I HC QUC GIA HÀ NI
I HC KHOA HC T NHIÊN Phng
NHÂN DÒNG VÀ BIU HIN TRÊN B MT BÀO T
BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28
CA VIRUS GÂY BM TRNG  TÔM
Chuyên ngành: Hóa sinh hc
Mã s: 62 42 01 16

D THO TÓM TT LUN ÁN TIC HÀ NI - 2014
2


M U
1. Tính cp thit c tài
Nuôi tôm  Vin mnh trong nh
và tr thành ngành kinh t quan trng. Tuy nhiên, ngành nuôi trng tôm 
Vit Nam hi   c nhi    ch bnh, cht
ng tôm ging sa sút. S bùng n ca các dch bnh nghiêm trng do
virus (WSSV), m
 sng tôm, gây thit hi ln v kinh t.
Nhiu nghiên cu trên th gic ti tìm ra gii pháp
hiu qu chng l   t qu  c còn hn ch. Mt
ng nghiên cc nhiu nhà khoa hc trên th gin là to
các vaccine da trên protein cu trúc c ng
min dch  tôm chng li bm trng. VP28 là mt loi protein v
chính ca WSSV,  o giúp virus gc hiu lên t bào
c khu cho quá trình lây nhim. Chính vì vy, VP28 là
c la ch to kháng th cho
vaccine cho tôm phòng b m trng (Rout và tp th, 2007;
Witteveldt và tp th, 2004). Tuy nhiên, nhng kt qu nghiên cu to
vaccine phòng bm trng do WSSV  mi dng li  mc
th nghim nh lc mt vaccine chính thc, hiu qu.
i “Nghiên cứu
nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa
kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” bào
t Bacillus subtilis biu hin kháng nguyên VP28 ca virus gây bm
trng làm  cho vic sn xut vaccine dng probiotic bn nhit giúp
phòng bm trng trên tôm.
2

2. Mc tiêu nghiên cu c tài
-

dòng và biu hin gen mã hóa protein VP28 tái t hp  E. coli và Bacillus
subtilis nh trình t và mt s a gen VP28 t
các mu WSSV phân lc  Vit Nam.
- Nghiên cu biu hin thành công gen mã hóa protein VP28 ca
WSSV trên b mt bào t B. subtilis i dng các cu trúc protein dung
hp CotB-VP28 và CotB-GST-, CotB là protein v ca B.
subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhm
hn ch cn tr i vi VP28.
- tu kin thu nhn bào t tái t hp B. subtilis biu
hin tt kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t và nghiên cu
các tính cht ca bào t tái t hp B. subtilis CotB-VP28, CotB-GST-
VP28 trong mt s u king khác nhau.
- c ho ca các enzyme phenoloxidase
(PO), superoxide dismutase (SOD) phn ánh min dch ca tôm
th m trng trên tôm
70% ca bào t B. subtilis biu hin VP28
trên b mt.
6. ng dng thc tin c tài
- Kt qu nghiên cu c   to ch phm probiotic
dng bào t B. subtilis tái t hp bn nhit, biu hin VP28 trên bn mt,
có kh ng min dch và bo v tôm khi nhim bm
trng, giúp góp phn kim soát dch bnh trên tôm.
- Thành công c tài s là ti cho vic phát trin các vaccine
tái t hp dng bào t B. subtilis tái t hp có kh nh do các
vi sinh vt khác gây ra  tôm.
4

7. B cc ca lun án
Lun án gm 120 trang bao gm: Phn m u (3 trang); Tng quan
tài liu (40 trang); u (19 trang); Kt

t quan trng trong nhu tiên ca quá trình nhim
WSSV vào tôm (Van Hulten và tp th, 2001). i
pháp hiu qu  ngn nga s tn công ca loi virus này  tôm.
1.2. Nghiên cu to vaccine da trên kháng nguyên v WSSV
Tôm thu     min dch ,
t s nghiên cu gy có kh c
hic kích thích bi các dng kháng nguyên VP28. 
protein VP28
. c
biu hin thành công  E. coli (Zhang và tp th, 2002; Sathish và tp th,
2004; Witteveldt và tp th 2004; Jha và tp th, 2005; Caipang và tp th,
2008; Hou và tp th, 2011; Syed-Musthaq và tp th, 2011; Mu và tp th,
2012). S dng VP28 là mt bi ng
sót ci vi WSSV. , y có là khó
áp dng trên thc t do protein VP28 không bn vng nc cho
trc tim nuôi tôm
  sn xut cao.
 nghiên cu tp trung vào vic phát trin các
dng vaccine vi khun sng tái t hp biu hin VP28. 
cho thy rng các loi bào t tái t hp VP28 giúp bo v  l
6

sng ca tôm khi th nghim vi WSSV so vc dùng bào
t tái t hp VP28 (Fu và tp th, 2010; Ning và tp th, 2011). Tuy vy
các kt qu nghiên cu mi ch      t loi vaccine
chính thc to ra. Vì vy vic tip tc nghiên c tc
vaccine phòng bm trng là ht sc cn thit.

