Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể
đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến
EPCA bằng công nghệ gen Nguyễn Kim Hoàn Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: PGS.TS. Lê Quang Huấn
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Nghiên cứu Gen scFv mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư
tiền liệt tuyến EPCA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và
chu trình nhiệt phù hợp, sau đó được đưa vào vector phagemid pHEN2 để tạo vector
tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp pHEN2-scFv sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn
E.Coli chủng TG1 có bổ sung kháng sinh ampicillin, các khuẩn lạc mọc trên đĩa
được kiểm tra và chọn lọc các dòng mang vector. Kháng thể phage-scFv tạo ra kết
hợp với kháng nguyên EPCA trong huyết thanh bệnh nhân bị bệnh và không bị bệnh
để kiểm tra ái lực thông qua phản ứng ELISA. Bước đầu có thể sử dụng để chẩn
đoán các bệnh nhân là dương tính hay âm tính với ung thư tiền liệt tuyến.

Keywords. Sinh học thực nghiệm; Công nghệ gen; Gen mã hóa; Ung thư tiền liệt
tuyến Content
LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, ung thư được coi là căn bệnh đe dọa nguy hiểm và trầm trọng nhất đối với

Tuyến tiền liệt là một cơ quan nằm ở bụng dưới hay cổ bàng quang (hình 1). Là tuyến
bao quanh đoạn đầu niệu đạo. Tuyến tiền liệt là một khối hình nón mà đáy ở trên, đỉnh ở
dưới. Tuyến rộng 4cm, cao 3cm và dày 2,5cm, nặng trung bình 15-20g và thường to lên theo
tuổi (hình 2) [1].
Tuyến tiền liệt tiết ra chất dịch có màu trắng sữa, mang tính kiềm và chứa acid citric,
calcium, acid phosphat, enzyme làm đông vón và profibrinolysin. Trong thời gian phóng tinh,
các túi của tuyến tiền liệt co bóp cùng với co bóp của ống dẫn tinh để đẩy dịch tiết của nó gộp
với dịch từ ống dẫn tinh làm tăng thể tích tinh dịch. Dịch tiết của nó có tính kiềm sẽ trung hòa
bớt độ acid trong tinh dịch (độ acid do sự hiện diện của các sản phẩm trao đổi chất của tinh
trùng), vì vậy mà giúp tinh trùng đạt được khả năng vận động và thụ tinh ở mức tối ưu.
Một chức năng khác của tuyến tiền liệt là giúp kiểm soát nước tiểu bằng cách tạo áp lực
trực tiếp đối với phần niệu đạo mà tuyến tiền liệt bao quanh’
Ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) là loại ung thư phổ biến ở nước ta cũng như các nước
trên thế giới. Bệnh chiếm 10% trong số các ung thư ở nam giới, ở các nước tiên tiến tỷ lệ này
là 15% và là nguyên nhân tử vong thứ hai của bệnh ung thư, sau ung thư phổi. Theo thống kê,
hàng năm ở Mỹ có đến 132.000 người Mỹ bị UTTLT, và khoảng 34.000 người tử vong vì
căn bệnh này.
Ung thư tuyến tiền liệt là khối u ác tính phát triển từ tế bào của tuyến tiền liệt. Khối u
thường phát triển chậm và kéo dài trong nhiều năm. Trong suốt thời gian này, khối u thường
có rất ít hoặc không có biểu hiện triệu chứng bất thường khi khám bệnh. Tuy nhiên, khi ung
thư tiến triển, khối u lớn lên và xâm lấn sang mô xung quanh (lan rộng tại chỗ). Hơn nữa, ung
thư cũng có thể di căn (lan xa hơn) đến các vùng khác của cơ thể như xương, phổi, gan. Triệu
chứng ở những nơi di căn kết hợp với triệu chứng của UTTLT [8].
Nguyên nhân gây ra UTTLT vẫn chưa được nghiên cứu rõ, UTTLT không liên quan đến
phì đại tuyến tiền liệt lành tính. Các yếu tố nguy cơ bị UTTLT bao gồm: lớn tuổi, di truyền,
ảnh hưởng của nội tiết tố cũng như chất độc trong môi trường, hóa chất và các sản phẩm công
nghiệp.
Tầm soát UTTLT là việc cần được làm thường xuyên và cách đều nhằm phát hiện
UTTLT giai đoạn sớm. Nếu kết quả tầm soát bình thường thì coi như hiện tại không mắc
bệnh, nếu kết quả bất thường thì nghi ngờ có bệnh và cần làm thêm một số xét nghiệm khác

