Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN BÍCH LOAN
BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ
CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB
TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng
sự nghiên cứu phòng Công nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ sinh
học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 06
năm 2012 tới tháng 06 năm 2013.
Tác giả
Nguyễn Bích Loan
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường
- Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa
chất thiết bị trong suốt thời gian thực hiện luận văn tại phòng.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới KS. Nguyễn Thị Hoài Thu và các
anh chị, cán bộ phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh
học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy
cô giáo trong nhà trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; các thầy
cô Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.
1.2.5. Độc tố và khả năng gây bệnh 12
1.3. Nội độc tố ruột Staphyloccoccal enterotoxin B 16
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc 16
1.3.2. Cơ chế gây bệnh 18
1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng . 19
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 22
2.1.1. Đối tượng thí nghiệm 22
2.1.2. Chủng vi khuẩn và plasmid 22 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
iv
2.1.3. Các bộ kit 22
2.1.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị 22
2.1.5. Môi trường và đệm 23
2.1.6. Phần mềm 23
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 23
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu 24
2.2.2.1. Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli
BL21(DE3) 24
2.2.2.2. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli
BL21(DE3) 25
2.2.2.3 Phương pháp xử lý enzym hạn chế 26
2.2.2.4. Biểu hiện protein Staphyloccoccal enterotoxin B trong tế bào vi
khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 27
2.2.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 28
2.2.2.6. Phương pháp sạc cột Ni - NTA 31
2.2.2.7. Phương pháp tinh sạch protein 32
Tài liệu Tiếng Anh 61
Tài liệu internet 65 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µg
Microgram
µl
Microlit
APS
Ammonium persulphate
ATVSTP
An toàn vệ sinh thực phẩm
Bp
Base pair
BSA
Bovine serum albumin
Cs
Cộng sự
dH
2
O
Nước khử ion
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
deoxyribonucleotide triphosphates
E. coli
Nanomet
PBS
Phosphate buffer saline
S. aureus
Staphylococcus aureus
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel
electrophoresis
SE
Staphylococcal enterotoxin
SEB
Staphylococcal enterotoxin B
TB
Trung bình
TBS
Tris Bloting solution
TTBS
Tris Tween Blotting solution
v/p
vòng / phút
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
53
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Cầu khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi
9
1.2
Các độc tố quyết định của S. aureus
13
1.3
Cấu trúc tinh thể của protein SEB
17
1.4
Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của tế bào T
19
2.1
Sơ đồ các bước nghiên cứu
24
2.2
Mô hình nghiên cứu độc tính protein SEB đột biến trên
chuột
36
Phản ứng Western blot của protein tái tổ hợp SEB với
kháng huyết thanh chuột
57
3.10
Phản ứng Western bot của các nồng độ kháng nguyên SEB
khác nhau với tỉ lệ kháng thể pha loãng 1/300 lần
58 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1
MỞ ĐẦU
Khái niệm “vệ sinh an toàn thực phẩm” được định nghĩa là các điều kiện
và biện pháp cần thiết để đảm bảo thực phẩm không gây hại cho sức khỏe,
tính mạng con người. Mặc dù được Nhà nước và các cơ quan liên quan nỗ lực
kiểm soát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm song vấn đề này vẫn đang diễn
biến phức tạp.
Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực
phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Đặc biệt là những
trường hợp ngộ độc thực phẩm do mầm bệnh vi sinh vật đóng vai trò rất quan
trọng, chiếm khoảng 50% trên tổng số ca ngộ độc thực phẩm.
Ngộ độc thực phẩm là bệnh cấp tính xảy ra khi ăn, uống phải thức ăn, đồ
uống bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc có chứa các chất có tính
chất độc hại đối với con người. Trong số các vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh
đó có tụ cầu vàng Staphyloccoccus aureus (S. aureus) là một trong những
nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng
có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột
chiếm ưu thế về số lượng. Điều đáng chú ý là một số độc tố của chúng bền
với nhiệt và khó bị phân hủy ở nhiệt độ cao, một trong số đó phải kể tới là
độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với nhiệt là tác nhân
phục vụ chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố ruột SEB do vi khuẩn tụ cầu
vàng (S. aureus) gây ra trong thực phẩm và môi trường.
Nội dung nghiên cứu:
- Biểu hiện gen seb đột biến
- Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB đột biến.
- Định lượng protein SEB đột biến theo phương pháp Bradford.
- Kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến
- Gây miễn dịch thực nghiệm trên chuột
- Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên SEB
bằng kỹ thuật Western blot. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm
1.1.1. Tình hình nhiễm độc thực phẩm chung
Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề nổi cộm đối với tất
cả các nước trên thế giới. Sự hiểu biết của con người về căn nguyên, tác hại
và hậu quả của bệnh truyền qua thực phẩm ngày càng sâu sắc hơn. Tuy nhiên
những biện pháp, kĩ thuật nhằm kiểm soát chúng lại chưa đem lại hiệu quả
tích cực như mong đợi. Những nguyên tắc phòng chống, các kĩ thuật vệ sinh
đã được nghiên cứu và áp dụng, tuy nhiên ngay cả những nước công nghiệp
như Hoa Kì và Nhật Bản lại thường xuyên thông báo về bệnh do thực phẩm bị
nhiễm khuẩn nhiễm độc [31].
Ngộ độc thực phẩm là hội chứng cấp tính xảy ra do ăn phải thức ăn có
chất độc đối với người ăn. Bệnh thường xảy ra có tính chất đột ngột, nhiều
người cùng mắc do ăn cùng một loại thức ăn, có những triệu chứng của một
bệnh cấp tính biểu hiện bằng nôn mửa, ỉa chảy… kèm theo các triệu chứng
khác tùy theo từng loại ngộ độc. Ngộ độc có thể do:
- 100% , thực phẩm chín từ 29 - 66% và bàn tay người chế biến 1%; 100%
dụng cụ chứa đựng thực phẩm không nhiễm vi sinh [3]. Hiện nay, loài người
đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200 bệnh truyền nhiễm thông qua
thực phẩm. Trong số đó có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật đã được xác định
vai trò gây bệnh. Trong số hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có
khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh. Các mầm
bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng và virus. Trong đó các
loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh tử vong ở người. Trong số các nguyên
nhân đã được xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp tính rất
nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao như: Staphylococcus aureus, Salmonella,
Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibro chlorea, Campylobacter,
Yersinia enterocolitica .v.v [15]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
5
Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu
gây ra ngộ độc [9].
Staphylococcus aureus: thường có trong kem, thịt tươi, cá bảo quản lâu
ngày, xúc xích, lạp xường, đôi khi có trong phomat. Vi khuẩn có độc tố ruột
gây buồn nôn và nôn, đau bụng và ỉa chảy cấp. Độc tố tụ cầu bao gồm các
enzym: hyaluronidase gây phá hủy tổ chức, hemolysine và leukocidine gây
phá hủy hồng cầu và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào,
exfoliatine: là các men phá hủy lớp thượng bì. Men này gây tổn thương da tạo
các bọng nước. Điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu. Độc tố gây hội chứng
sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội
chứng sốc trầm trọng.
Các enterotoxin mà quan trọng nhất là enterotoxin B (SEB) là một độc
tố ruột được sinh ra bởi chủng S. aureus, nó là một trong những độc tố liên
quan đến nhiễm độc thức ăn ở người do vi khuẩn tụ cầu và độc tố còn được
được báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm
khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt 5,1%, còn lại là từ các
sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [41]. Như vậy, giữa các nước khác nhau
loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau.
Trung tâm Phòng và Kiểm soát bệnh Hoa Kì (CDC) công bố vi khuẩn tụ
cầu vàng kháng methicilline MRSA (methicilline-resistant Staphylococcus
aureus) đang lây lan mạnh ở quốc gia này với tỷ lệ nhiễm là 32/100.000
người và số người chết vì MRSA đã vượt quá số người chết vì bệnh AIDS.
(trong tạp chí chuyên đề của Hiệp hội Y học Mỹ số ra ngày 18/10/2012).
Theo ước tính của Trung tâm Phòng và Kiểm soát bệnh Hoa Kì, mỗi năm trên
thế giới có ít nhất 100.000 người đã vô tình bị lây nhiễm MRSA sau khi nhập
viện. Trung bình cứ 10 trẻ em Mỹ đã từng vào viện thì có một trẻ bị lây nhiễm
loại vi khuẩn đặc biệt nguy hiểm này và đến nay đã có gần 19.000 người bị
chết ở Mỹ vì nhiễm MRSA. Các ghi nhận y tế khác cũng cho thấy, MRSA
hiện có mặt và ẩn nấp vô số trong mọi ngóc ngách của các bệnh viện và đang
là mối đe dọa lớn với ngành y tế Mỹ [50]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
7
Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của S. aureus rất
đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), thịt
hun khói (100%), xúc xích (96,6%), bánh gato (85%), pate (83,3%) .v.v.
Đáng chú ý là vi khuẩn S. aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm
bị nhiễm khuẩn [4].
