Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------*-------
PHAN THỊ HOÀNG HẢO NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC
VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ
HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC
VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG
TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 604280
Phan Thị Hoàng Hảo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. NCVC Chu
Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, TS. Phạm Bích Ngọc phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá
trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nghiêm Ngọc Minh đã cho phép tôi tham
gia thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc
tố tụ cầu vàng”
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo
tận tình của TS. Lê Văn Sơn, TS. Lâm Đại Nhân, CN. Hoàng Hà, Ths. Lê Thu Ngọc
1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột
staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam................................ 3
1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm ....................................................... 3
1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc
tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam .................... 4
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................................... 6
1.2.1. Đặc điểm phân loại ...................................................................................... 6
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học ................................................................................ 6
1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc .......................................................................... 6
1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh .................................................................... 7
1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................... 10
1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B .............................................. 10
1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B ....................................... 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v
1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B .................................... 12
1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng ............ 14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ............................................ 16
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid ....................................................................... 16
2.1.2. Các bộ kít .................................................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị ................................................................... 16
3.1. Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện ...................... 29
3.1.1. Thiết kế mồi ............................................................................................... 30
3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb ........................................................................ 31
3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb .................................. 32
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến ........... 34
3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ .............................. 34
3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện ............................. 36
3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR ......... 37
3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế ................... 38
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện ……. ……….……40
3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp ......................... 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii
3.3.1. Biến nạp vector tá i tổ hợ p pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng
BL21(DE3) ........................................................................................................... 40
3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb.................................................................... 41
3.3.3. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb ...................................................... 43
3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB .............................................................. 47
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 49
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 50
SEs Staphylococcal enterotoxins
v/p Vòng / phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ix DANH MỤC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
1.4 Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB 12
1.5 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của các tế bào T 13
2.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm 18
3.1 Các axit amin sai khác giữa protein SEB đột biến và protein SEB kiểu dại 29
3.2 Sơ đồ vector GS45350 mang gen seb đột biến 30
3.3 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và
mSEB- R
32
3.4 Điện di sản phẩm seb sau tinh sạch 33
3.5 Điện di plasmid pET21a+ 35
3.6 Điện di plasmid pET21a+ sau khi cắt bằng các enzym hạn chế 35
3.7 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào tế bào khả biến E.
coli DH5α
36
3.8 Kết quả điện di colony-PCR để chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ
hợp
37
3.9 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB của các dòng
khuẩn lạc
38
3.10 So sánh trình tự nucleotide của wtseb và mtseb bằng phần mềm Bioedit 39
3.11 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và R 41
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột
chiếm ưu thế về số lượng. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với
nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S.
aureus. Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều
khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc xác định sự có
mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng.
Trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay cũng đã phát triển các loại kít phát hiện
nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp này
đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu. Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên
SEB tái tổ hợp không có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các
kháng thể IgG đặc hiệu là cấp thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo đột
biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong
thực phẩm. ”
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2
Mục tiêu nghiên cứu
3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố
ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm
vi khuẩn hoặc độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối với
người ăn. Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại cùng
một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng 1 loại thức ăn. Ngộ độc thực phẩm có những
triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy .v.v hoặc kèm theo các
triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ độc [43].
Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hoá, việc sản xuất và phân phối sản
phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn
khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm. Đồng thời, trong quá trình công
nghiệp hoá, thực phẩm thường được sản xuất hàng loạt, đã làm số ca mắc các bệnh
do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [21]. Hậu quả và
thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày
càng tăng.
Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus;
trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh và tử vong ở người [9]. Trong số
các nguyên nhân đã được xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp
tính rất nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao như: Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio chlolera, Samonella aureuslmonella,
Campylobacterer, Yersinia enterocolitica .v.v [12]. Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng
(S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu gây ra ngộ độc [2] .
Thực phẩm ô nhiễm các vi sinh vật và các độc tố của chúng là một trong
những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền
khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển [37]. Tại
quan tới sữa và hải sản [41]. Như vậy, giữa các nước khác nhau loại thực phẩm dễ
nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau.
Cho tới nay tại Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc
hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB. Có nhiều nguyên nhân gây
khó khăn cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB: 1)
Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các cơ sở chuyên
khoa; 2) Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5
hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh; 3) Việc tiến hành
các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột
SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào
các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian kéo dài. Do đó,
khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu và các nội độc tố như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp
bội vì SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh , có thể dẫn
tới tử vong ở người.
