-V5); 5 domain siêu biến này tương ứng nằm ở
các vị trí từ acid amin thứ 128-152; từ 182-195; từ 300-330; từ 395-415; từ 460-
467 [21].

Hình 1.13: gp120 có 5 domain siêu biến (V1-V5)
Khóa luận tốt nghiệp