thể và thụ thể trên các tế bào lympho. Một chất gây miễn dịch là một kháng nguyên được cơ
thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng.
1.2.2. Kháng nguyên EPCA ( Early Prostate Canner Antigen).
EPCA là một protein có trong chất nền của nhân tế bào. Điều đặc biệt là EPCA được
biểu hiện mạnh trong các mô ung thư và các mô bình thường sát kề mô ung thư ở bệnh nhân
ung thư tuyến tiền liệt, nhưng lại không biểu hiện ở mô tuyến tiền liệt của người không bị
ung thư, do vậy xác định chỉ thị EPCA sẽ làm giảm nguy cơ các trường hợp âm tính giả khi
sinh thiết. EPCA có khối lượng phân tử khoảng 40kDa và điểm đẳng điện khoảng 6,73. Sử
dụng kháng nguyên EPCA có thể phát hiện mầm bệnh ở bệnh nhân sớm hơn 1-2 năm trước
khi có biểu hiện về hình thái ung thư tuyến tiền liệt. Các kháng thể kháng EPCA có hiệu quả
như một yếu tố góp phần nghiên cứu bệnh lý của các mẫu sinh thiết tiền liệt tuyến để phát
hiện ung thư tuyến tiền liệt sớm hơn so với làm sinh thiết nhiều lần, cũng như có tiềm năng
giới hạn số lần làm sinh thiết ở một bệnh nhân [26].
1.3. KHÁNG THỂ
1.3.1. Cấu trúc
Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ thể tấn công
các tác nhân gây bệnh. Các kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do
các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hoá từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn
dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus [4].
Chuỗi nhẹ
Có trọng lượng phân tử 25kDa, chứa khoảng 211 – 221 axit amin. Có hai loại chuỗi nhẹ là
kappa (Қ) và lambda (λ). Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ Қ hoặc hai chuỗi nhẹ λ
mà không bao giờ chứa cả hai loại. Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai vùng axit amin: vùng biến
đổi (V
L
) nằm ở đầu phía đầu amin (-NH
2
) của phân tử và vùng cố định (C
L
) nằm ở phía đầu

V
L
. Dạng tái tổ hợp của Fv là mảnh biến đổi đơn chuỗi được nối với nhau bằng một đoạn
peptide, thường gồm 15 axit amin có trình tự (Gly
4
Ser)
3
và được biểu hiện như một chuỗi
polypeptide đơn. Đoạn nối cho phép vùng biến đổi của chuỗi nặng (V
H
) kết hợp với vùng
biến đổi của chuỗi nhẹ (V
L
) tạo thành phân tử đơn chuỗi. Phân tử tái tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn
hoạt tính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích [45]. Đặc điểm của các mảnh
kháng thể khác nhau được tóm tắt trong bảng 2.
1.3.3. Kháng thể tái tổ hợp
Kháng thể tái tổ hợp là thuốc thử cần thiết cho nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị [25].
Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh ngày
càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc từ người, nhưng nguồn kháng thể
người thường khó kiếm được. Vì vậy, phương pháp chung để thu nhận được các kháng thể là
từ động vật gây miễn dịch và sau đó nhân tính hoá để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi
sử dụng.
1.3.4. Kháng thể đặc hiệu các loại kháng nguyên
Phản ứng kháng nguyên - kháng thể rất đặc hiệu, vì vậy để thu nhận được các kháng thể
đặc hiệu kháng nguyên đích ta cần hiểu rõ mối tương tác kháng nguyên - kháng thể, xác định
nét đặc trưng của kháng thể đối với các kháng nguyên có nguồn gốc, bản chất khác nhau.
1.3.5. Các phƣơng pháp tạo kháng thể.
Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh
ngày càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc của người. Vì vậy, phương