Ở nước ta, trong nhiều năm trở lại đây xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực
phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ
của Cục ATVSTP khoảng tháng 4, tháng 5/2012, cả nước xảy ra 10 vụ ngộ
độc thực phẩm làm 927 người mắc, trong đó có 726 người nhập viện và đã có
4 trường hợp tử vong. Phần lớn các vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều
S. aureus (Enterotoxin) được cho là phổ biến nhất do tụ cầu phát triển nhanh
trong môi trường thực phẩm ở điều kiện khí hậu nóng ẩm và tiết ra độc tố
Enterotoxin. Trong các loại độc tố của tụ cầu thì Enterotoxin B (SEB) là một
độc tố mạnh, gây tử vong cao và lại bền với nhiệt và môi trường nên còn được
tổ chức y tế thế giới (WHO) và CDC cảnh báo có thể là một trong những tác
nhân bị lợi dụng trong khủng bố sinh học.
Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S. aureus và độc tố SEB gây
nhiễm trùng nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng và
cấp thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm
đang nhiễm độc, nhiễm trùng.
Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu cấp thiết và
thực tiễn.
1.2. Một vài nét về tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với „staphyle” có
nghĩa là chùm nho) là vi khuẩn gram dương, có hình cầu, đường kính khoảng
0,8 - 1 µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm
không đều giống như chùm nho (hình 1.1). Đây là loại vi khuẩn không di Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
9
động, không có lông, cầu khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus) không có
khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn Chlammydomonas perfringens,
Chlamydomonas botulinum, và Bacillus cereus cũng thường được tìm thấy
trong các thực phẩm nhiễm khuẩn, và thường không có vỏ [41].
Năm 1871, Recklinghausen thu được cầu khuẩn trong thận của bệnh
nhân chết do bệnh nhiễm khuẩn huyết. Năm 1880, Alexander Ogston chứng
minh được abcess sinh mủ là do cầu khuẩn dạng chùm. Vào năm 1982,
Ogson được công nhận là người khám phá và đặt tên cho tụ cầu –
tiền chất fibrinogen. Enzym này cùng với yếu tố kết cụm (một enzym vách tế
bào vi khuẩn) giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó.
Tụ cầu có men coagulase:
Nhờ men coagulase này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn
tạo nên các khuẩn lạc màu vàng. Do vậy vi khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng.
Các vi khuẩn quan trọng của nhóm này là: Staphylococcus aureus (hay còn
gọi là tụ cầu vàng); Staphylococcus intermedius.
Tụ cầu không có men coagulase:
Do không có men coagulase nên trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn
lạc có màu trắng ngà. Trên lâm sàng thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu
trắng. Các vi khuẩn nhóm này có thể kể đến: Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
11
capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus
warneri, cùng 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không hiện diện ở người.
Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng
nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn. Nhưng
dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn.
Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các
nhóm I, II, III, IV. Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại
Staphylococcus aureus. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men
penicillinase (beta-lactamase). Men này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc
cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và
Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng [2].
1.2.3. Tính chất và phân bố
Staphylococcus aureus là những vi khuẩn kị khí tùy ý, có cả sự trao đổi
chất, hô hấp và lên men. Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể
cs đã thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S.
aureus COL. Kết quả giải trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số:
CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo đó,
trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các cặp G-C, điều này gây ra mối quan
ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh
Gram dương khác [33].
Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ
giống enterotoxigenic được ước tính khoảng 25%. Ở Pháp, trong số 332
chủng S. aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa các
gen seg, seh, sei và sej xuất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa các gen
sea và see trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [41].
1.2.5. Độc tố và khả năng gây bệnh
Các loại độc tố: Dựa theo các cuộc nghiên cứu và các báo cáo khoa học:
Tụ cầu S. aureus sản sinh ra 11 độc tố (hình 1.2): độc tố gây hội chứng nhiễm
độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố
epidermolitic; độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh
mủ (pyrogenic); dung huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
13
(staphylokinase); coagulase; hyaluronidase; β-lactamase và độc tố ruột
(enterotoxin) – trong đó có SEB là một trong những nhóm độc tố được liệt kê
trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến
tranh sinh học [2]. Hình 1.2. Các độc tố quyết định của S. aureus [44]
Độc tố ruột (enterotoxin )
các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm
nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ. S. aureus sẽ tiếp tục
tiến sâu vào trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion). S.
aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzym như: hyaluronidase;
hemolysine; leukocidin; exfoliatine… phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào
vật chủ [46].
Ước tính khoảng 0,1 µg S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm
ở người. Tuy nhiên, lượng này cũng có thể thay đổi tùy thuộc nhạy cảm với
tác nhân ở mỗi bệnh nhân [41].
Triệu chứng gây bệnh của Staphylococcus aureus:
- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng Staphylococcus
aureus: Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S. aureus và độc tố của nó thường có các
triệu chứng cấp tính. Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1 - 6
Copyright: Tài liệu đại học ©