Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
*
PHAN THỊ HOÀNG HẢO NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC
VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ
HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC
VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG
TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 604280


Phan Thị Hoàng Hảo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. NCVC Chu
Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, TS. Phạm Bích Ngọc phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá
trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nghiêm Ngọc Minh đã cho phép tôi tham
gia thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc
tố tụ cầu vàng”
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo
tận tình của TS. Lê Văn Sơn, TS. Lâm Đại Nhân, CN. Hoàng Hà, Ths. Lê Thu Ngọc

1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột
staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 3
1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm 3
1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc
tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 4
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 6
1.2.1. Đặc điểm phân loại 6
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học 6
1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc 6
1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh 7
1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 10
1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B 10
1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v
1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B 12
1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng 14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 16
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid 16
2.1.2. Các bộ kít 16
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị 16

3.1. Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện 29
3.1.1. Thiết kế mồi 30
3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb 31
3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb 32
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến 34
3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ 34
3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện 36
3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR 37
3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế 38
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện ……. ……….……40
3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii
3.3.1. Biến nạp vector tá i tổ hợ p pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng
BL21(DE3) 40
3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb 41
3.3.3. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb 43
3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB 47
KẾT LUẬN 49
KIẾN NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50


Isopropylthio--D-galactoside
Kb
Kilobase
LB
Luria and Bertani
PBS
Phosphate buffer saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
S. aureus
Staphylococcus aureus
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SEB
Staphylococcal enterotoxin B
SEs
Staphylococcal enterotoxins
v/p
Vòng / phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
27
3.1
Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350
31
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên x

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên xi
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1

3.6
Điện di plasmid pET21a+ sau khi cắt bằng các enzym hạn chế
35
3.7
Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào tế bào khả biến E.
coli DH5α
36
3.8
Kết quả điện di colony-PCR để chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ
hợp
37
3.9
Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB của các dòng
khuẩn lạc
38
3.10
So sánh trình tự nucleotide của wtseb và mtseb bằng phần mềm Bioedit
39
3.11
Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và R
41
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU
Thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn chứa các chất
có tính độc hại đối với người ăn là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến
trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như
các nước lạc hậu, kém phát triển. Tại Việt Nam, trong những năm gần đây số vụ
nhiễm độc thực phẩm cũng ngày càng tăng và hậu quả ngày càng nghiêm trọng.
Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất ở
người và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể
do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột
chiếm ưu thế về số lượng. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với
nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S.
aureus. Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều
khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc xác định sự có
mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng.
Trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay cũng đã phát triển các loại kít phát hiện
nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp này
đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu. Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên
SEB tái tổ hợp không có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các
kháng thể IgG đặc hiệu là cấp thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo đột
biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong
thực phẩm. ”


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố
ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm
vi khuẩn hoặc độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối với
người ăn. Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại cùng
một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng 1 loại thức ăn. Ngộ độc thực phẩm có những
triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy .v.v hoặc kèm theo các
triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ độc [43].
Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hoá, việc sản xuất và phân phối sản
phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn
khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm. Đồng thời, trong quá trình công
nghiệp hoá, thực phẩm thường được sản xuất hàng loạt, đã làm số ca mắc các bệnh
do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [21]. Hậu quả và
thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày
càng tăng.
Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus;
trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh và tử vong ở người [9]. Trong số

phẩm do S. aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt là
ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7%
từ cá, sò, ốc .v.v và 3,5% từ trứng [38]. Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S.
aureus được ghi nhận trong hai năm (1999-2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt
là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các
sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [17]. Tại Hoa
Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus được báo cáo giữa các
năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát,
11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên
quan tới sữa và hải sản [41]. Như vậy, giữa các nước khác nhau loại thực phẩm dễ
nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau.
Cho tới nay tại Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc
hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB. Có nhiều nguyên nhân gây
khó khăn cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB: 1)
Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các cơ sở chuyên
khoa; 2) Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5
hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh; 3) Việc tiến hành
các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột
SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào
các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian kéo dài. Do đó,

(từ 2-5 tuổi)
3
Minh Long - Quảng Ngãi
2/2008
53
Người dân
4
Hà Nội
5/2008
122
Khách dự
đám cưới
5
Cty TNHH Alliace One, KCN Giao Long, Bến Tre
6/2008
100
Công nhân
6
Sơn La
9/2008
581
Người dân
7
Tiểu học Tam Bình, Q. Thủ Đức -TP HCM
11/ 2008
51
Học sinh và
phụ huynh
8
Cty Phú Nguyên, KCN An Đồng

phẩm là tụ cầu có coagulase. Nhờ enzym này mà trên môi trường nuôi cấy có máu,
vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng.
Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng
nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn. Nhưng dựa
vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn.
Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các nhóm
I, II, III, IV. Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S. aureus [4].
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học
1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc
Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có nghĩa
chùm nho) là những cầu khuẩn có đường kính khoảng 1 μm, không di động và sắp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7
xếp theo mọi hướng tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Chúng là các
cầu khuẩn Gram dương, không có lông, không tạo nha bào và thường không có vỏ
(Hình 1.1).