một loại protein chủ yếu và một vài loại protein thứ yếu phân bố ở hai đầu ống
Hệ gen của phage hình sợi nhỏ, có khoảng hơn 10 gen phân bố sát nhau và một vùng
không mã hóa (vùng IG) chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bản và đóng gói của phage.
Không giống với các virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi được tổng hợp và giải
phóng ra khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ. Hầu hết các thông tin về
phage hình sợi đều nhận được từ các nghiên cứu về phage f1, M13, fd và một phần nhỏ từ
phage Ike. Các phage f1, M13, fd đã được sử dụng để biểu lộ các chuỗi polypeptide. Hệ gen
của các phage hình sợi có sự tương đồng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chúng
có thể thay thế cho nhau và vì vậy các phage này được gọi chung là phage Ff
Tính đặc hiệu của bất kỳ kháng thể nào phụ thuộc vào các vùng quyết định tính bổ trợ
(CDR): 3 vùng CDR trên chuỗi nặng và 3 vùng CDR
chuỗi sử dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư, (ii) phân tách kháng thể từ người
bệnh do virus để hiểu tốt hơn về đáp ứng miễn dịch trong quá trình xâm nhiễm của virus, (iii)
làm sáng tỏ tính đặc hiệu của kháng thể tự miễn và nghiên cứu sự tương tác giữa các phân tử.
Các đoạn kháng thể dạng Fab và scFv đều có thể được bộc lộ trên bề mặt của thực khuẩn thể
M13 mà không mất đi ái lực và tính đặc hiệu kháng nguyên.
Về cơ bản, để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen mã hóa chuỗi
nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược
và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid để
có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của phage [27]. Thông thường các trình tự gen tái
tổ hợp mã hóa các đoạn kháng thể được nối với đầu N của gen mã hóa protein vỏ pIII và
pVIII hoặc cũng có thể gắn với đầu N của protein vỏ pVII, pIX.
Chất lượng thư viện có thể được kiểm tra theo các thông số sau:
 Số lượng các dòng chứa phagemid mang đoạn scFv.
 Số lượng dòng biểu hiện phage mang scFv.
 Số lượng dòng biểu hiện kháng thể scFv hòa tan.
Một số thư viện đã được tạo ra và sử dụng phổ biến là Nissim Library, được tạo ra trong
phòng thí nghiệm của Dr.G.Winter tại Cambridge (1994), và thư viện của De Kruif và cộng
sự (1995). Nổi bật nhất là thư viện tổng hợp Fab và scFv do Griffiths và cộng sự tạo ra.
Cách đơn giản và thường được sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và

 Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, CHLB Đức).
 Máy lắc ổn nhiệt.
 Bể ổn nhiệt.
 Lò vi sóng (Samsung).
 Tủ lạnh sâu (-20
0
C, -85
0
C);
 Máy Voltex (Rotolab, OSI).
 Máy điện di.
 Máy đo pH.
 Tủ cấy vô trùng.
 Pipetman các loại (Gilson, Pháp).
 Máy soi chụp gel (Pharmacia) và các thiết bị khác chủ yếu thuộc phòng thí nghiệm
trọng điểm, Viện Công nghệ Sinh học.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nhân bản gen bằng kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.2.2. Phƣơng pháp cắt và gắn DNA
2.2.3. Phƣơng pháp tạo tế bào khả biến E.coli TG1.
2.2.4. Biến nạp Plasmid vào tế bào E.coli
2.2.5. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong bình tam giác với thể tích từ 20 – 50 ml chứa 5-
15ml môi trường thích hợp cho từng loại. Bình nuôi cấy được đặt trong máy lắc ổn nhiệt ở
37
0
C với tốc độ lắc 220v/ph.
2.2.6. Phƣơng pháp giữ chủng
Các khuẩn lạc đơn được trải trên môi trường thạch thích hợp, ủ 37
0