Bảng 1.1. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009. Dựa theo bảng 1.2 trên đây, chúng tôi nhận thấy tình trạng xuất hiện vi sinh
vật S. aureus ở các loại thực phẩm diễn ra khá phổ biến trong cả nước. Vi khuẩn có
thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người trong cùng một thời điểm khi họ cùng tiêu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6
thụ một loại thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus có thể xảy ra với bất kì
đối tượng nào. Tuy nhiên, người già, trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém sẽ
dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc nặng nề hơn [3].
Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S. aureus và độc tố SEB của nó gây
nhiễm trùng nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng và cấp
thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm đang nhiễm
độc nhiễm trùng. Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu thực tiễn
và cấp bách.
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ
Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphyococcus
aureus.
- Tên khoa học: Staphyococcus aureus Rosenbach 1884 [6].
Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ
cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase. S. aureus gây bệnh ngộ độc thực
phẩm là tụ cầu có coagulase. Nhờ enzym này mà trên môi trường nuôi cấy có máu,
vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng.
Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng
nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn. Nhưng dựa
Ngoài ra, cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn
Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum, và Bacillus cereus cũng
thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn [41].
1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh
- Các loại độc tố
Tụ cầu vàng sản sinh ra 11 độc tố (hình 1.2): độc tố gây hội chứng sốc nhiễm
độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố epidermolitic;
độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic); dung
huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin (staphylokinase); coagulase;
hyaluronidase; β – lactamase và độc tố ruột (enterotoxin) – trong đó có SEB [4].
Ngoài ra, tụ cầu có hệ enzym phong phú góp phần làm tăng độc lực của chúng đối
với các tế bào vật chủ.
Hình 1.1. Hình ảnh các vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8
Hình 1.2. Các độc tố quyết định của S. aureus
(Nguồn:
9
- Cơ chế gây bệnh
Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý
nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh. Bước quan trọng đầu tiên trong
quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính (adherence)
của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ. Các bề mặt này bao gồm da,
niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức
lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô). Giống như các vi
khuẩn Gram dương khác là Streptococcus và Mycobacteria, S. aureus bám dích vào
bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide. Một khi đã bám dính vào
bề mặt tế bào vật chủ, tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động
các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và
hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ. S. aureus sẽ tiếp tục tiến sâu vào
trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion). S. aureus xâm nhập
ngoại bào bằng cách tiết một số enzym như: hyaluronidase; hemolysine, leukocidin;
exfoliatine .v.v, phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ [44, 45].
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc
do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Nguyên nhân là
sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi
khuẩn đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt, tạo điều kiện thuận lợi cho tụ
cầu vàng tăng trưởng về số lượng. Ngoài bệnh nguyên do là tụ cầu, một số trường
hợp có thêm vai trò của vi khuẩn Clostridium difficile [4]. Ước tính khoảng 0,1 μg
S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người. Tuy nhiên, lượng này cũng có thể
thay đổi tùy thuộc độ nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [14, 41].
- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S. aureus và độc tố của nó thường có các triệu
chứng cấp tính. Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1-6 giờ) thời gian ủ
bệnh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác (trung bình 2-3 giờ).
enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% [10]. Tại Pháp, trong số 61 chủng phân
lập từ pho-mát và sữa tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic [30]. Ở Pháp,
trong 332 chủng S. aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa
các gen seg, seh, sei và sej xuất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen sea và
see, trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [29, 41].
1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B
1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B
SEB là 1 trong các nội độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S. aureus. Thông
thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ thống vận
chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc tố ruột) [11].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11
Độc tố ruột SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ
ngộ độc thực phẩm do S. aureus [11]. Độc tố ruột SEB được hình thành khi tụ cầu
S. aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ môi trường gia tăng đột
ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu .v.v [3].
Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S. aureus
nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết. Trình tự axit amin của SEB đã được xác
định từ năm 1970 [20]. Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S.aureus
thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm,
protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 axit amin ở đầu
N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường
được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết. Trình tự gen seb của các chủng
khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458, AY518386), COL (CP000046,
AF410775) .v.v đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) [26, 15, 40].
Cấu trúc tinh thể của protein SEB trình bày ở hình 1.4 được xác định ở độ
phân giải 1,5 A là độ phân giải cao nhất cho đến nay dành cho 1 siêu kháng nguyên.
1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B
Staphylococcal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các lympho T ở
hệ miễn dịch của các vật chủ. Các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein
(MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia tăng số lượng lớn các
lympho T. SEB được coi là một "siêu kháng nguyên” của vi khuẩn vì có thể tạo
thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên và
vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD 4, CD 8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế
Hình 1.4. Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB
(Nguồn : http//www.pdb.org/pdb/explore.do?structureId=3SEB )
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13
(Nguồn:
Copyright: Tài liệu đại học ©