LỜI CẢM ƠN!
Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình, không chỉ là sự cố
gắng hết mình của bản thân, tôi còn nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn tận tình
của các thầy cô cũng như sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè.
Trước tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Lê Thị Liên –
Trưởng Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang
đồng kính gửi thầy PGS.TS Đinh Duy Kháng – Trưởng phòng Vi sinh vật học
phân tử – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, đã tận tình chỉ bảo, dìu dắt và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt
thời gian nghiên cứu và học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Bạch Như Quỳnh người đã trực tiếp
hướng dẫn, chỉ bảo giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình. Tôi cũng xin
cảm ơn các cô chú, anh chị đang công tác tại phòng Vi sinh vật học phân tử –
Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian
thực tập tại đó.
Để có được những hiểu biết về kiến thức chuyên ngành, tôi xin chân
thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học – trường Đại
học Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện cho tôi được học tập trong môi
trường giảng dạy tốt nhất để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã
luôn ở bên ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian
thực tập tốt nghiệp để hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2011
Sinh viên
Đỗ Thị Hồng
1
MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề:
Cúm gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm và thủy cầm,
đặc biệt là ở gà do virus cúm type A thuộc họ Orthomysoviride gây nên.

NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam”. Đề tài
góp phần ứng dụng vào việc sản xuất vacine cúm A/H5N1, phòng bệnh trên
gia cầm tại Việt Nam.
Ý nghĩ khoa học và ý nghĩa thực tiễn:
- Ý nghĩa khoa học: Xác định được trình tự gen mã hóa kháng nguyên
HA của chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine.
- Ý nghĩa thực tiễn: Sử dụng chủng NIBRG-14 này vào việc sản xuất
vacine.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Virus cúm chủng NIBRG-14
- Phạm vi nghiên cứu: Gen mã hóa kháng nguyên HA từ chủng
NIBRG-14.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng vi sinh phân tử - Viện Công nghệ Sinh
học – Viện Khoa học Và Công nghệ Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 23/02/2011 đến 22/05/2011
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về dịch cúm gia cầm.
Cúm gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do siêu virus cúm gây ra
cho các loài gia cầm và chim hoang dã. Bệnh lây lan rất nhanh, tỉ lệ chết
là 100% nếu gà bị bệnh. Đặc biệt có thể xâm nhiễm cho một số loài động
vật có vú.
1.1.1. Lịch sử cúm gia cầm.
- Bệnh được ghi nhận từ hơn 400 năm nay.
- Tiếng anh: Influenza xuất phát từ tiếng Ý (Influence of the start).
a. Cúm gia cầm xuất hiện trên thế giới:
- Năm 1878 phát hiện bệnh ở Italia.
- Năm 1901 phát hiện căn nguyên siêu nhỏ.
- Năm 1955 phát hiện được virus gây bệnh.
- Trận đại dịch đầu tiên: năm 1850 [12].

a. Triệu chứng.
- Thời gian ủ bệnh rất ngắn 1 - 3 ngày
- Gà nhiễm bệnh có những triệu chứng:
+ Viêm đường hô hấp cấp: Thở khó, khi thở phải há miệng, ho khẹc, chảy
dịch mắt, dịch mũi và rớt dãi liên tục. Nhiệt độ cơ thể tăng đột ngột 40 - 45
0
C.
+ Viêm đường tiêu hóa cấp: Tiêu chảy rất nặng, phân xám vàng, xám
xanh, đôi khi có lẫn máu, mùi phân tanh.
+ Nhiễm trùng huyết: Mào và tích sưng, tích nước, xuất huyết điểm đỏ
từng đám. Kết mạc mắt sưng chũng và xuất huyết, xuất huyết dưới da, đặc
biệt xuất huyết ở cả da chân [1,7].
- Triệu chứng bệnh cúm gà ở người:
Người nhiễm cúm gà có 3 hội chứng chính:
+ Hội chứng hô hấp: Hắt hơi, sổ mũi, mắt đỏ, chảy nước mắt, sợ ánh
sáng, cảm giác rát họng, khô họng. Khó thở cấp tính, viêm thanh quản, khí
quản, ho khan, khàn tiếng.
+ Hội chứng nhiễm trùng: Sốt cao liên tục, mặt đỏ, viêm kết mạc mắt.
Chán ăn, lưỡi trắng. Mệt lả, đuối sức, chảy máu cam, hiếm nhưng quan trọng.
+ Hội chứng đau: Nhức đầu nhiều vùng trán, đôi khi lan khắp đầu. Đau bắp
cơ: Thường gặp ở thắt lưng, chi dưới. Cảm giác nóng, đau vùng xương ức [1].
b. Bệnh tích
Mổ khám gà bệnh thấy:
- Mũi viêm xuất huyết và tịt lại.
6
- Mào và tích xưng chũng, đỏ sẫm, tích nước.
- Viêm hoại tử, xuất huyết tràn lan ở các phủ tạng: Phổi, tim, gan, lách,
thận, buồng trứng…
- Xuất huyết đỏ sẫm từng mảng ở các tổ chức dưới da và cơ.
- Tuyến tụy xưng to có các vạch vàng và đỏ xen kẽ.