th chân trng (2-5g/con) dùng trong th nghim th thách kh o
h phòng nga WSSV c Phân viên nghiên cu nuôi trng Thy
sn Bc Trung b thuc Vin nghiên cu nuôi trng thy sn 1.
2.1.2. Nguyên liệu
Chng vi khun B. subtilis PY79 và vector pDG364, pDG364-CotB;
pDG364-CotB-GST là quà tng ca GS. Simon Cutting, i hc Hoàng
gia Holloway, London, Anh.
Các chng vi khun E. coli  E. coli   c
mua t hãng Novagen. Vector pET28b ca hãng Novagen (M); các
oligonucleotide ca hãng Life Technology, kit nhân dòng trc tip sn
phm PCR pGEM TA easy và   c mua t hãng
Promega; thang chun protein, thang chun DNA 1kb và 100 bp, hn hp
 c mua t hãng Fermentas; Hot-   c
mua t hãng Enzynomics; kit thôi gel c mua t Bioneer; MagPure
viral DNA/RNc mua t ANABIO R&D; Qiaprep-miniprep
c mua cc mua t hãng Biobasic.

Các cp m c thit k c hi   n gen mã hóa cho
VP28 ca virus gây bm trng WSSV, cotB; cp mc hiu cho v
8

trí amyE front, amyE back ca vector pDG 364, cp mi ca vector pGEM
T và cp mi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv ca hãng Life Technology.
u
2.2.1. Thu nhn virus gây bm trng t mu tôm nhim bnh
2.2             
-time PCR
2.2.3. Nuôi cy to bào t B. subtilis  Nicholson và
Setlow (1990)
2.2.4. Tách chit, ANABIO R&D, ng

u có cho mn duy nht v
tính toán lý thuyt (615 bp) ca vp28. 
 Kt qu này cho phép
khnh rn gen mã hóa cho
VP28 t DNA h gen ca tôm nhim vm trng
3.1.2nh trình t và nghiên ca gen mã hóa VP28

o-
10


 gen vp28 
trvp28 vp28 
 ( 2003) 
 AY168644 (3.2) 
  eotide         
                
(A125G ->D42G, A183G -> T76A, A403G-> T135A, T517C-> C173R).

Bng 3.2: Mt s sai khác ca v à acid amin ca
VP28 thu thp ti Vit Nam so vi trình t  (AY168644)
Tên mu
Sai khác
nucleotide
Sai khác mc axit
amin suy din
   n, Cam Ranh
1.2 Khánh Hòa và Cn Gi 1, 4, 7, 9,
10  thành ph H Chí Minh


       i các mã s
(accession number) ng là JX444992.1, JX444993.1 và JX444994.1.
3.2. NGHIÊN CU BIU HIN GEN MÃ HÓA VP28
3.2.1. B28 bng h thng vector pET28b trong E. coli
pGEM  
          Cp m c
hiu (VP28.2 Fw/c thit k da trên trình t u ca
gen vp28  nhn bit ca BamHI  u và HindIII
 cu thun tin cho ghép gen vào vector pET28b v sau.
  vp28      VP28.2 Fw/  x lý
HindIII và BamHI pET28b 
hai enzyme, bin
np vào chng E. coli BL21-RIL. Vector tái t hp pET28b-
c tách ra, tinh sch và gii trình t n gen vp28, s dng cp mi
T7Fw/Rv. Kt qu c trình t khnh chc chn gen vp28 c
g và v  
 khvp28 vào vector pET28b.

12

Kt qu biu hin gen vp28 c kim tra bng SDS-PAGE và thm
tách min dch (Hình 3.6) cho thy dch chit t bào BL21-RIL mang
vector pET28b-VP28 có chng chy 7, 8, 9,
 mi chng âm (t bào BL21-RIL không
mang vector pET28b-VP28) tein này. Kt qu thm tách
min dch, s dng kháng th c hiy s có
mt c      các m  ng vi mu trên SDS-
ng chy 7, 8, 9, Hình 3.6B). T t lun r
biu hic VP28  E. coli.


phép khnh ch thành công protein VP28. Kt
qu ng protein cho thy t 100 ml dch nuôi c
c tng s 1,26 mg protein VP28-Histag. Protein VP28 tinh sc
s di chu v biu hin trên b
mt bào t tip theo.

Hình 3.7: Kt qu SDS-PAGE (A) và thm tách min dch (B) kim
 tinh sch ca VP28
1: Dch chit t bào có cha protein VP28lên ct His-bind
2: Dch ra ct His-bind bm A có imidazol 5 mM
3: Dch ra ct His-bind bm A có imidazol 80 mM
14

4: Dch ra ct His-bind bm A có imidazol 100 mM
5: 
6-9 Dch ra chit ct His-bind bm A có Imidazol 250 mM
3.2.2. Biu hin VP28 dng dung hp vi protein CotB trên b mt
bào t B. subtilis
Plasmid pDG364-cotB, pDG364-cotB-    
plasm-
 BamHI, HindIII. V    (26 kDa)  
               B.
subtilis    , 2008). Vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST

 B. subtilis. Trong
    pDG364cotB-VP28, pDG364cotB-GST-VP28 
 
 bp, 1325 otB  và
.