bất kỳ phức hệ kháng nguyên-kháng thể nào cũng phát sáng đủ để lượng kháng nguyên trong
mẫu có thể đo được thông qua cường độ phát sáng. CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nhân bản gen mã hóa mảnh kháng thể scFv bằng PCR.
Để có thể thu được gen mã hóa mảnh kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của
bệnh ung thư tiền liệt tuyến đủ cho việc thiết kế vector biểu hiện, chúng tôi thực hiện phản
ứng nhân gen bằng kỹ thuật PCR với 2 mồi đặc hiệu: TTLF: 5’-
GGCCCCATGGCCATTGCGGGCCTG – 3’
TTLR: 5’- GATGTGCGGCCGCACGTTTGATTTC – 3’
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gen agarose như hình 1:

Hình 1: Điện di sản phẩm PCR
M: Marker DNA 1kb ( Fermentas), G1: Sản phẩm PCR.
Hình ảnh điện di trên cho thấy sản phẩm PCR thu được khá đặc hiệu, kết quả phù hợp
với tính toán lý thuyết, băng thu được có kích thước như mong muốn là 496 bp. Như vậy, có
thể khẳng định chúng tôi đã nhân bản thành công gen scFv mã hóa cho mảnh kháng thể scFv
500
bp
M 1
đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT, gen thu được mang hai vị trí cắt của hai enzyme
giới hạn NcoI và NotI.
3.2. Kết quả tạo vector tái tổ hợp pHEN2 - scFv
Từ nguồn sản phẩm PCR thu được ở trên, chúng tôi đã sử dụng các enzyme giới hạn
NotI và NcoI xử lý chúng để tạo hai đầu dính giúp cho việc gắn gen vào phagemid được dễ
dàng hơn. Tương tự, phagemid pHEN2 cũng được xử lý với hai enzyme trên tạo hai đầu dính
bổ sung. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong bể ổn nhiệt 37
o

bào vi khuẩn TG1 thu được có chứa phagemid pHEN2 còn pHEN2 đã chứa gen scFv hay
chưa thì chưa xác định được. Do đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra chọn dòng tế bào TG1 chứa
phagemid tái tổ hợp 3.3. Chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT
Để tiến hành chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT chúng tôi
sử dụng phương pháp PCR khuẩn lạc. 7 khuẩn lạc được chọn để tiến hành PCR cùng
phagemid gốc với cặp mồi của vector pHEN2 có tên là LabF/R và chu trình nhiệt phù hợp.
Cặp mồi LabF/R được thiết kế nằm về hai phía của vùng cắt gắn đa điểm, nếu vector gốc
chưa gắn thêm đoạn gen ngoại lai thì sau khi PCR với mồi Lab sẽ thu được sản phẩm khoảng
200 bp, nếu vector gắn thêm đoạn gen ngoại lai thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước
bằng kích thước của gen ngoại lai cộng với 200 bp.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trên hình 18:
1 2 3 4 5 6 7
M Hình 3: Kết quả PCR từ khuẩn lạc chọn dòng chủng TG1 chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2-
scFv
G1-7: Các khuẩn lạc từ 1-7

Kết quả điện di trên hình 18 cho thấy các khuẩn lạc 1,2,3,5 cho băng điện di có kích
thước mong muốn là khoảng 700bp, trong khi 3 khuẩn lạc 4,6,7 không nhìn thấy băng. Điều
đó chứng tỏ khả năng 4 dòng tế bào 1,2,3,5 đều chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2-scFv. Tuy
nhiên, để khẳng định chắc chắn chúng tôi tiến hành tách chiết phagemid và xác định trình tự,
đồng thời kiểm tra gen mã hóa scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT gắn vào
pHEN2 có đúng chiều và khung đọc hay không.
3.4. Xác định trình tự gen scFv trong phagemid tái tổ hợp pHEN2/scFv.
Trong 4 dòng TG1 có khả năng mang phagemid tái tổ hợp đã xác định sơ bộ bằng
phương pháp PCR từ khuẩn lạc, chúng tôi chọn khuẩn lạc số 2 cho băng sắc nét nhất để nhân
nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline (100 μg/ml) và tách chiết phagemid.
Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp được thể hiện trên hình 4.