thành cúm Hồng Kông vào năm 1968 [12].
- Đại dịch cúm Hồng Kong 1968: Dịch cúm Hồng Kông được xác nhận
là dịch cấp độ 2, gây ra bởi mẫu virus cúm A/H3N2, chính là hậu duệ của
cúm châu Á H2N2. Thông tin đầu tiên về trận dịch là một vụ bùng dịch nhỏ ở
Hồng Kông xuất hiện vào ngày 13/7/1968, trong một khu vực có khoảng 500
người sống rất gần nhau. 2 tuần sau, dịch bệnh bùng nổ mạnh và kéo dài
khoảng 6 tuần. Tháng 7/1968, dịch xuất hiện ở Việt Nam và Singapore. Tới
tháng 9/1968, nó đã lan tới Ấn Độ, Philippines, bắc Australia và châu Âu.
Cùng tháng đó, virus đã vươn tới California từ những người lính trở về sau
chiến tranh Việt Nam. Virus vươn tới Nhật Bản, châu Phi và Nam Mỹ vào
năm 1969. Tổng cộng trong hai năm 1968 – 1969, trận dịch đã giết hại
khoảng 1 triệu người trên toàn cầu trước khi nó biến mất [12].
8

Hình 1.2. Bản đồ các quốc gia xảy ra dịch cúm A/H5N1 (WHO, tính đến
15/09/2008) [12].
Chú giải: Phần bôi đậm là vùng dịch cúm xảy ra trên gia cầm.
Phần bôi nhạt là vùng dịch cúm chỉ xảy ra trên chim hoang dã.
1.1.3. Tình hình dịch cúm ở Việt Nam.
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng
12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các
tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên
dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia
cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân. Tính đến
tháng 10/2008, dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều địa
phương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như sau:
- Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở các
tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong
vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước. Tổng số gà và
9

Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ được khống chế hoàn toàn vào
8/2007 [6].
- Dịch bệnh tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng
3/2008. Cho đến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản đã được
khống chế trên toàn quốc [6].
- Cúm gà 2010 và đầu năm 2011(chủ yếu là bệnh cúm thuộc chủng
H5N1).
Tại tỉnh Bắc Kạn từ ngày 19/3 đến ngày 6/4 năm 2010, dịch cúm gia
cầm đã xảy ra tại 16 hộ chăn nuôi tại huyện Lương Phú. Tổng số gia cầm bị
chết và tiêu hủy tại các hộ gia đình trên là 318 con [6].
Tại Quảng Ninh, ngày 29/3, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 4 hộ gia
đình thuộc xóm 4 xã Tiền Phong của huyện Yên Hưng. Tính đến ngày 6/4
tổng số gia cầm chết và tiêu huỷ của 4 hộ trên là 1.554 con (trong đó có 1.504
vịt và 50 gà). Ở huyện Yên Hưng, Quảng Ninh, có hơn 3.000 con gà có biểu
hiện mắc bệnh, số gia cầm bị chết là 1420 con [6].
Cả nước còn 6 tỉnh là Nghệ An, Khánh Hòa, Tuyên Quang, Bắc Ninh,
Bến Tre và Quảng Ninh có dịch cúm gia cầm chưa qua 21 ngày. Số ca mắc
cúm A/H5N1 trong những tháng đầu năm 2010 có thể nói là “bất thường” so
với những năm trước đó chỉ trong 2 tháng đầu năm đã bằng tổng số ca mắc cả
năm 2009.
Đầu năm 2011 bệnh cúm A/H5N1 đã xảy ra ở một số tỉnh nhưng với số
lượng ít và hầu như chưa bùng phát thành dịch:
Ngày 17/2, chi cục thú y tỉnh Kon Tum đã xác địnht trên 2.000 con
chim cút và trên 1.000 con gà bị chiễm cúm A. Ngày 12/3, TS Lê Hữu Hải,
11
Trưởng phòng NN&PTNT huyện Cai Lậy (Tiền Giang), cho biết bảy đàn gia
cầm, thủy cầm hơn 4.700 con ở các xã Nhị Mỹ, Tân Phú, Nhị Quý, Hội Xuân
và Mỹ Phước Tây của huyện Cai Lậy đã phải tiêu hủy vì có các triệu chứng
của bệnh cúm A/H5N1 [6].
Bảng 1.1. Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo

nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương
ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2;
phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa
cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 [2].
1.2.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng
Hình 1.4. cấu trúc virus cúm A
Tất cả các virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae đều có hệ gen là RNA
chứa 8 phân đoạn. Trên bề mặt virus có protein ngây ngưng kết hồng cầu là
HA và một loại enzyme NA có chức năng phá hủy thụ thể của tế bào vật chu
và giải phóng virus. Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, hệ
gen virus cúm A có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotit [16].
14
Các gen mã hóa cho các protein và chức năng của chúng như sau:
- Phân đoạn 1: Là các gen mã hóa cho protein PB2 với kích thước
2341bp có vai trò trong quá trình sao mã: gắn mũ.
- Phân đoạn 2: Liên quan đến quá trình sao mã: kéo dài, kích thước
2341bp, mã hóa cho protein PB1.
- Phân đoạn 3: Mã hóa cho protein PA, kích thước 2233 bp, có vai trò
trong quá trình sao mã.
- Phân đoạn 4: Liên kết với tế bào thụ thể trên tế bào chủ gây ngưng kết
hồng cầu, kích thước đoạn gen là 1778 bp mã hóa cho protein HA
(Hemagglutinin).
- Phân đoạn 5: Mã hóa cho protein NP, kích thước 1565 bp, nucleotit
bám vào RNA, là thành phần trong phức hợp sao mã, vận chuyển ra vào nhân
của vRNA.
- Phân đoạn 6: Đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng của
virus, kích thước 1413 bp, mã hóa cho protein NA (Neuraminidase).
- Phân đoạn 7: Kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein M1 (Matrix
protein), là protein nền, thành phần chính của virion và liên quan đến nhiều sự
kiện quan trọng của virus.

vị trí glycosyl hóa. Trên phân tử HA có ít nhất 5 domain kháng nguyên
(A,B,C,D, và E) phân bố ở phần đầu của phân tử này. HA được cấu tạo bởi 2
tiểu phần là HA1 và HA2. Hai tiểu phần này được nối với nhau bởi một trình
tự amino acid ngắn, đặc trưng cho từng bến thể H. Trình tự của đoạn peptit
nối trong phân tử HA cũng chính là trình tự nhận biết và phân cắt của enzyme
protease tế bào chủ đối với phân tử protein này. Sự phân cắt phân tử HA là
bước đầu tiên trong quá trình thâm nhập vào tế bào chủ của virus cúm. Thông
thường sự phân cắt này có tính giới hạn đối với các mô với sự có mặt của các
protease thích hợp. Tuy nhiên đối với virus cúm độc lực cao (H5 và H7) đã
tìm thấy sự có mặt của nhiều amino acid kiềm tính tại vị trí nhận biết của
protease. Đặc tính này cho phép HA được nhận biết và phân cắt bởi nhiều loại
protease có mặt ở nhiều loại tế bào khác nhau, dẫn đến sự mở rộng giới hạn
các mô có thể bị xâm nhiễm bởi virus [14,15].
* Kháng nguyên NA.
Cùng với HA, NA cũng là một kháng nguyên bề mặt vô cùng quan
trọng, có tính chất quyết định đến khả năng nhân lên của virus. Chức năng
chính của NA là phân cắt phân tử sialic acid (N-Acetyl neuramic acid), giải
phóng virus khỏi tế bào nhiễm [8,5].
17
NA phân giải thụ thể tế bào màng nhày đường hô hấp bằng cách cắt
đứt các liên kết glucosid giải phóng ra Neuramininic acid. Quá trình này cho
phép virus đi qua màng nhày và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu
của cơ thể vật chủ. NA cũng phá hủy các thụ thể dành cho HA trên bề mặt
của tế bào hồng cầu, mặc dù các tế bào không phải là đối tượng gây nhiễm.
Cùng với protease của tế bào chủ, NA tham gia tích cực vào quá trình phân
cắt phân tử HA và phân cắt mối liên kết giữa thụ thể tế bào với HA. Nếu
không có NA thì virus sẽ bị bất hoạt do gắn chặt vào thụ thể sialic acid của tế
bào chủ, không được giải phóng ra khỏi tế bào và dẫn tới mất khả năng gây
nhiễm tế bào. Vùng hoạt động của phân tử NA hoạt động ở đầu 5’ của phân
tử này. Đối với các chủng H5N1 độc lực cao, NA đã biến đổi rất nhiều qua