Độc tố ruột được sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng, nhưng không
phải là tất cả mọi chủng. Các độc tố này là những protein tương đối bền với nhiệt,
nên không bị phá hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ 28000-30000
Dalton và bao gồm 6 loại (type) được ký hiệu từ A tới E [4]. Ono và cs (2008), đã
phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm trong nhóm những độc tố
ruột do S. aureus tạo ra [27]. Về miễn dịch, các loại này được phân biệt khá rõ ràng,
mặc dù giữa chúng có những kháng nguyên chéo. Về cơ chế gây bệnh, độc tố ruột
kích thích miễn dịch ở cơ thể vật chủ tạo ra một lượng lớn interleukin I và II. Các
enterotoxin có thể được xác định bằng các kỹ thuật miễn dịch [4]. Trong các dạng
độc tố ruột do S. aureus sinh ra thì các độc tố SEA, B, C và D là những độc tố
thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố của tụ cầu. Ngoài ra
SEB còn là một trong những nhóm độc tố do vi sinh vật sản sinh ra được liệt kê
trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh
sinh học [16].


- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S. aureus và độc tố của nó thường có các triệu
chứng cấp tính. Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1-6 giờ) thời gian ủ
bệnh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác (trung bình 2-3 giờ).
Bệnh nhân ngộ độc thức ăn do tụ cầu xuất hiện các triệu chứng nôn ói, đau quặn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10
bụng và tiêu chảy dữ dội, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Triệu
chứng tiêu chảy do tụ cầu cũng không kèm theo máu và ít mất nước hơn so với tả
và E. coli. Bệnh nhân không sốt hay phát ban, đây là đặc điểm để phân biệt giữa
ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với các nhóm vi khuẩn khác; thần kinh người
bệnh bình thường. Phần lớn trường hợp bệnh tự khỏi và hồi phục trong vòng 8-24
giờ sau khởi phát nhưng trường hợp nặng có thể bị tụt huyết áp và gây tử vong.
Bệnh nhân ngoài ra có thể bị sốc do mất nhiều nước và chất điện giải. Khác với ngộ
độc thực phẩm do vi khuẩn thông thường không gây sốt hoặc sốt nhẹ, bệnh nhân
mắc ngộ độc do độc tố SEB của S. aureus sẽ bị sốt cao [3].
1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Hiện nay người ta cũng đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng tụ
cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315,
Mu50, RF122 .v.v. [7, 15, 19, 8, 23, 18]. Ví dụ: Steven và cs đã thành công trong
việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S. aureus COL. Kết quả giải
trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân và

định từ năm 1970 [20]. Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S.aureus
thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm,
protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 axit amin ở đầu
N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường
nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định. SEB dạng hoạt
động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 amino axit trong 1 chuỗi polypeptit
đơn, có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa. Ở dạng hoạt động protein SEB có
cấu trúc gồm: 7 cấu trúc xoắn α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối
cystein ở vị trí 120 và 140 [46]. Theo Gleason và cs (2009), protein SEB có 2 vùng
cấu trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặt chẽ nên cho phép SEB chống
lại sự tác động của các proteases, gồm trypsin, chymotrypsin và papain có trong
ruột [11].
Staphylococcal enterotoxin B có cấu trúc và đặc tính sinh học gần giống với
các độc tố ruột khác là A, C, D, E, F, G ,S, T cùng do vi khuẩn S. aureus tạo ra. Đặc
biệt, trình tự axit amin của SEB có mối tương đồng cao với trình tự axit amin độc tố
ruột C1 cũng có 239 axit amin [13]. SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các
siêu kháng nguyên staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ có một vị trí bám trên
phân tử MHC nhóm II. Phân tích chi tiết vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên
SEA, SEB và SEC2 sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ [11].
Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen seb của
chủng vi khuẩn S. aureus S6. Theo đó, trình tự của 1 gen seb hoàn thiện được tính
từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13
bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà không cần thiết phải có một quá trình chế biến
và trình diện thông thường. Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của
cytokine, interleukin 2 (IL-2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các
interferon. Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn,
buồn nôn, nôn, và tiêu chảy. Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong
các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt [11].

SEB dễ dàng hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định. SEB có
khả năng chịu tác động cơ học ở mức vừa phải và có thể chịu được nhiệt độ sôi
trong vài phút. Nếu được bảo quản trong môi trường đông lạnh khô, SEB có thể
được lưu trữ trong hơn một năm [11].