401 GGTCAGGGAC AGATTTCACA CTGAAAATCA GCAGGGTGGA
AGCTGAGGAT
451 GTCGGGGTTT ATTACTGCAT GCAAGCTGCA CAATTTCGCC
GTTCTACGTT
501 CGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AAATCAAACG TGCGGCCGCA
CTCGAGCACC
551 ACCACCACCA CCACTGA
Hình 5: Trình tự gen scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT
Các chữ màu đỏ: trình tự gen scFv; chữ màu đen: 1 phần trình tự phagemid pHEN2
Từ trình tự gen thu được để tiến hành kiểm tra xem gen scFv gắn vào phagemid pHEN2
đã đúng chiều đúng khung đọc hay chưa, chúng tôi tiến hành suy diễn ra trình tự amino acid
bằng phần mềm chuyên dụng, kết quả thu được như sau:
1 ILLPTAAAGL LLLAAQPAMA IAGLATPGWS HWLALTPWPR CSCRSTSSGG
51 GGSGGGGSGG SALEIVMTQT PLSSPVTLGQ PASISCRSSQ SLVHSDGNTY
101 LSWLQQRPGQ PPRLLIYKIS NRFSGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAED
151 VGVYYCMQAA QFRRSTFGQG TKLEIKRAAA LEHHHHHH*

Hình 6: Trình tự amino acid suy diễn

Kết quả thu được giúp chúng tôi khẳng định chắc chắn rằng gen mã hóa cho scFv đặc
hiệu kháng nguyên EPCA đã được gắn vào phagemid pHEN2 theo chiều đúng khung đọc
đảm bảo cho quá trình bộc lộ scFv trên bề mặt phage.

3.5. Kết quả bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13
E.coli chủng TG1 chứa phagemid-scFv đã chọn được ở trên được nhân nuôi ở 37
o
C
đến khi đạt OD
600 =
0,5 và sau đó được hiễm helper phage M13 vào để hỗ trợ việc hình thành

nm
Huyết
thanh
OD450
nm
Huyết
thanh
OD450
nm
1
0,157
9
0,048
17
0.035
25
0.029
2
0,195
10
0,030
18
0.032
26
0.037
3
0,167
11
0,027
19

0,035
23
0.039
31
0.043
8
0,156
16
0,028
24
0.040
32
0.035 750bp
700bp
M 1 2
Kết quả biểu thị trên sơ đồ:
OD 450 Hình 8: Kết quả phản ứng ELISA đo ở bước sóng 450nm.

Kết quả cho thấy: Trong 7 mẫu bệnh nhân, các mẫu từ số 1-8 là những bệnh nhân bị bệnh có
ái lực cao hơn hẳn so với các mẫu còn lại từ 9-20 là những bệnh nhân âm tính với UTTLT.
Các giếng đối chứng từ 21-31 cũng cho giá trị OD thấp tương đương với các mẫu không bị
bệnh. Mặt khác, có thể thấy tất cả các giếng của những người bình thường không có kháng
nguyên EPCA (9-31) và giếng đối chứng đều cho giá trị OD450 dưới 0.05, trong khi các mẫu
bị bệnh cho giá trị OD450 cao hơn 0.15. Điều đó chứng tỏ sử dụng kháng thể phage-scFv