B) a chn cy chuy

1-30: các khun lc kim tra 1-30

-): B. subtilis PY79 dng th di không chn gen dung hp

 kim tra chc chn s có mt ca gen cotB-vp28, CotB-GST-
vp28 trong h gen ca B. subtilis, chúng tôi tin hành nuôi  tách
DNA ca 02 khun lt qu phn ng PCR vi các cp
m   c nhng kt qu hoàn toàn phù
hp vi tính toán lý thuyt.
16

T kt qu này, có th kt lun rp thành công gen
cotB-vp28, CotB-GST-vp28 vào h gen ca B. subtilis và chng tái t hp
   là B. subtilis CotB-VP28 và B. subtilis CotB-GST-VP28.
Mt s khun lc ca 2 chng tái t hp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28
c chn nuôi, to bào t  kim tra s biu hin ca VP28. So sánh bào
t ca chng chun B. subtilis PY79 vi bào t ca chng CotB-VP28 và
CotB-GST-VP28, chúng tôi nhn thy không có s khác bit v mt hình
thái. Bào t to thành bi 3 chng 
 nh VP28 có biu hin trên lp áo ca bào t và
dung hp vi CotB hoc CotB-GST hay không, chúng tôi thu dch chit
tng s t 5× 10
9
bào t chng B. subtilis PY79, CotB-VP28 và CotB-
GST-VP28  phân tích    28 bng-  
 kháng th . Theo tính toán lý
thuyt, protein dung hp gia CotB-VP28 có KLPT khong 63 kDa (CotB
khong 35 kDa và VP28 28 kDa), p

 c rt yu, h  cùng
u kin kích thích, mu bào t CotB-VP28, CotB-GST-VP28 cho thy
các tín hi sáng nét, rõ ràng, chng t bào t tái t hp biu hin
VP28 mu so vi dng bào t PY79. , protein dung
18

hp CotB-VP28, CotB-GST-VP28 trên b
mt bào t B. subtilis.

Hình 3.14: in dch hunh quang kim tra biu
hin CotB-VP28 và cotB-GST-VP28 trên b mt bào t
B. subtilis
Ning và (2011) u hin protein VP28 trên b mt ca
bào t B. subtilis s dng mt n DNA 825 bp mã hóa cho 275 acid
u tiên ca CotB làm yu t dung hp. Mc dù, m biu hin
ca protein VP28  kc kim
tra bt qu th
nghiu khnh ch phm to ra có kh 
li s tn công cm trng.
Các chng CotB-VP28, CotB-GST-VP28 c ly ra và nuôi cy to
bào t và nghiên cu mt s tính cht ca bào t cho thy bào t tái t hp B.
subtilis cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 c to thành t 
19

ng DSM sau 48 gi t m ng là 3,1 x 10
9
, 4,2 x 10
9
,
bn  nhi 80

ca bào t tái t hp
  giá kh  n dch ca bào t tái t hp, 
  enzyme superoxide dismutase (SOD) và   phenoloxidase
(PO)     tôm
.  3.25) o PO  tt c các mu
c cho th sung hay có b sung bào t th di PY79,
bào t B. subtillis CotB-GST-VP28 và CotB-VP28 thp nht  thm 0
sau 7 hoc 14 ngày tùy theo tng lô.
B. subtilis- (30%) 
.

Hình 3.25. Ho phenoloxidase (PO) trong hemolymph ca tôm th
chân tr tái t hp
Kt qu phân O 3.26) cho thy
có s B. subtilis d

B. subtilis--
21

84,3% 
    B. subtilis
CotB-VP28 B. subtilis PY79.

Hình 3.26. Ho enzyme SOD trong mô tht ca tôm th chân trng
3.3.3.  o h trên tôm th chân trng ca bào t
tái t hp

            
   WSSV    . B 
pháp Real-time PCR c s bn copy ca WSSV

s


  94,5% sau 14 ngày. Ti lô  trn bào t cotB-
VP28, cotB-GST-i chng âm t l cht sau 14 ngày theo
ghi nhng là 19,23%, 26,67% và 25,81%. Hình 3.32 T l cha các lô tôm khi  o
h ca bào t B. subtilis tái t hp
23

 bo  chân trng
ca các dng bo t CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 ( m
bào t 1 x 10
9
CFU/g th) ng là 81% và 73,3%. Các giá tr này
u cao
c hiu qu nh hiu qu
bo v ca vaccine  thy sn và thu kin v 
hiu qu vaccine dng cho thy sn ca y ban châu Â
phm th nghim này có ti  o v tôm chng li bm
trng do WSSV gây ra
.
           B. subtilis
--GST-VP28 
, (2-10), 
 (4%)
 