6. Phạm Văn Ty (2004) - Miễn dịch học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
7. Tôn Thất Hứa (2005), Ung thư tiền liệt tuyến : Phát hiện sớm – kết quả tốt, Đại học y
khoa Wuerzburg, CHLB Đức.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. A. Heidenreich, M. Bolla, S. Joniau et al (2010), Guidelines on Prostate Cancer,
European Association of Urology.
9. Andris-Widhopf, Steinberger, Barbas, (2001), “Bacteriophage display of combinatorial
antibody libraries”, Encyclopedida of Life Sciences.
10. Anna M. Wu, Tove Olafsen, Andrew A. Raubitschek (2007), Engineered anti- CD20
antibody fragments for in vivo targeting and therapeutics, United States Patent
Application Publication, Pub. No US 2007/0280882. Pub date Dec. 6. 2007 p 1-12.
11. Clackson T, Hoogenboom HR, Griffiths AD, Winter G. (1991), “Making antibody
fragments using phage display libraries”, Nature. 352: 624–8.
12. David M Glodenberg, Robert M Sharkey, Jaques Barbet, Jean Francois Chatal ( 2007),
Radioactive antibodies: selective targeting and treatment of cancer and other diseases,
Appl Radiol 2007; 36(4).
13. Drudge-Coates L, Turner B. (2012), “Prostate cancer overview. Part 2: metastatic prostate
cancer”, pp.11-24.
14. Gregore and Louis (2005). Review on “ Monoclonal antibody therapy of cancer”. Nature
Biotechnology. 23, 1147-1157.
15. Griffiths, Dand Duncan, (1998), “Strategies for selection of antibodies by phageDisplay”,
Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 9, pp. 102–108.
16. Griffiths, Andrew, David Hoogenboom, Hendricus, Renerus, Jacobus, Mattheus Marks,
James, David McCafferty, John Winter, Gregory, Paul Grigg, Geoffrey, Walter (1993),
“Productiion of anti-sefl antibodies from antibody segment repertories and displayed on
phage” WIPO.
17. Guan, Zhang, Wang, (1995), “Electrostatic potential distribution of the gene V protein
from Ff phage facilitates cooperative DNA binding: a model of the GVP-ssDNA
complex”, Protein Sci. 4:187.
18. Hoogenboom, Chames, P (2000), “Natural and designer binding sites made by phage

31. Konings, Folmer, Folkers, P. J Nilges, Hilbers, (1995), “Three-dimensional structure of
the single-stranded DNA-binding protein encoded by gene V of the filamentous
bacteriophage M13 and a model of its complex with single-stranded DNA”, FEMS
Microbiol. Rev. 17:57-72.
32. Mead DA, Kemper B (1988), “Chimeric single-stranded DNA phage-plasmid cloning
vectors”, Biotechnology. 10:85–102.
33. Morrow AL, Rangel JM Semin Pediatr Infect Dis. 2004 “Human milk protection against
infectious diarrhea: implications for prevention and clinical care”.
34. Muyldermans, S (2001), “Single domain camel antibodies: current status”, J. Biotechnol.
74, 277.
35. Nakamura, M., Tsumoto, K., Kumagai, I., Ishimura, K (2003), “A morphologic study of
filamentous phage infection of Escherichia coli using biotinylated phages”, FEBS Lett.
536:167-172.
36. Neri D, Petrul H, Roncucci G (1995), “Engineering recombinant antibodies for
immunotherapy”, Cell Biophys. 27:47–61.
37. Nissim A, Hoogenboom HR, Tomlinson IM, et al. (1994), “Antibody fragments from a
’single pot’ phage display library as immunochemical reagents”, EMBO. 13:692–8.
38. Pacini, L., Vitelli, A., Filocamo, G., Bartholomew, L., Brunetti, M., et al. 2000. In vivo
selection of protease cleavage sites by using chimeric Sindbis virus libraries. J. Virol.
74:10563-10570.
39. Philipp Holliger & Peter Hudson, (2005), Engineered antibody fragment and the rise of
single domains, natural biotechnology.
40. Rader, C (2001), “Antibody libraries in drug and target discovery”, Drug Discovery
Today. 6, 36.
41. Riechmann, L., Holliger, P (1997) "The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for
filamentous phage infection of E. coli”, Cell. 90:351-360.
42. Rodney J.Y.HO, Milo Gibaldi ( 2003), Biotechnology and Biopharmaceuticals,
transforming proteins and genes into drugs, Wiley- liss, p 271- 311.
43. Skerra A, Plu¨ckthun A (1988), “Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment
in Escherichia coli”, Science. 240:1038–41.